大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)tlr3基因的鑒定及其在病原感染前后的表達

王羽，李新雨，王敏，傅強，宋琳,

(1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266109； 2. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院)

先天免疫系統(tǒng)是宿主對病原體感染的第一道防御線，特別是對生存在富含大量病原菌的水生環(huán)境中的硬骨魚類而言[1]，病原體附著和入侵的主要組織為皮膚、鰓和腸等黏膜組織，這些構(gòu)成了先天免疫的黏膜免疫系統(tǒng)，對水生動物防止病原菌感染尤為重要。先前研究認為，先天免疫系統(tǒng)識別病原菌及特異性受體是依賴一群被稱為病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)的分子，如鞭毛蛋白、脂多糖(LPS)、脂蛋白、肽聚糖(PGN)、脂磷壁酸(LTA)酵母聚糖、CpG-DNA、微生物核酸等，它們分布于細胞表面、胞內(nèi)區(qū)室或血液、組織液中，被種系編碼模式識別受體(pathogen recognition receptor，PRR)識別[2]。盡管包括多種抗菌肽、凝集素，各種病原體識別受體家族成員，如Toll樣受體、NOD樣受體(nod-like receptor，NLR)和RIG-I樣受體(RIG-like receptor，RLR)的黏膜免疫因子作為刺激物和感受器，已經(jīng)在先天免疫系統(tǒng)中得到廣泛研究，但人們對魚類黏膜免疫的了解仍然有局限性，尤其在疾病控制和預(yù)防檢測等方面。在各種病原體識別受體中，Toll樣受體是首個且為最有效地被表征和鑒定的檢測感染的先天免疫受體，稱為病原體相關(guān)分子模式識別受體，可直接或間接通過抗原呈遞細胞(antigen presenting cell, APC)檢測外源性致病微生物的含量，如脂多糖、肽聚糖、核酸、鞭毛蛋白等。因此，Toll樣受體在調(diào)配適當(dāng)?shù)倪m應(yīng)性免疫反應(yīng)中起著重要作用[3-4]。

目前，人們已經(jīng)在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)了大約13種Toll樣受體(人類的為TLR1—TLR10，小鼠的為TLR1—TLR9、TLR11—TLR13)，在其他動物中也發(fā)現(xiàn)了幾種Toll樣受體，如在低等脊椎動物中鑒定出的TLR14、TLR23[5]、TLR15[6]、TLR18—TLR20[7]、TLR21—TLR22[8]、TLR24[9]。脊椎動物TLR可分為6個主要家族：TLR1(TLR1、TLR2、TLR6、TLR10、TLR14)，TLR3，TLR4，TLR5，TLR7(TLR7、TLR8、TLR9)和TLR11(TLR11、TLR12、TLR13、TLR21、TLR22、TLR23)[5,10]。有研究表明，已經(jīng)在十幾種魚中鑒定出至少20種TLR基因(tlr1—tlr4、tlr5M、tlr5S、tlr7—tlr9、tlr13、tlr14、tlr18—tlr26)[11]。

TLR屬于I型跨膜蛋白，根據(jù)不同的一級結(jié)構(gòu)和識別配體，Toll樣受體被分成兩個主要亞族，分別為識別微生物脂質(zhì)、糖、蛋白質(zhì)組的細胞表面亞族和識別病毒或細菌來源的核苷酸衍生物核酸感應(yīng)亞族[12-14]。通常，TLR包含幾個結(jié)構(gòu)域：胞外N-末端富含亮氨酸重復(fù)序列(LRR_NT)、可變數(shù)目的富含亮氨酸重復(fù)序列(LRR)、胞內(nèi)C-末端LRR(LRR_CT)、跨膜結(jié)構(gòu)域和Toll/IL-1受體同源結(jié)構(gòu)域(TIR)。LRR結(jié)構(gòu)域的序列和數(shù)目的變化賦予TLR特異性。細胞質(zhì)TIR結(jié)構(gòu)域不僅在同一物種的不同TLR之間，而且在不同動物物種之間高度保守[15-16]，并且參與信號傳導(dǎo)以及TLR的定位[17-18]。與胞內(nèi)TIR結(jié)構(gòu)域相反，胞外LRR結(jié)構(gòu)域參與病原體識別[15]。迄今為止，TLR信號通路已被充分研究，包括髓樣分化因子(myeloid differentiation primary response protein 88, MyD88)依賴性和MyD88非依賴性[含TIR結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白誘導(dǎo)的IFN-β,也稱TICAM-1(TIR domain-containing adaptor inducing IFN-beta，TRIF)依賴性]途徑[19]。

