熒光PCR熔解曲線法在非結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定中的應(yīng)用價(jià)值

李愛(ài)芳 談小文 崔曉利 康磊 黨麗云 張耀輝 楊翰

非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacteria，NTM)是指除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群及麻風(fēng)分枝桿菌以外的分枝桿菌總稱[1]。NTM感染?？梢鸱尾考膊?，且NTM肺病的臨床癥狀有與結(jié)核病相似的全身中毒癥狀和局部損傷表現(xiàn)，因而容易造成誤診而耽誤治療。由于大部分NTM對(duì)常用抗結(jié)核藥物普遍具有耐藥性，且不同NTM對(duì)藥物的敏感性也不相同，NTM肺病患者在全世界范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，已成為威脅人類健康的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題[2-3]。因此，臨床上對(duì)分枝桿菌的快速鑒定意義重大。

隨著實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)的不斷進(jìn)步，越來(lái)越多的分子生物學(xué)方法應(yīng)用于分枝桿菌快速鑒定，如DNA探針雜交、DNA測(cè)序、基因芯片技術(shù)等[4-7]。目前，國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室主要采用傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)分類方法進(jìn)行菌種鑒定，但這種方法操作繁雜、費(fèi)時(shí)，不適用于臨床快速診斷。近年來(lái)，基因芯片法因其多樣品、高通量等優(yōu)點(diǎn)逐漸成為臨床最常用的菌種鑒定方法；而16S rRNA基因測(cè)序法鑒定NTM快速準(zhǔn)確，是鑒定分枝桿菌比較權(quán)威的方法[8]。熒光PCR熔解曲線法是一種簡(jiǎn)單、快速用于菌種鑒定的分子生物學(xué)方法，該方法根據(jù)不同分枝桿菌基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(intergenic transcribed spacer，ITS)片段的特異序列設(shè)計(jì)探針，采用特定的熒光通道和熔點(diǎn)進(jìn)行分枝桿菌鑒別。熒光PCR熔解曲線法使用熒光PCR儀及配套軟件即可進(jìn)行檢測(cè)和結(jié)果分析，與16S rRNA基因測(cè)序法相比，對(duì)儀器和實(shí)驗(yàn)人員技術(shù)要求更低，價(jià)格也更便宜，適宜臨床常規(guī)開(kāi)展。本研究采用熒光PCR熔解曲線法、基因芯片法及16S rRNA基因測(cè)序法進(jìn)行分枝桿菌菌種鑒定，評(píng)價(jià)熒光PCR熔解曲線法的檢測(cè)效能。

材料和方法

一、 一般資料

收集西安市胸科醫(yī)院2020年4—10月經(jīng)BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)陽(yáng)性、MPB64快速抗原檢測(cè)陰性的疑似NTM臨床分離株，共71株(例)，每株(例)臨床分離株采用同一標(biāo)本分別進(jìn)行熒光PCR熔解曲線法、基因芯片法及16S rRNA基因測(cè)序法進(jìn)行菌種鑒定。

二、 研究方法

1. 主要儀器與試劑：Lad-Aid 824s核酸提取儀、SLAN系列實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)、Lad-Aid 824結(jié)核分枝桿菌核酸提取Maxi試劑、分枝桿菌鑒定試劑盒(購(gòu)自廈門致善生物科技有限公司)、芯片雜交儀、SlideWasherTM8 型芯片洗滌儀和微陣列芯片掃描儀(購(gòu)自北京博奧生物科技有限公司)、晶芯?分枝桿菌菌種鑒定試劑盒(DNA微陣列芯片法，購(gòu)自北京博奧生物科技有限公司)。

2. 核酸提?。号囵B(yǎng)后的菌液按照Lad-Aid 824結(jié)核分枝桿菌核酸提取Maxi試劑盒說(shuō)明書提取核酸。模板保存于-20 ℃，避免反復(fù)凍融。

