球囊菌侵染對(duì)意大利蜜蜂幼蟲(chóng)腸道免疫與解毒相關(guān)基因表達(dá)及蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和糖類含量的影響

候夢(mèng)賞, 趙必安, 邱園妹, 萬(wàn)昆林, 梁立強(qiáng), 李志國(guó), 蘇松坤

(福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院), 福州 350002)

白堊病是由球囊菌Ascosphaeraapis侵染蜜蜂幼蟲(chóng)引起的一種真菌性病害，蜜蜂幼蟲(chóng)食用被球囊菌孢子污染的食物后，球囊菌孢子在幼蟲(chóng)腸道內(nèi)萌發(fā)生長(zhǎng)，感染后期菌絲穿透腸壁，幼蟲(chóng)縮水形成子實(shí)體(Jensenetal., 2013)，導(dǎo)致蜂群幼蟲(chóng)大量死亡，群勢(shì)下降，嚴(yán)重影響蜂群的健康及農(nóng)牧業(yè)的生產(chǎn)(Evans and Schwarz, 2011)。白堊病最早在歐洲的蜂群中發(fā)現(xiàn)(Sam?iňákováetal., 1977)，20世紀(jì)70年代傳播到美洲大陸，導(dǎo)致大量蜂群滅亡(Hitchcock and Christensen, 1972)。20世紀(jì)90年代在我國(guó)浙江出現(xiàn)白堊病，隨后經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)地放蜂等活動(dòng)，迅速在國(guó)內(nèi)暴發(fā)，給我國(guó)的養(yǎng)蜂業(yè)造成了巨大損失(范正友，1996)。經(jīng)過(guò)科學(xué)的飼養(yǎng)管理、藥物治療等，蜜蜂白堊病得到了一定的抑制，然而近年來(lái)蜜蜂白堊病又有暴發(fā)的趨勢(shì)(Aizenetal., 2009)。

蜜蜂依靠物理化學(xué)屏障及先天免疫來(lái)抵御外來(lái)病菌的入侵，物理屏障主要是表皮與圍食膜的作用，化學(xué)屏障主要是蜜蜂表皮分泌的蠟質(zhì)和不飽和脂肪酸，具有一定的抗菌活性(Glinski and Jarosaz, 2001)，先天性免疫主要是細(xì)胞免疫與體液免疫，細(xì)胞免疫有吞噬作用，包囊和黑色素的形成；體液免疫有抗菌肽的分泌，黑色素化和病原體的酶促降解(Hultmark, 2003; Lemaitre and Hoffmann, 2007)。研究報(bào)道蜜蜂對(duì)外源性物質(zhì)的免疫應(yīng)答通過(guò)Toll, Imd, Jak/STAT與Jnk等相互關(guān)聯(lián)的通路誘導(dǎo)抗菌肽的表達(dá)(Lemaitre and Hoffmann, 2007)，蜜蜂主要抗菌肽包括Abaecin, Apidaecin, Defensin-1, Defensin-2和Hymenoptaecin 5種，不同的病菌侵染會(huì)激活不同免疫通路，導(dǎo)致特定的抗菌肽高表達(dá)(Evansetal., 2006)。

蜜蜂進(jìn)行免疫解毒反應(yīng)時(shí)需要消耗機(jī)體新陳代謝產(chǎn)生的能量，機(jī)體進(jìn)行其他的生命活動(dòng)也要消耗大量的能量(Moret and Schmid-Hempel, 2000)，并且真菌侵染之后，為了其子代的生長(zhǎng)繁殖也會(huì)與寄主競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，增加機(jī)體的生存壓力(Tsaousisetal., 2008)。糖類是昆蟲(chóng)生命活動(dòng)中重要的能源物質(zhì)和中間代謝產(chǎn)物，對(duì)機(jī)體的正常運(yùn)行有非常重要的作用；蛋白質(zhì)作為機(jī)體重要的生物大分子，結(jié)構(gòu)蛋白參與生物體的修補(bǔ)與更新，多肽與蛋白質(zhì)類激素等物質(zhì)參與個(gè)體的免疫、解毒、生長(zhǎng)發(fā)育等生物進(jìn)程；脂類物質(zhì)是生物體內(nèi)能量最高的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是蜜蜂蛹期呼吸重要物質(zhì)，不飽和脂肪酸也是機(jī)體生命活動(dòng)不可缺少的物質(zhì)(李慶章等, 2016)。各種營(yíng)養(yǎng)成分協(xié)同作用以維持機(jī)體正常的生命活動(dòng)。