最近，因為與其他脊椎動物TLR基因序列有相似性，具有特殊功能的tlr3在多種硬骨魚中被識別，如斑馬魚(Daniorerio)[7]、青鳉(Oryziaslatipes)[20]、半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)[21]、牙鲆(Paralichthysolivaceus)[22]和斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)[11]。TLR3能識別來自病毒的雙鏈RNA(dsRNA)[23]。當(dāng)硬骨魚被注射刺激物dsRNA同系物聚肌苷酸胞苷酸polyI:C、RNA病毒、革蘭氏陰性菌Edwardsiellatarda和Edwardsiellaictaluri之后，tlr3是上調(diào)表達的；當(dāng)被注射刺激物草魚呼腸孤病毒GCRV、革蘭氏陰性菌Yersiniaruckeri和E.ictaluri之后，tlr3是下調(diào)表達的[24-26]。在斑馬魚中注射革蘭氏陽性菌Mycobacteriummarinum之后，tlr3表達量沒有明顯變化[7]。另外，功能性研究表明，用polyI:C刺激河豚體外細胞，河豚Tlr3可誘導(dǎo)IFN-β表達[27]。

大菱鲆是中國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中一個重要海水養(yǎng)殖品種，很容易受到各種病原體的侵襲，包括愛德華氏菌、海豚鏈球菌，以及各種弧菌，如鰻弧菌和溶藻弧菌。在大菱鲆養(yǎng)殖場中，這些病原體感染會導(dǎo)致疾病的爆發(fā)，可造成巨大的經(jīng)濟損失。目前已有許多研究致力于識別大菱鲆的免疫功能，表征其在先天免疫應(yīng)答中的機制，闡明其在抵御病原菌附著過程中的宿主免疫應(yīng)答反應(yīng)機理，許多免疫蛋白已在大菱鲆中被識別和分析，如Tlr2[28]、肽聚糖識別蛋白(Pgpr2)[29]、Myd88[30]、干擾素調(diào)節(jié)因子5(Irf-5)[31]、熱激蛋白70(Hsp70)[32]和G型溶菌酶[33]。

許多研究已經(jīng)闡明感染過程中的基因活性，但控制大菱鲆抵抗病原體的具體機制仍然不明確，而對大菱鲆TLR成員的綜合調(diào)查研究有助于了解識別感染的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。tlr3的直系同源基因在幾種魚中已經(jīng)被識別，但是大菱鲆tlr3基因依然沒有被鑒定。因此，本文通過檢索RNA-seq轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫捕獲tlr3基因序列[34]，探究tlr3在健康組織、經(jīng)革蘭氏陰性菌鰻弧菌或革蘭氏陽性菌海豚鏈球菌感染后的表達模式。

1 材料和方法

1.1 序列鑒定和分析

在作者所在團隊構(gòu)建的大菱鲆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中[34]，以來自哺乳動物和魚類的TLR3序列作為查詢序列查找Toll樣受體基因的全長序列，期望值(E值)截點為1e-10，用常規(guī)測序鑒定該識別序列，使用數(shù)據(jù)庫NCBI ORF Finder[35]來預(yù)測所檢索序列的可讀框(open reading frame，ORF)。在非冗余蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫下，用BLASTP工具[36]進一步驗證從ORF中預(yù)測到的氨基酸序列。用簡單模塊化結(jié)構(gòu)研究工具SMART[37]鑒定該序列的保守區(qū)和信號肽，使用SignalP 4.1網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器[38]，并設(shè)置參數(shù)：物種選擇真核“eukaryotes”，默認D值截點(default D-cutoff value)，跨膜信號肽類型為“SignalP-TM”，進一步分析信號肽序列。利用TMHMM Server v2.0服務(wù)器[39]預(yù)測氨基酸序列tlr3的結(jié)構(gòu)域，使用ExPASy服務(wù)器[40]分析大菱鲆Tlr3的理論等電點pI、相對分子質(zhì)量和N-糖基化位點。最后使用MatGAT程序計算不同物種中Tlr3氨基酸的相似性和同一性的百分比[41]。

