基于現(xiàn)行黃芪多糖生物活性檢測方法的分析

馬發(fā)順，蔡暢，梁秀麗，宋玉偉，元雪湞

（1.安陽工學院生物與食品工程學院，安陽 455000；2.河南省獸用生物制品研發(fā)與應用國際聯(lián)合實驗室，安陽455000；3.河南省獸藥飼料監(jiān)察所，鄭州 450000）

黃芪多糖（APS）是由豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根經(jīng)提取、濃縮、純化而成的水溶性雜多糖[1]，具有增強機體免疫功能、抗腫瘤、抗衰老、抗應激、護肝、抗病毒和較廣泛的抗菌作用[2-3]。關于黃芪多糖生物活性的報道主要有注射黃芪多糖觀察細胞超微結(jié)構的變化、黃芪多糖對免疫細胞的增殖作用和細胞因子分泌量的變化等[4-7]。而《中國獸藥典2015版（二部）》中規(guī)定的黃芪多糖生物活性檢測方法是以小白鼠為試驗動物，通過觀察脾指數(shù)的變化判斷黃芪多糖的生物活性，陳明志等[8]、丘成楨等[9]、黃志遠等[10]曾有過此方面報道，但沒有對現(xiàn)行黃芪多糖生物活性檢測方法的統(tǒng)計分析與評價。本研究基于我國獸藥典提供的黃芪多糖生物活性檢測方法，對檢測結(jié)果進行統(tǒng)計分析，從而對現(xiàn)行黃芪多糖生物活性檢測方法進行探討和評價，為黃芪多糖生物活性檢測方法的改進提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 試驗動物

昆明鼠（18～20 g，SPF級），購自河南省實驗動物中心。使用獨立送風隔離籠具飼養(yǎng)，設定溫度20℃～26℃，濕度40%～70%，供給足量飼料，自由采食和飲水。

1.1.2 儀器和藥品

電子天平（型號為ES3200），天津市德安特傳感技術有限公司生產(chǎn)；梅特勒分析天平（型號為AB204-N），上海雙旭電子有限公司生產(chǎn)；獨立送風隔離籠具（型號為IVC-Ⅱ），上?？禐獒t(yī)療科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)。黃芪多糖注射液（規(guī)格以C6H12O6計10 mL：0.1 g），河南省各獸藥生產(chǎn)廠提供；生理鹽水（規(guī)格為250 mL），購自河南科倫藥業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計

3種黃芪多糖樣品分別獨立試驗設計。每種樣品均設試驗組和對照組各8只小鼠，3次重復試驗；整個試驗共用小鼠144只。購買的試驗動物適應性喂養(yǎng)2 d后進入正試期，試驗組每只小鼠腹腔注射黃芪多糖注射液0.5 mL/d，對照組每只小鼠腹腔注射等量的生理鹽水；試驗期為7 d。

1.2.2 黃芪多糖生物活性質(zhì)量判定標準

最后1次注射黃芪多糖24 h后將小鼠頸椎脫臼處死稱取體重，摘取脾臟稱取脾臟重；計算每只小鼠的脾指數(shù)，脾指數(shù)=脾臟重（mg）/體重（g）；再分別計算試驗組和對照組的平均脾指數(shù)。3次重復中只要有1次試驗組與對照組的平均脾指數(shù)差值≥2，則可判定樣品合格；若平均脾指數(shù)差值＜2，則判定樣品不合格。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗組與對照組各項目間的差異顯著性分析采用t檢驗法；3次重復間的差異顯著性分析和3種樣品間的差異顯著性分析采用單因素方差分析法，多重比較使用SSR法。使用Excel 2010數(shù)據(jù)分析模塊進行描述統(tǒng)計，結(jié)果以“平均值±標準差”表示；使用DPS v 7.05軟件進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1各項目初步統(tǒng)計結(jié)果

3種樣品各項目的統(tǒng)計結(jié)果見表1。

表1 3種樣品3次重復各項目測定結(jié)果

從表1可以看出，試驗組體重小于對照組，樣品A和樣品B的3次重復中各有1次差異極顯著（P＜0.01），而樣品C差異不顯著（P＞0.05）。從脾重和脾指數(shù)2項試驗組與對照組的比較來看，樣品A 3次重復中有2次脾指數(shù)差異極顯著（P＜0.01），脾重有1次差異極顯著（P＜0.01）；樣品B有1次脾指數(shù)差異顯著（P＜0.05），脾重差異不顯著（P＞0.05）；樣品C脾指數(shù)差異不顯著（P＞0.05），但有1次脾重差異顯著（P＜0.05）。

從試驗組與對照組脾指數(shù)的差值大小作判斷，3種樣品3次重復中各有1次差值大于2，所以可判定3種黃芪多糖樣品均合格。

2.2試驗組3次重復間的比較

試驗組各項目3次重復間方差分析結(jié)果表明，樣品A在體重間和脾重間差異均不顯著（P＞0.05），脾指數(shù)間差異顯著（P＜0.05）；樣品B在體重間和脾指數(shù)間差異均不顯著（P＞0.05），脾重間差異顯著（P＜0.05）；樣品C在體重間、脾重間和脾指數(shù)間均差異不顯著（P＞0.05）。差異顯著項多重比較結(jié)果見表2。