前人研究大多關(guān)注于球囊菌的侵染過(guò)程(李江紅等, 2012)及蜜蜂幼蟲(chóng)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)定(Guoetal., 2019)。關(guān)于球囊菌侵染對(duì)蜜蜂幼蟲(chóng)腸道中免疫、解毒相關(guān)基因和病原基因表達(dá)的研究依然較少，此外，被球囊菌侵染蜜蜂幼蟲(chóng)腸道中營(yíng)養(yǎng)代謝方面的變化依然未知。因此，本研究對(duì)意大利蜜蜂Apismelliferaligustica3日齡幼蟲(chóng)接種球囊菌孢子，收取6日齡幼蟲(chóng)腸道，通過(guò)qRT-PCR測(cè)定幼蟲(chóng)腸道免疫、解毒、發(fā)育相關(guān)基因及病原基因的表達(dá)量，并測(cè)定幼蟲(chóng)腸道蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、葡萄糖和糖原含量的變化，進(jìn)一步探索蜜蜂免疫解毒反應(yīng)與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)能量代謝之間的生理聯(lián)系，以期為后續(xù)白堊病的相關(guān)機(jī)理研究提供理論依據(jù)，為養(yǎng)蜂實(shí)踐中通過(guò)調(diào)控蜜蜂營(yíng)養(yǎng)增強(qiáng)蜂群抵御球囊菌侵染的能力打下理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蜜蜂球囊菌孢子的純化培養(yǎng)

參考Foray等(2012)蜜蜂球囊菌的培養(yǎng)方法，制作MY-20培養(yǎng)基。在白堊病高發(fā)的季節(jié)，從蜂箱門(mén)口收集患白堊病的意大利蜜蜂幼蟲(chóng)蟲(chóng)尸，保存于-80℃冰箱中。使用稀釋10倍的次氯酸鈉溶液清洗白堊病蟲(chóng)尸2次，每次10 min，去除蟲(chóng)尸表面的雜菌；無(wú)菌水清洗2次，每次3 min，去除蟲(chóng)尸表面殘留的次氯酸鈉溶液；使用剪刀將清洗后的蟲(chóng)尸剪成4～5段，置于MY-20培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)移到恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，33℃培養(yǎng)3 d即可看到白色菌絲長(zhǎng)出；使用接種環(huán)將菌絲轉(zhuǎn)接至新的培養(yǎng)基上，以進(jìn)一步培養(yǎng)純化球囊菌菌株。蜜蜂球囊菌通過(guò)異性菌株接觸產(chǎn)生孢子繁殖，使用接種環(huán)將不同培養(yǎng)基中的菌絲轉(zhuǎn)接至一個(gè)新的培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)箱中33℃培養(yǎng)7～10 d即可在異性菌株間隙看到黑色孢子產(chǎn)生；收集孢子于1.5 mL離心管中，加入400 μL無(wú)菌水，充分研磨破壁，4 000 g離心10 min，去上清液，重復(fù)多次，直至球囊菌孢子囊破裂，孢子全部釋放，收集孢子懸浮液。采用血球計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)孢子液濃度。