1.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

挑選出大菱鲆，以及包括人(Homosapiens)、鼠(Musmusculus)、雞(Gallusgallus)、蛙(Xenopuslaevis)、斑馬魚(Daniorerio)、青鳉(Oryziaslatipes)、半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)和斑點叉尾鮰在內(nèi)的其他物種Tlr3的氨基酸和DNA序列來構(gòu)建進化樹[42]，用ClustalW2程序進行多重蛋白質(zhì)序列比對，用分子進化遺傳學(xué)分析軟件MEGA6中的鄰接法進行系統(tǒng)發(fā)育與分子進化分析[43]，用泊松定理選項進行數(shù)據(jù)分析，并用完全刪除選項移除差異。設(shè)置1 000次重復(fù)，用以評估進化樹的拓撲穩(wěn)定性。

1.3 細菌感染和樣品收集

從大菱鲆孵化場(中國山東海陽市)獲得大菱鲆苗種，苗種平均體質(zhì)量15.6 g，平均體長5.5 cm。試驗前，將所有的魚放在實驗室溢流法養(yǎng)殖系統(tǒng)中至少暫養(yǎng)1周，使其適應(yīng)環(huán)境。暫養(yǎng)水溫控制在(27±0.5)℃，大菱鲆隨機分成4組暫養(yǎng)在4個60 L水槽中，每個水槽暫養(yǎng)30尾，恒定通風(fēng)，并保持12 h—12 h的光照—黑暗周期節(jié)奏。在感染試驗期間不飼喂。選擇革蘭氏陰性菌鰻弧菌(Vibrioanguillarum)和革蘭氏陽性菌海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)作為感染菌種，用以展現(xiàn)宿主在防御病原菌感染時TLR基因的免疫作用。兩種菌的細菌分離株均由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)魚類免疫實驗室提供。在預(yù)感染之后，按標(biāo)準(zhǔn)流程從單一有癥狀的魚上重新分離出病原菌，并在培養(yǎng)之前進行生化鑒定，將該病原菌接種到盧里亞-貝爾塔尼培養(yǎng)基(Luria-Bertani medium，LB培養(yǎng)基)，在振蕩培養(yǎng)箱中(180 r/min，28 ℃)過夜培養(yǎng)。

試驗過程中，將魚浸泡在細菌溶液(約27 ℃)中2 h，然后放回池中，并進行行為觀察和樣品收集。對照組單獨浸泡在滅菌培養(yǎng)基中，并進行相同處理。使用200 mg/L的三卡因甲基磺酸鹽(MS-222)將魚麻醉，緩沖液為碳酸氫鈉溶液。在振蕩培養(yǎng)箱(180 r/min，28 ℃)中過夜孵育后，將處理組分別浸泡在終濃度為5×107CFU/mL的鰻弧菌和終濃度為5×106CFU/mL的海豚鏈球菌水體中2 h。在鰻弧菌感染后2 h、6 h、12 h、24 h，在海豚鏈球菌感染后2 h、4 h、8 h、12 h的時間點，從15條魚(養(yǎng)魚池隨機分成3個，從每個養(yǎng)魚池中取5條魚)中收集黏膜組織(腸、皮膚和鰓)。將收集的樣品在液氮中速凍，然后保存于-80 ℃的超低溫冰箱中，以備后續(xù)的RNA提取試驗。

1.4 總RNA提取

RNA提取之前，在液氮中用研缽與研杵將樣品磨成粉末。按Trizol?Reagent試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)說明書提取總RNA，并按說明書用不含核糖核酸酶(ribonuclease，RNase)的DNA酶(Promega)處理。用微量分光光度計Nanodrop 2000(Thermo Electron North America LLC, FL)測出每個樣品RNA的質(zhì)量與濃度。所有提取樣品在260 nm和280 nm的吸收度比值A(chǔ)260/A280均大于1.8，并稀釋樣品至250 ng/μL，最后在瓊脂糖凝膠上顯現(xiàn)RNA樣品的完整性。