3. 熒光PCR熔解曲線法菌種鑒定：按試劑說(shuō)明書進(jìn)行操作。打開(kāi)原裝的分枝桿菌PCR反應(yīng)管管蓋并丟棄，用微量加樣槍向每支PCR薄壁反應(yīng)管中加入25 μl 相應(yīng)的提取樣本(模板)或陰性/陽(yáng)性對(duì)照品，之后立即蓋嚴(yán)待用的透明PCR八連管管蓋。漩渦振蕩混勻20 s，瞬時(shí)離心數(shù)秒，除去氣泡。進(jìn)行PCR擴(kuò)增和熔解曲線分析。

4. 基因芯片法菌種鑒定：按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，分裝試劑每管18 μl，分別加入2 μl 核酸樣本，漩渦振蕩混勻，瞬時(shí)離心數(shù)秒，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物以95 ℃變性5 min，立即置于冰中淬火3 min 以上，得到單鏈核酸。雜交緩沖液通過(guò)50 ℃溫浴，以每管9 μl分裝至八連管中，加入6 μl單鏈核酸，混勻，加樣至芯片孔內(nèi)。放入芯片雜交儀進(jìn)行雜交、洗滌、甩干，然后進(jìn)行掃描，結(jié)果判讀。

5. 16S rRNA基因測(cè)序法：將提取的核酸作為DNA模板，送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行16S rRNA 基因測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果提交NCBI網(wǎng)站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行同源性比較。依據(jù)鑒定菌種的DNA序列與參照菌種的同源性≥97%來(lái)確定菌種。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以16S rRNA基因測(cè)序法為參考標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算熒光PCR熔解曲線法菌種鑒定的敏感度、特異度及符合率，并進(jìn)行一致性分析(Kappa檢驗(yàn))。Kappa值<0.2為一致性較差，0.2～0.4為一致性一般，0.41～0.60為一致性中等，0.61～0.80為基本一致，0.81～1.00為幾乎完全一致。

結(jié) 果

一、3種方法菌種鑒定結(jié)果分析

71株疑似NTM菌株經(jīng)熒光PCR熔解曲線法、基因芯片法及16S rRNA基因測(cè)序法鑒定為結(jié)核分枝桿菌4株，NTM 67株，NTM具體分類見(jiàn)表1。

表1 不同非結(jié)核分枝桿菌通過(guò)3種方法鑒定的結(jié)果

二、熒光PCR熔解曲線法菌種鑒定臨床應(yīng)用價(jià)值

以 16S rRNA基因測(cè)序法為標(biāo)準(zhǔn)，熒光PCR熔解曲線法檢測(cè)龜/膿腫分枝桿菌的敏感度、特異度和符合率分別為100.0%(24/24)、97.7%(42/43)和98.5%(66/67)，檢測(cè)胞內(nèi)分枝桿菌的敏感度、特異度和符合率分別為94.4%(17/18)、100.0%(49/49)和98.5%(66/67)，檢測(cè)戈登分枝桿菌的敏感度、特異度和符合率分別為5/5、98.4%(61/62)和98.5%(66/67)，檢測(cè)堪薩斯分枝桿菌、偶然分枝桿菌、緩黃分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、鳥分枝桿菌的敏感度、特異度和符合率均為100.0%，檢測(cè)河床(蜂房)分枝桿菌的敏感度、特異度和符合率分別為0(0/1)、100.0%(66/66)和98.5%(66/67)。見(jiàn)表2。

表2 以 16S rRNA基因測(cè)序法為標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)熒光PCR熔解曲線法對(duì)非結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定的價(jià)值