1.2 意大利蜜蜂幼蟲(chóng)接種球囊菌

意大利蜜蜂幼蟲(chóng)取自福建農(nóng)林大學(xué)實(shí)驗(yàn)蜂場(chǎng)。在3個(gè)健康蜂群中使用限王產(chǎn)卵框限王產(chǎn)卵6 h，移取2日齡幼蟲(chóng)至48孔培養(yǎng)板，轉(zhuǎn)至恒溫恒濕培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)(溫度34.5℃，相對(duì)濕度95%)，取3日齡幼蟲(chóng)，對(duì)照組每頭幼蟲(chóng)飼喂50 μL食物(50%新鮮王漿、37%滅菌超純水、6%葡萄糖、6%果糖和1%酵母提取物)，處理組每頭幼蟲(chóng)飼喂50 μL含有2×106孢子/mL球囊菌的上述食物；4日齡和5日齡時(shí)對(duì)照組與處理組每頭幼蟲(chóng)均飼喂相同的不含孢子食物100 μL，每日清理食物殘留，更換新鮮幼蟲(chóng)食物。6日齡取樣時(shí)形態(tài)學(xué)觀察幼蟲(chóng)蟲(chóng)體完整，無(wú)明顯白堊病發(fā)病跡象，幼蟲(chóng)腸道正常，無(wú)破碎，無(wú)球囊菌菌絲穿透腸壁，拉取蜜蜂幼蟲(chóng)腸道，液氮中冷凍后放入1.5 mL離心管。收集樣本在-80℃冰箱中儲(chǔ)存，用以后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 qRT-PCR測(cè)定腸道中相關(guān)基因表達(dá)

通過(guò)測(cè)定黑蜂王臺(tái)病毒(black queen cell virus, BQCV)衣殼蛋白(BQCV capsid protein)基因和球囊菌核糖體28S rRNA(Ascosphaeraapis28S rRNA)基因的表達(dá)量來(lái)表明BQCV和球囊菌在意大利蜜蜂幼蟲(chóng)體內(nèi)的相對(duì)含量。基于本研究的初步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與BQCV相比，以色列急性麻痹病毒(Israeli acute paralysis virus, IAPV)和蜜蜂殘翅病毒(deformed wing virus, DWV)在蜜蜂體內(nèi)的含量較低，通過(guò)熒光定量檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，IAPV和DWV的CT值均大于35或者沒(méi)有任何檢測(cè)信號(hào)值，因而無(wú)法獲得數(shù)據(jù)用于后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析。相反，在我們使用的蜜蜂樣本中，BQCV在所有蜜蜂樣本中均可檢測(cè)到且CT值均小于31，因此，本研究檢測(cè)BQCV以說(shuō)明球囊菌侵染對(duì)幼蟲(chóng)腸道中其他病原含量的影響。參考前人已發(fā)表的相關(guān)引物(表1)檢測(cè)意大利蜜蜂6日齡幼蟲(chóng)腸道中免疫、解毒、發(fā)育相關(guān)基因和病原基因的表達(dá)。取1.2節(jié)意大利蜜蜂6日齡幼蟲(chóng)腸道樣本，3個(gè)幼蟲(chóng)腸道混合為一個(gè)樣本，對(duì)照組與處理組各取8個(gè)樣本重復(fù)。Trizol法提取幼蟲(chóng)腸道RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)合成cDNA。以Actin和RP49為內(nèi)參基因。采用SYBR? Premix Ex TaqTMII(TliRNaseH Plus)試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。配制PCR反應(yīng)體系(10 μL): SYBR Premix Ex Taq II(TliRNaseH Plus)(2×)5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL, cDNA 模板1 μL, 滅菌水 3.2 μL。所有操作均在冰上進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件: 95℃ 30 s; 95℃ 5 s, 60℃ 30 s, 40個(gè)循環(huán)。4℃保存。

表1 qRT-PCR引物

1.4 幼蟲(chóng)腸道蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和糖類含量的測(cè)定