1.5 實時熒光定量PCR分析

用實時熒光定量PCR反應(yīng)(qPCR)測定tlr3的mRNA轉(zhuǎn)錄本在對照和處理組的大菱鲆不同組織中的表達情況。根據(jù)大菱鲆TLRs基因轉(zhuǎn)錄本，用Primer3軟件設(shè)計基因特定引物。以大菱鲆的18SrRNA基因作為參照基因，用以標(biāo)準(zhǔn)化同一樣品中基因表達水平，并列于表1中。根據(jù)產(chǎn)品說明書，利用PrimeScript RT試劑盒(Perfect Real Time，TaKaRa Bio Inc.)合成單鏈互補DNA(cDNA)，每10 μL反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系需要500 ng RNA。使用如下的標(biāo)準(zhǔn)循環(huán)程序在CFX96實時PCR檢測系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)上進行反應(yīng)：熱循環(huán)曲線，變性，95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s進行40個循環(huán)，58 ℃ 5 s；解離曲線，65 ℃ 5 s；以0.1 ℃/s的速度增溫到95 ℃來檢測擴增的特定性。該反應(yīng)共含有200 ng/μL cDNA 1.0 μL，5 μmol/L的正向和反向引物各1.0 μL，5.0 μL SYBR Green supermix試劑，2.0 μL無核酸酶的水。對代表性的聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)產(chǎn)物進行測序以確認基因擴增的特異性和正確性。

表1 用于實時熒光定量PCR分析的引物

對大菱鲆健康組織的基因表達模式，用肌肉組織的閾值循環(huán)數(shù)(Ct值)作為對照，其他組織作為處理組。將對照組和處理組的mRNA表達水平標(biāo)準(zhǔn)化到同一樣本的18SrRNA基因的表達水平。試驗重復(fù)3次，進行基因表達分析，用文獻[44]的軟件Relative Expression Software Tool (REST)分析結(jié)果來捕獲P<0.05的顯著性表達。

分析每個時間點、所有板上(包括不含核酸酶的水的對照組)來自健康和感染組織的3個RNA樣品的三重RNA樣本基因表達。用REST程序分析結(jié)果來捕獲P<0.05的顯著性表達[39]。

2 試驗結(jié)果

2.1 大菱鲆tlr3基因的鑒定

用從其他魚類物種中獲得的TLR序列作為查詢序列搜索大菱鲆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫之后，Tlr3的氨基酸序列可被鑒定并測序。序列號為KX216854的tlr3與先前鑒定出的大菱鲆tlr3[45]相同，其轉(zhuǎn)錄物具有3 592 bp的核苷酸，含有編碼926個氨基酸的2 781 bp ORF。此外，多腺苷酸化信號序列ATAAAA在tlr3基因的下游。推測Tlr3蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為103.97 kD，理論pI=8.89，磷酸化位點具有11個絲氨酸和2個蘇氨酸，推測N-糖基化位點具有9個天冬酰胺。推定的大菱鲆Tlr3蛋白含有包含N-末端區(qū)域的前29個氨基酸殘基的信號肽序列D值(兩個序列間每個位點氨基酸替代總數(shù))截點為0.450，網(wǎng)絡(luò)Networks為SignalP-noTM，表明少于4個位置被預(yù)測為處于跨膜狀態(tài)。預(yù)測Tlr3氨基酸有幾個重要結(jié)構(gòu)特征，包括13個LRR結(jié)構(gòu)域、LRR_CT結(jié)構(gòu)域和145個氨基酸的TIR結(jié)構(gòu)域(圖1)。大菱鲆Tlr3與牙鲆的同源性最高，達到82%，其次是半滑舌鰨的，可達74.1%，與其他魚類的同源性在52%～60%之間，與人的同一性為52.6%(表2)。大菱鲆tlr3基因與牙鲆基因最相似，具有88.2%的同一性和78.2%的相似性。與ORF整體相比，TIR結(jié)構(gòu)域之間的氨基酸序列同一性和相似性高4%～10%，在大菱鲆和牙鲆之間具有最高同一性(92.4%)和相似性(82.8%)(表2)。