三、不一致結(jié)果分析

有11株NTM菌株3種方法檢測(cè)結(jié)果不一致。以16S rRNA基因測(cè)序法為標(biāo)準(zhǔn)，熒光PCR熔解曲線法鑒定結(jié)果與16S rRNA基因測(cè)序法結(jié)果有2株不同，1株將胞內(nèi)分枝桿菌鑒定為龜/膿腫分枝桿菌，1株將河床(蜂房)分枝桿菌鑒定為戈登分枝桿菌，一致率達(dá)97.0%(65/67)；基因芯片法鑒定結(jié)果11株與16S rRNA基因測(cè)序法不同，1株將胞內(nèi)分枝桿菌鑒定為鳥分枝桿菌，1株將胞內(nèi)分枝桿菌鑒定為其他分枝桿菌，2株將瘰疬分枝桿菌鑒定為堪薩斯分枝桿菌，2株將戈登分枝桿菌鑒定為堪薩斯分枝桿菌，1株將河床(蜂房)分枝桿菌鑒定為恥垢分枝桿菌，1株將膿腫分枝桿菌鑒定為胞內(nèi)分枝桿菌，1株將緩黃分枝桿菌鑒定為其他分枝桿菌，2株將其他分枝桿菌分別鑒定為鳥分枝桿菌和土分枝桿菌，一致率為83.6%(56/67)。

討 論

目前，NTM菌種類型約有190余種，其中約1/3與人類疾病有關(guān)[9]。目前，NTM肺病在全世界范圍內(nèi)都有明顯上升的趨勢(shì)[10-12]。NTM與結(jié)核分枝桿菌形態(tài)相似，人類感染后臨床癥狀、病理改變等都很相似，臨床上難以區(qū)分，易造成誤診[13]。且由于NTM對(duì)大部分抗結(jié)核藥物耐藥，常常會(huì)延誤NTM肺病患者的治療而造成不良后果。因此，快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)并鑒定NTM，對(duì)于患者早期接受準(zhǔn)確治療意義重大。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在檢出的NTM菌株中，龜/膿腫分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌占比最高。這與劉東鑫等[14]關(guān)于廣州市NTM分離株鑒定結(jié)果較為一致。不足的是戈登分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、偶然分枝桿菌、緩黃分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、鳥分枝桿菌、河床(蜂房)分枝桿菌、土分枝桿菌及恥垢分枝桿菌等檢出數(shù)量較低，但其占所有檢出NTM的比例與包訓(xùn)迪等[15]、林建等[6]關(guān)于安徽省和福建省NTM分離株菌種分布結(jié)果較為一致，均占比較低。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)于臨床常見(jiàn)的多種NTM，如龜/膿腫分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、戈登分枝桿菌，熒光PCR熔解曲線法檢測(cè)具有較高的敏感度和特異度，均大于94%；對(duì)于臨床分離率較低的堪薩斯分枝桿菌、偶然分枝桿菌、緩黃分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、鳥分枝桿菌檢測(cè)的敏感度、特異度和符合率均為100.0%，能夠滿足臨床快速準(zhǔn)確檢測(cè)的需求。不足的是，熒光PCR熔解曲線法僅能識(shí)別19種分枝桿菌，對(duì)于臨床上較為罕見(jiàn)的NTM，以及試劑盒檢測(cè)范圍外的其他分枝桿菌檢測(cè)結(jié)果可能存在一定差異，需要采用16S rRNA基因測(cè)序法進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。

本研究通過(guò)比較熒光PCR熔解曲線法、基因芯片法和16S rRNA基因測(cè)序法進(jìn)行菌種鑒定的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)熒光PCR熔解曲線法與16S rRNA基因測(cè)序法一致率較高，達(dá)97.0%，而實(shí)驗(yàn)室目前常用的基因芯片法與16S rRNA基因測(cè)序法一致率為83.6%，熒光PCR熔解曲線法菌種鑒定的一致率高于基因芯片法。這可能與兩種方法的檢測(cè)原理和敏感度有一定關(guān)系?；蛐酒ňN鑒定是將序列已知的寡聚核苷酸探針?lè)肿庸潭ㄓ谛酒缓笈c待測(cè)標(biāo)本中標(biāo)記的核酸進(jìn)行分子雜交，通過(guò)檢測(cè)每個(gè)探針?lè)肿拥碾s交信號(hào)強(qiáng)度，對(duì)17種臨床常見(jiàn)分枝桿菌進(jìn)行快速鑒定[9]。熒光PCR熔解曲線法菌種鑒定根據(jù)不同分枝桿菌基因ITS片段的特異序列設(shè)計(jì)探針，采用特定的熒光通道和熔點(diǎn)進(jìn)行分枝桿菌鑒別，可以檢測(cè)臨床和環(huán)境中常見(jiàn)的19 種分枝桿菌[16]。實(shí)際工作中我們還發(fā)現(xiàn)，基因芯片法菌種鑒定對(duì)樣本核酸濃度要求較高，核酸濃度太高時(shí)背景熒光信號(hào)過(guò)強(qiáng)，不利于結(jié)果判讀，核酸濃度太低時(shí)熒光信號(hào)過(guò)弱，易判讀為無(wú)分枝桿菌。