1.4.1蛋白質(zhì)含量測(cè)定：取1.2節(jié)意大利蜜蜂6日齡幼蟲(chóng)腸道樣本，3個(gè)幼蟲(chóng)腸道混合為一個(gè)樣本，對(duì)照組與處理組各取9個(gè)樣本重復(fù)。每個(gè)樣本中加入1.5 mL PBS緩沖液，使用高通量組織研磨儀研磨組織(70 Hz 30 s, 2次)，4℃ 600 g離心5 min。取50 μL上清液，加入450 μL PBS緩沖液稀釋樣本10倍，用PBS緩沖液將蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品BSA Standard Solution(2 mg/mL)稀釋為1 000, 750, 500, 250, 125和25 μg/mL，取4 μL稀釋后的BSA標(biāo)準(zhǔn)品溶液和檢測(cè)樣品溶液加入到96微孔板中；每孔各加入200 μL復(fù)溫的Bradford Dye Reagent，混勻后在室溫下反應(yīng)5 min；把96微孔板放入酶標(biāo)儀595 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品蛋白質(zhì)濃度，每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔。

1.4.2脂質(zhì)、葡萄糖和糖原含量的測(cè)定：取1.2節(jié)意蜂6日齡幼蟲(chóng)腸道樣本，3個(gè)幼蟲(chóng)腸道混合為一個(gè)樣本，對(duì)照組與處理組各取9個(gè)樣本重復(fù)。每個(gè)樣本中加入1.5 mL PBS緩沖液，使用高通量組織研磨儀研磨組織(70 Hz 30 s, 2次)，4℃ 600 g離心5 min。取100 μL上清液加入200 μL PBS緩沖液稀釋樣本3倍，取180 μL稀釋后溶液至新的2 mL離心管中，加入20 μL 20%硫酸鈉溶液，加入1.5 mL氯仿甲醇混合溶液(氯仿∶甲醇=1∶2, v/v)，劇烈震蕩1 min；4℃ 600 g離心15 min。取100 μL上清液轉(zhuǎn)移至96孔石英板，金屬浴90℃完全蒸發(fā)，加入20 μL 98%硫酸，封口膜密封。90℃水浴2 min，冰上冷卻。加入180 μL香蘭素(1.2 g/L)室溫孵育15 min，把96孔石英板放入酶標(biāo)儀525 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，使用三油酸甘油酯做標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品脂質(zhì)濃度，每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔。

20 μL上清液加入到96微孔石英板，加入230 μL蒽酮試劑(1.42 g/L)，封口膜密封，室溫孵育15 min，90℃水浴15 min，把96孔石英板放入酶標(biāo)儀625 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，使用葡萄糖做標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品葡萄糖濃度，每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔。

取離心后沉淀，加入500 μL 80%甲醇洗滌沉淀，渦旋；4℃ 16 000 g離心5 min，重復(fù)洗滌兩次。去除上清液，向沉淀中加入1 mL蒽酮試劑；渦旋，過(guò)濾膜過(guò)濾(d=0.45 μm)，90℃水浴15 min，冰上停止反應(yīng)，把96孔石英板放入酶標(biāo)儀625 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，使用葡萄糖做標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品糖原濃度，每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔。

1.4.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：把蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品、脂質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品和糖標(biāo)準(zhǔn)品OD值分別與濃度一一對(duì)應(yīng)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，蛋白質(zhì)(y=1 535x-495.4;R2=0.996)、脂質(zhì)(y=0.277x-0.03;R2=0.984)、葡萄糖(y=0.558x-0.216;R2=0.985)和糖原(y=0.303x-0.172;R2=0.991)等各標(biāo)準(zhǔn)品線性關(guān)系良好，可用于計(jì)算腸道樣本蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、葡萄糖、糖原含量的測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

本實(shí)驗(yàn)使用Actin和RP49為內(nèi)參基因，以兩個(gè)基因的幾何平均數(shù)為參考值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量(Livak and Schmittgen, 2001)，以T檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和糖類含量，采用T檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 球囊菌侵染對(duì)意大利蜜蜂6日齡幼蟲(chóng)腸道免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