LRR，富含亮氨酸重復(fù)序列；LRR_CT，富含亮氨酸重復(fù)序列C-末端結(jié)構(gòu)域；TIR，Toll/IL-1受體同源結(jié)構(gòu)域；LRR_NT，富含亮氨酸重復(fù)序列N-末端結(jié)構(gòu)域；LRR TYP，富含亮氨酸的重復(fù)序列典型的(最密集的)亞科；，跨膜結(jié)構(gòu)域；，低組分復(fù)雜性段；，信號肽

表2 比較大菱鲆Tlr3與人類及其他硬骨魚氨基酸序列

2.2 進化分析

使用MEGA6軟件將大菱鲆和其他物種的TLR基因構(gòu)建進化樹(圖2)，以便于更進一步地對大菱鲆tlr3基因鑒定和進化關(guān)系驗證。系統(tǒng)發(fā)育分析進一步驗證本研究的假設(shè)：在同一分支內(nèi)，大菱鲆Tlr3與其他脊椎動物TLR3聚合在一起(圖1)。TLR3進一步分為兩個亞組，如圖2所示，第一亞組為魚類，第二亞組為高級脊椎動物。在第一亞組中，大菱鲆Tlr3與牙鲆Tlr3關(guān)系最近，完全相似匹配分?jǐn)?shù)為98%～100%，然后是半滑舌鰨，它們與其他直系同源分支的斑點叉尾鮰Tlr3和斑馬魚Tlr3形成這一亞組。第二個亞組包括人類和小鼠、雞和龜、蛙。

圖2 Toll樣受體TLR3的系統(tǒng)進化樹

進化樹分析與進化關(guān)系一致，并且所有的分支節(jié)點都有高的自展值。因此，進化分析顯示出與其他物種相應(yīng)基因明確的直系同源關(guān)系。除了先前的觀察，大菱鲆Tlr3與牙鲆基因關(guān)系更近，可以預(yù)測大菱鲆和牙鲆之間Tlr3的功能相似性。TLR3的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，大菱鲆的Tlr3與其對應(yīng)物可能在配體識別和對刺激的免疫應(yīng)答中具有類似的作用，在大菱鲆養(yǎng)殖中對促進大菱鲆穩(wěn)定發(fā)育具有不可替代的作用。

2.3 大菱鲆tlr3基因在基體組織中的分布

在包括血液、肝臟、脾臟、鰓、皮膚、腸、頭腎和腦在內(nèi)的8個大菱鲆健康組織中，用實時熒光定量PCR進行大菱鲆tlr3基因的組織分布分析(圖3)?？傮w而言，在所有檢測組織中大菱鲆tlr3均有表達，但表達水平不同。如圖3所示，tlr3基因在腸中的表達水平最高，隨后是血液、腦、頭腎、鰓、脾臟、皮膚，在肝臟中的表達水平最低。大菱鲆tlr3在體內(nèi)不同發(fā)育階段、體外不同水生環(huán)境下對刺激的黏膜免疫反應(yīng)的作用仍需要進一步研究來詳細闡明。

圖3 Toll樣受體基因tlr3在大菱鲆不同的健康組織中的基因表達分析

2.4 鰻弧菌感染后tlr3基因的表達圖譜

在不同病原菌感染后的黏膜組織中表征tlr3的表達模式，可以闡明tlr3基因在大菱鲆黏膜免疫中的作用，因此選取宿主與病菌相互作用的第一場所——黏膜組織(鰓、皮膚和腸)作為研究對象。在感染單一革蘭氏陰性菌鰻弧菌和單一革蘭氏陽性菌海豚鏈球菌之后，及時采集黏膜組織，這些采集時間點是細菌附著和入侵的關(guān)鍵時間。本文首次在黏膜組織中對病菌浸泡感染后的大菱鲆tlr3基因進行立體表達分析。

感染鰻弧菌后，大菱鲆tlr3在不同組織中顯示不同的表達模式(圖4)。在腸中，大菱鲆tlr3在感染后12 h上調(diào)53.5倍，24 h后上調(diào)99.10倍；在皮膚感染2 h、6 h和12 h后，大菱鲆tlr3的表達沒有出現(xiàn)明顯變化，直到感染24 h后，才上調(diào)2.4倍；在鰓中，大菱鲆tlr3的表達是散發(fā)性的，僅在感染后2 h(上調(diào)3.8倍)和24 h(上調(diào)7.8倍)檢測到誘導(dǎo)變化。