表2 各項目3次重復間的比較

由表2可知，樣品A脾指數(shù)重復A1與重復A2間差異極顯著（P＜0.01），重復A2與重復A3間差異顯著（P＜0.05），重復A1與重復A3間差異不顯著（P＞0.05）；樣品B脾重重復B1與重復B2、B3間均差異顯著（P＜0.05），重復B2與重復B3間差異不顯著（P＞0.05）；其余各項目比較均差異不顯著（P＞0.05）。

2.3 3種樣品間的比較

3種樣品試驗組各項目方差分析結(jié)果顯示，體重間和脾指數(shù)間均差異極顯著（P＜0.01），脾重間差異顯著（P＜0.05）；對照組各項目方差分析結(jié)果顯示，體重間、脾重間和脾指數(shù)間均差異極顯著（P＜0.01）；各項目的多重比較情況見表3。

表3 各項目3種樣品間的比較

從表3可見，試驗組體重樣品A、C與樣品B間差異極顯著（P＜0.01），樣品A與樣品C間差異不顯著（P＞0.05）；脾重樣品A與樣品B、C間差異顯著（P＜0.05），樣品B與樣品C間差異不顯著（P＞0.05）；脾指數(shù)樣品A與樣品B、C間的差異極顯著（P＜0.01），樣品B與樣品C間差異不顯著（P＞0.05）。3個對照組間各項目的多重比較也存在極顯著差異（P＜0.01）和顯著差異（P＜0.05）的情況。

3 討論與結(jié)論

3.1從試驗組與對照組的比較來看，樣品A和樣品B脾指數(shù)均差異極顯著（P＜0.01），樣品C脾重差異顯著（P＜0.05），差異顯著性檢驗結(jié)果基本支持黃芪多糖生物活性檢測結(jié)果，說明黃芪多糖具有促進小鼠脾臟生長的作用，這與元雪湞等[11]的

研究結(jié)論一致；而試驗組體重均小于對照組，此表現(xiàn)也與元雪湞等[11]報道的結(jié)果一致。可見，本試驗結(jié)果可以對現(xiàn)行黃芪多糖生物活性檢測方法的可行性提供支持，但不能作為黃芪多糖促進動物生長的證據(jù)。試驗組小鼠體重小于對照組的可能原因，一是預試期較短小鼠對注射黃芪多糖會有應激反應；二是試驗期較短，黃芪多糖的促生長作用還沒有充分發(fā)揮出來；三是其他因素造成隨機誤差的影響等。

3.2從3次重復間的比較來看，只有樣品A的脾指數(shù)間存在極顯著差異（P＜0.01）、樣品B的脾重間存在顯著差異（P＜0.05），其余各項均差異不顯著（P＞0.05）。說明試驗組小鼠一方面長勢均衡，試驗控制良好；另一方面由于性別、年齡和初始體重等因素使小鼠對黃芪多糖的反應存在個體差異，這也是誤差的重要來源。而本試驗進行3次重復正可以降低試驗誤差，提高黃芪多糖生物活性檢測的可靠性。

3.3從3種樣品間各項目的比較來看，試驗組體重間和脾指數(shù)間均存在極顯著差異（P＜0.01），脾重間存在顯著差異（P＜0.05），說明盡管3種樣品檢測結(jié)果均為合格，但是3種樣品的生物學效價有所不同。這種差異可從小鼠體重、脾重及脾指數(shù)上反應出來，在3次重復間比較時，9項中只有2項差異達到顯著水平，而在3種樣品間比較時，試驗組3個項目全部達到顯著水平。3種樣品間存在較大差異性的原因可能是3種樣品來自不同的獸藥生產(chǎn)廠家，其生產(chǎn)原料、生產(chǎn)條件和生產(chǎn)工藝等不同所造成。3個對照組各項目的差異性可能與購買小鼠批次不同、試驗時間不同有關，除了試驗誤差之外不排除有系統(tǒng)誤差的影響。

3.4現(xiàn)行黃芪多糖生物活性檢測是按照《中國獸藥典2015版（二部）》載明的方法進行的，但藥典上提供的方法只是原則性描述，并沒有具體的試驗設計及誤差控制辦法。在實際檢測中為了控制試驗誤差，陳明志等[8]對試驗動物的初始體重和性別進行分層處理后再進行隨機分組，丘成楨等[9]通過延長預試期和用濾紙吸附脾臟表面血污后稱重，黃志遠等[18]從小鼠飼養(yǎng)管理方面排除誤差干擾，這些都是有益的探索。丘成楨等[9]認為若適應性喂養(yǎng)時間過短小鼠處于應激狀態(tài)，會影響機體對黃芪多糖的反應，但適應性喂養(yǎng)時間過長可能導致小鼠對黃芪多糖的敏感性下降。關于試驗誤差控制問題有待進一步研究。