球囊菌侵染后意大利蜜蜂幼蟲(chóng)腸道免疫相關(guān)基因的表達(dá)如表2所示，與對(duì)照組相比，處理組的LOC406144,Apid1,Def1,Def2,LOC406142,PGRP-SA,Pgrp-s2,PGRP-S3,PGRP-lc,GNBP-1,GNBP3,PPOact,LOC552247,domeless,KAT2A和bsk均顯著上調(diào)表達(dá)(P<0.05)；catus顯著下調(diào)表達(dá)(P<0.05)。

表2 球囊菌侵染對(duì)意大利蜜蜂6日齡幼蟲(chóng)腸道免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.2 球囊菌侵染對(duì)意大利蜜蜂6日齡幼蟲(chóng)腸道解毒相關(guān)基因表達(dá)的影響

球囊菌侵染后意大利蜜蜂幼蟲(chóng)腸道解毒相關(guān)基因的表達(dá)如表3所示，與對(duì)照組相比，處理組的Cat,GSTS3,Cyp4g11,LOC725294,Ampka-r1,LOC411223,LOC409791,AmNOS和Sod2均顯著上調(diào)(P<0.05);CYP6AS14,CPR14,CYP306A1和LOC100576555顯著下調(diào)表達(dá)(P<0.05)。

表3 球囊菌侵染對(duì)意大利蜜蜂6日齡幼蟲(chóng)腸道解毒相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.3 球囊菌侵染對(duì)意大利蜜蜂6日齡幼蟲(chóng)腸道發(fā)育相關(guān)基因及病原基因表達(dá)的影響

球囊菌侵染后意大利蜜蜂幼蟲(chóng)其腸道發(fā)育相關(guān)基因及病原基因的表達(dá)如表4所示，與對(duì)照組相比，處理組的發(fā)育相關(guān)基因usp呈顯著上調(diào)表達(dá)(P<0.05),VGMC,HEX70b和Vg則顯著下調(diào)表達(dá)(P<0.05)；此外，處理組的病原基因BQCVcapsidprotein和Ascosphaeraapis28S rRNA基因顯著上調(diào)表達(dá)(P<0.05)，也表明球囊菌侵染后蜜蜂腸道內(nèi)BQCV和球囊菌Ascosphaeraapis相對(duì)含量顯著上升。

表4 球囊菌侵染對(duì)意大利蜜蜂6日齡幼蟲(chóng)腸道發(fā)育相關(guān)基因及病原基因表達(dá)的影響

2.4 球囊菌侵染對(duì)意大利蜜蜂6日齡幼蟲(chóng)腸道蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和糖類含量的影響

與對(duì)照組(1.87±0.33 mg)相比，處理組意大利蜜蜂幼蟲(chóng)腸道蛋白質(zhì)含量(1.58±0.20 mg/腸道)顯著降低(T=2.238,df=16,P=0.04)(圖1: A)，處理組意大利蜜蜂幼蟲(chóng)腸道脂質(zhì)含量(0.47±0.075 mg/腸道)比對(duì)照組(0.54±0.063 mg/腸道)顯著降低(T=2.363,df=16,P=0.031)(圖1: B)，處理組意大利蜜蜂幼蟲(chóng)腸道葡萄糖含量(0.36±0.091 mg/腸道)比對(duì)照組(0.25±0.099 mg/腸道)顯著升高(T=-2.371,df=16，P=0.031)(圖1: C)，處理組意大利蜜蜂幼蟲(chóng)腸道糖原含量(0.39±0.039 mg/腸道)比對(duì)照組(0.35±0.0359 mg/腸道)顯著升高(T=-2.652,df=16,P=0.017)(圖1: D)。

圖1 球囊菌侵染對(duì)意大利蜜蜂6日齡幼蟲(chóng)腸道蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和糖類含量的影響