圖4 受鰻弧菌感染后大菱鲆黏膜組織中的tlr3表達的實時qPCR分析

2.5 海豚鏈球菌感染后TLR基因的表達圖譜

與鰻弧菌感染不同，海豚鏈球菌感染后，大菱鲆tlr3表現(xiàn)出明顯不同的表達模式。在腸中，大菱鲆tlr3的誘導(dǎo)最強，在所有采集時間點均表達上調(diào)，與鰻弧菌感染相似，且在感染后4 h達到峰值(約157.5倍)。與鰻弧菌感染的誘導(dǎo)不同，受海豚鏈球菌攻擊并感染2 h后，大菱鲆tlr3上調(diào)且表達更強、更早。在皮膚中，感染4 h后大菱鲆tlr3上調(diào)23.1倍，12 h時最高，為43.9倍。感染4 h、8 h和12 h后，在鰓中均發(fā)現(xiàn)類似于皮膚中的大菱鲆tlr3上調(diào)表達。但受海豚鏈球菌感染后，皮膚和鰓中誘導(dǎo)大菱鲆tlr3的表達倍數(shù)和時間與受鰻弧菌感染后的表達不同(圖5)。

圖5 受海豚鏈球菌感染后大菱鲆黏膜組織tlr3表達的實時qPCR分析

3 討論

本研究確定了在大菱鲆轉(zhuǎn)錄組中單個完整的tlr3基因，鑒別了其基因結(jié)構(gòu)、組織表達分布，并通過革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌攻毒誘導(dǎo)該基因表達。

3.1 TLR3的比較結(jié)構(gòu)域和功能

在哺乳動物中，已經(jīng)證明TLR3對雙鏈RNA的應(yīng)答作用[46-49]。首個被研究的具有三維結(jié)構(gòu)特征的TLR是人的TLR3[50-51]，小鼠TLR3是第一個與配體結(jié)合并與46 bp的dsRNA結(jié)合的核酸感應(yīng)結(jié)構(gòu)[52]。TLR3與TLR7、TLR8、TLR9類似，不是由位于表面或外/內(nèi)膜上的微生物組分誘導(dǎo)，而是受來自細菌或病毒的核酸誘導(dǎo)[53]。TLR3通過TRIF依賴的TLR受體信號通路激活誘導(dǎo)細胞因子IRF3和NF-κB，從而誘導(dǎo)I型干擾素及促炎細胞因子的產(chǎn)生[54]。在哺乳動物的有效抗病毒免疫中，TLR3不是必須存在的[55]，然而，在TLR3缺陷小鼠的脾臟中發(fā)現(xiàn)病毒載量增加了1 000倍[56]，人類的TLR3缺陷顯示與單純皰疹病毒的易感性有關(guān)[57]。在魚中，Tlr3主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中，并且負責(zé)識別相對短的dsRNA，從而在抗病毒免疫中發(fā)揮重要作用[58]。在大菱鲆中，Tlr3檢測主要分布在上皮細胞中，并且可以更多地識別配體而不是dsRNA[45]。在魚類中，已有多個證據(jù)表明，dsRNA病毒、polyI:C和細菌病原體可刺激Tlr3上調(diào)表達[59,63]。

使用ExPASy服務(wù)器可預(yù)測翻譯后修飾的不同數(shù)目的糖基化和磷酸化位點。本研究在大菱鲆Tlr3中預(yù)測了9個N-糖基化位點。在之前的研究中，發(fā)現(xiàn)了大菱鲆Tlr2的5個N-糖基化位點[28]。在人體中，有4個TLR2糖基化位點被預(yù)測，其中之一對分泌效果有顯著影響[64]。因此推測TLR3分子中的糖基化可能對受體表面表達、運輸、模式識別和突變有影響。預(yù)測的N-糖基化位點參與將組織蛋白酶轉(zhuǎn)運到溶酶體的過程，根據(jù)組織蛋白酶S的抗原呈遞作用，可以推測不同數(shù)量的N-糖基化位點可能與其免疫功能有關(guān)[65]。在不同物種中鑒定出的不同數(shù)目的N-糖基化位點也可以反映其在抵抗病原體入侵時的差異作用。