本研究所使用的分枝桿菌鑒定試劑盒(熒光PCR熔解曲線法)適用于臨床和環(huán)境中常見(jiàn)的19種分枝桿菌的定性鑒定，包括結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、恥垢分枝桿菌、牛分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、龜分枝桿菌、猿猴分枝桿菌、緩黃分枝桿菌、戈登分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、偶然分枝桿菌、海分枝桿菌或潰瘍分枝桿菌、土地分枝桿菌、不產(chǎn)色分枝桿菌、蘇加分枝桿菌、馬爾摩分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌和鳥分枝桿菌。熒光PCR熔解曲線法進(jìn)行菌種鑒定需要試劑配制、核酸提取、PCR擴(kuò)增及熔解曲線分析3個(gè)步驟，而目前臨床上常用的基因芯片法菌種鑒定需要試劑配制、核酸提取、PCR擴(kuò)增、芯片雜交及掃描分析4個(gè)步驟，比熒光PCR熔解曲線法多了芯片雜交及掃描分析這一步驟，而這一步驟至少耗時(shí)3 h；熒光PCR熔解曲線法相比于基因芯片法使用儀器更少，占用實(shí)驗(yàn)室資源更少(基因芯片法芯片雜交需在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室四區(qū)進(jìn)行)，實(shí)驗(yàn)成本更低；16S rRNA基因測(cè)序法雖然是基于核酸序列的鑒定方法中最直接可靠的方法，但由于其對(duì)技術(shù)和儀器要求較高，費(fèi)用也更昂貴，不適用于臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)開(kāi)展。因此，熒光PCR熔解曲線法菌種鑒定更加快速和便捷，應(yīng)用范圍更廣，尤其對(duì)于基層實(shí)驗(yàn)室條件較差、人員不足的情況更能滿足實(shí)驗(yàn)需求。

綜上所述，熒光PCR熔解曲線法菌種鑒定與16S rRNA基因測(cè)序法具有較高的一致性，能夠用于分枝桿菌菌種的快速鑒定。該方法簡(jiǎn)單、快速、高效，對(duì)結(jié)核病及NTM肺病的診斷具有重要的參考意義。

本研究還存在一定的局限性：(1)本研究的菌株均來(lái)自于西安市胸科醫(yī)院，未對(duì)陜西省其他醫(yī)院的菌株進(jìn)行分析，標(biāo)本來(lái)源較為局限。(2)本研究收集的NTM臨床分離株數(shù)量較少，且未收集統(tǒng)計(jì)其對(duì)應(yīng)的患者信息，無(wú)法進(jìn)行深入分析患者NTM感染情況，仍需收集更多資料進(jìn)行進(jìn)一步研究。(3)熒光PCR熔解曲線法僅能識(shí)別19種分枝桿菌，對(duì)于超出試劑盒識(shí)別范圍的菌種需進(jìn)行16S rRNA基因測(cè)序法進(jìn)一步驗(yàn)證。未來(lái)筆者將積累更多的NTM臨床分離株進(jìn)行鑒定，收集其相關(guān)臨床資料并進(jìn)行藥物敏感性分析，以便為NTM肺病的早期診斷和治療提供依據(jù)。