3 討論

先天性免疫應(yīng)答的激活涉及到對(duì)病原體表面保守結(jié)構(gòu)的識(shí)別，即通過(guò)宿主細(xì)胞編碼的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors, PRRs)識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)，PRRs包含肽聚糖識(shí)別蛋白(peptidoglycan recognition proteins, PGRPs)及革蘭氏陰性結(jié)合蛋白(Gram-negative binding proteins, GNBPs); PRRs與PAMPs的結(jié)合引發(fā)了信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而激活細(xì)胞免疫反應(yīng)和抗菌肽的合成，以抵御包括細(xì)菌、真菌、病毒和原生動(dòng)物在內(nèi)的各種微生物(Zasloff, 2002; Hoffmann, 2003)。蜜蜂的體液免疫中，抗菌肽是重要的組成部分，主要由Toll通路和Imd通路調(diào)控。我們的結(jié)果顯示球囊菌的侵染，提高了抗菌肽基因LOC406144,Def1和Def2表達(dá)水平(表2)，這與Aronstein等(2010)的研究結(jié)果相類似，證實(shí)了Toll通路被激活以轉(zhuǎn)錄抗菌肽，來(lái)抵御腸道中的球囊菌。雖然Imd通路主要是對(duì)革蘭氏陰性菌起免疫反應(yīng)，但研究表明Toll和Imd兩個(gè)通路之間存在著協(xié)同作用(Tanjietal., 2007)，且Nie等(2020)研究蜜蜂幼蟲(chóng)抗性和敏感性個(gè)體在感染球囊菌后的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜，結(jié)果顯示抗菌肽基因Hymenoptaecin以及Defensin在抗性個(gè)體中高表達(dá)，這表明球囊菌同樣引起了Imd通路的反應(yīng)。而我們定量結(jié)果也顯示球囊菌的侵染引起幼蟲(chóng)體內(nèi)Imd通路的響應(yīng)，抗菌肽大量產(chǎn)生，抑制負(fù)調(diào)控Cactus蛋白的表達(dá)，使得負(fù)調(diào)控因子cactus表達(dá)降低，同時(shí)增加轉(zhuǎn)錄因子LOC552247(relish)的表達(dá)，最終達(dá)到抗菌肽基因Apid1和LOC406142的高表達(dá)(表2)。basket是JNK信號(hào)組分的同源物，可激活黑化、抗菌和凋亡防御機(jī)制(Evansetal., 2006)。basket基因的上調(diào)也證實(shí)了JNK通路在抵抗球囊菌入侵中具有一定的免疫功能。JAK/STAT通路在果蠅Drosophila對(duì)抗病毒上具有重要作用，其次家蠶Bombyxmori上發(fā)現(xiàn)感染白僵菌后該通路上相關(guān)基因發(fā)生上調(diào)(Liuetal., 2015; Gengetal., 2016)，說(shuō)明JAK/STAT也參與對(duì)抗真菌的感染，同時(shí)東方蜜蜂感染球囊菌后發(fā)現(xiàn)該通路上有兩個(gè)差異基因發(fā)生變化(Guoetal., 2019)。Domeless是JAK/STAT通路上的細(xì)胞因子受體，在我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示感染球囊菌后編碼該受體的基因上調(diào)，暗示著西方蜜蜂可能也有著類似的免疫反應(yīng)。酚氧化酶系統(tǒng)是蜜蜂體液免疫的重要組成部分，外源性物質(zhì)侵染蜜蜂時(shí)，酚氧化酶原(prophenoloxidase, PPO)裂解成酚氧化酶，將酪氨酸和多巴胺等物質(zhì)氧化，產(chǎn)生具有細(xì)胞毒性的醌類物質(zhì)，這些醌類物質(zhì)形成黑色素聚合體的前體，最后通過(guò)黑色素包囊作用消滅入侵微生物(時(shí)超美, 2000)，而在球囊菌侵染之后，PPO基因顯示為上調(diào)。這一系列的結(jié)果預(yù)示著在被球囊菌侵染后，意蜂幼蟲(chóng)免疫相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)，激活I(lǐng)md, Toll及JAK/STAT等信號(hào)通路，抗菌肽大量產(chǎn)生以參與機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