由于大菱鲆Tlr3的氨基酸序列更類似于牙鲆，對其進行了結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)比較(圖1)。LRR結(jié)構(gòu)域是富含疏水氨基酸亮氨酸的20～30個AA長序列的陣列[66]。Gong等[66]發(fā)現(xiàn)所有LRR序列都存在高度保守片段，具有共有序列LxxLxLxxN(Cx)xL，并且包含多種二級結(jié)構(gòu)的可變片段LxxLxxxxLxxLxL。此外還觀察到了其他類型的LRR，例如典型的T型(xxLxxxxLxxLxx)和細菌S型[xxLPx(x)LPxx][67]。這些符號中的字母L代表形成疏水核心的氨基酸，如亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸，N表示天冬酰胺、蘇氨酸、絲氨酸或半胱氨酸，x是任意氨基酸[66]。一般來說，盡管一些LRR的精確定位對于每個物種都是不同的，大菱鲆Tlr3的LRRs與在牙鲆和其他物種中鑒定的LRR分布相似(圖1)。不同的TLR在不同物種中的LRR數(shù)目存在差異，而在人類TLR3肽中達到18個(表2)。在數(shù)量上，LRR這種對病原體識別的變化賦予TLR參與宿主抵抗病原體感染的特異性[11]。

3.2 TLR3在細菌感染反應(yīng)中的表達

一般來說，不同的細菌感染后有不同的表達模式。盡管大菱鲆tlr3在海豚鏈球菌感染中的表達強度和時間比在鰻弧菌感染中更強、更早，但在腸道中是一致的,這也說明海豚鏈球菌在腸、皮膚和鰓中引起比鰻弧菌感染更急性的反應(yīng)。因此，大菱鲆tlr3在腸中以時間依賴性和細菌依賴性方式誘導(dǎo)。

研究發(fā)現(xiàn)，海豚鏈球菌的數(shù)量主要在腎臟和脾臟中增加，Nguyen等[68]在腸道、鰓、皮膚黏液和其他組織中也發(fā)現(xiàn)了大量的海豚鏈球菌。TLR3在人和小鼠的體外dsRNA(來自病毒)存在下發(fā)生上調(diào)表達[23]，但在體內(nèi)的功能作用仍然不清楚[55,69]。之前的研究表明，TLR3對于dsRNA病毒在體內(nèi)和體外用polyI:C刺激誘導(dǎo)具有應(yīng)答反應(yīng)[59,62]，這與受革蘭氏陰性細菌病原體Edwardsiellaictaluri感染時，斑點叉尾鮰和斑馬魚中tlr3mRNA上調(diào)具有一致的證據(jù)[59,63]，我們目前已發(fā)現(xiàn)，受革蘭氏陰性細菌鰻弧菌和革蘭氏陽性細菌海豚鏈球菌感染后，大菱鲆tlr3一般呈上調(diào)表達趨勢。對病原體感染的這種非特異性應(yīng)答需要進一步研究，以揭示特定的細菌配體識別和宿主與微生物之間的相互作用。

4 結(jié)論

本研究鑒定了大菱鲆中的tlr3基因，該基因是其他魚類和高級脊椎動物的直系同源基因，其基因結(jié)構(gòu)、氨基酸序列和預(yù)測的結(jié)構(gòu)域在物種間是保守的。本研究首次檢測了大菱鲆tlr3基因受不同細菌感染后在大菱鲆的黏膜組織中的表達模式。tlr3基因的黏膜表達說明tlr3在防止病原體附著和進入大菱鲆宿主防御系統(tǒng)中起到第一道防線的關(guān)鍵作用。之后應(yīng)進一步進行功能研究以更好地表征TLR及其家族基因，并確定不同黏膜組織在病原性不利環(huán)境中對硬骨魚類的保護作用。免疫組化技術(shù)有助于調(diào)查在受感染后不同時間點，細菌進入的位點和魚的感染過程。TLRs與先天免疫和適應(yīng)性免疫功能密切相關(guān)，在早期發(fā)育階段研究檢測其基因和蛋白質(zhì)的表達水平，不僅有助于辨別先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的關(guān)系，而且還能對病原致病機制有所探究。深入研究TLR和先天免疫反應(yīng)對健康發(fā)展大菱鲆育種計劃有深遠而重要的意義。