蜜蜂等昆蟲(chóng)主要依靠氧化反應(yīng)對(duì)外源性物質(zhì)進(jìn)行解毒，球囊菌侵染意大利蜜蜂幼蟲(chóng)很可能會(huì)引起幼蟲(chóng)的氧化應(yīng)激反應(yīng)(Lietal., 2020)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明球囊菌侵染意大利蜜蜂幼蟲(chóng)后其腸道解毒相關(guān)基因Cat,GSTS3,Cyp4g11,LOC725294,Ampka-r1,LOC411223,LOC409791,AmNOS和Sod2與對(duì)照組相比均顯著上調(diào)，CYP6AS14,CPR14,CYP306A1和LOC100576555顯著下調(diào)表達(dá)(表3)。過(guò)氧化氫酶與果蠅抗氧化損傷時(shí)細(xì)胞防御有重要作用(Sun and Tower, 1999)。谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶是一種多功能酶，可對(duì)內(nèi)源性和外源性化合物進(jìn)行解毒，并與果蠅幼蟲(chóng)中腸的氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)(Lietal., 2008)。細(xì)胞色素和蛋白激酶是昆蟲(chóng)體內(nèi)重要的解毒性酶參與機(jī)體的氧化反應(yīng)。在本研究中，與對(duì)照組相比，球囊菌感染的幼蟲(chóng)腸道中的Cat,GSTS3和Ampka-r1等基因顯著上調(diào)表達(dá)，證明球囊菌侵染會(huì)導(dǎo)致解毒相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)，增強(qiáng)蜜蜂幼蟲(chóng)的氧化反應(yīng)，影響蜜蜂幼蟲(chóng)的氧化應(yīng)激能力。

球囊菌侵染意大利蜜蜂幼蟲(chóng)后測(cè)定其腸道發(fā)育相關(guān)基因及病原基因表達(dá)量，結(jié)果表明處理組意大利蜜蜂幼蟲(chóng)腸道內(nèi)球囊菌Ascosphaeraapis28S rRNA基因比對(duì)照組顯著上調(diào)表達(dá)(表4)，說(shuō)明含有大量球囊菌，對(duì)照組意大利蜜蜂腸道內(nèi)無(wú)球囊菌，證明實(shí)驗(yàn)接種成功，后續(xù)實(shí)驗(yàn)合理。球囊菌侵染后可能會(huì)破壞意大利蜜蜂個(gè)體免疫解毒系統(tǒng)，降低意大利蜜蜂對(duì)病毒防御能力，進(jìn)而導(dǎo)致被球囊菌侵染幼蟲(chóng)腸道內(nèi)BQCV病毒含量顯著上升。與對(duì)照組相比發(fā)育相關(guān)基因usp顯著上調(diào)表達(dá)，VGMC,HEX70b和Vg顯著下調(diào)表達(dá)。超氣門(mén)蛋白USP是核受體的一員，一般是與相應(yīng)的配體形成二聚體來(lái)介導(dǎo)激素的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，如與蛻皮激素受體形成異源二聚體結(jié)合蛻皮激素，進(jìn)而調(diào)節(jié)發(fā)育變態(tài)、免疫等過(guò)程(Barchuketal., 2004)。Flatt等(2008)使用蛻皮激素處理大腸桿菌侵染的昆蟲(chóng)細(xì)胞以及果蠅幼蟲(chóng)后，發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的抗菌肽基因表達(dá)均表現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，隨后通過(guò)RNA干擾相應(yīng)的核受體EcR或USP無(wú)法表達(dá)，結(jié)果表明usp在蛻皮激素調(diào)控昆蟲(chóng)免疫功能的過(guò)程中式必不可少的，這與我們的結(jié)果相對(duì)應(yīng)。HEX70b功能是一種儲(chǔ)存蛋白，用于儲(chǔ)存營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在幼蟲(chóng)期大量合成為蛹期變態(tài)發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)(Burmester and Scheller, 1999)。本研究結(jié)果表明球囊菌侵染導(dǎo)致相應(yīng)的調(diào)控營(yíng)養(yǎng)代謝的基因呈下調(diào)表達(dá)，推測(cè)可能會(huì)爭(zhēng)奪幼蟲(chóng)腸道內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。卵黃原蛋白是昆蟲(chóng)體內(nèi)重要的功能蛋白，參與昆蟲(chóng)的免疫應(yīng)答，行為調(diào)節(jié)與壽命。Singh等(2013)研究表明卵黃原蛋白能抑制細(xì)菌的繁殖，可增強(qiáng)蜜蜂免疫力并參與免疫應(yīng)答的啟動(dòng)(Harwoodetal., 2019)。本研究結(jié)果表明球囊菌侵染后降低意大利蜜蜂幼蟲(chóng)的卵黃原蛋白基因Vg及HEX70b表達(dá)水平，影響意大利蜜蜂幼蟲(chóng)的免疫應(yīng)答及個(gè)體發(fā)育。

本研究結(jié)果表明球囊菌侵染后，意大利蜜蜂幼蟲(chóng)腸道蛋白質(zhì)與脂質(zhì)含量顯著下降,而葡萄糖與糖原含量顯著上升(圖1)。Aronstein等(2010)通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究表明球囊菌侵染后影響蜜蜂的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、泛素化蛋白的凋亡降解、營(yíng)養(yǎng)調(diào)控和RNA加工相關(guān)的關(guān)鍵功能。Li等(2018)研究表明東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)Nosemaceranae感染意大利蜜蜂后影響其蛋白質(zhì)含量，減少宿主蛋白質(zhì)的合成可能是真菌抑制宿主進(jìn)行免疫應(yīng)答的一種策略，蛋白質(zhì)合成的減少會(huì)影響意大利蜜蜂下游的生理途徑，如保幼激素的生理調(diào)節(jié)。卵黃蛋白原是一種與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的重要蛋白，可以與保幼激素相互作用，影響蜜蜂下游的生理行為(Guiduglietal., 2005)。本研究結(jié)果表明球囊菌侵染后，意大利蜜蜂幼蟲(chóng)腸道蛋白質(zhì)含量與卵黃蛋白原基因Vg表達(dá)均顯著下調(diào)。蜜蜂脂質(zhì)流失機(jī)制與進(jìn)化保守的調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)和能量代謝的分子信號(hào)通路有關(guān)，主要包括卵黃蛋白原、保幼激素、胰島素、胰島素生長(zhǎng)因子、章魚(yú)胺等信號(hào)分子的調(diào)節(jié)(Amentetal., 2011)。與東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)侵染意大利蜜蜂相似(Lietal., 2018)，球囊菌侵染也會(huì)降低意大利蜜蜂脂質(zhì)的含量，球囊菌和東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)同屬蜜蜂真菌類病害，侵染蜜蜂后，需要從寄主獲取生長(zhǎng)與繁殖的能量，脂質(zhì)作為生物體含能量最高的物質(zhì)，真菌可能會(huì)與宿主競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而加速蛋白質(zhì)與脂質(zhì)含量的損失，進(jìn)而影響意大利蜜蜂的免疫應(yīng)答。本研究結(jié)果顯示球囊菌脅迫意大利蜜蜂幼蟲(chóng)后，葡萄糖及糖原含量顯著上升。Li 等(2020)研究表明球囊菌侵染意大利蜜蜂幼蟲(chóng)后，代謝組測(cè)定顯示糖原含量顯著上升，與本研究結(jié)果相似。球囊菌脅迫可能會(huì)影響意大利蜜蜂的能量應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致幼蟲(chóng)感受到與碳水化合物相關(guān)的能量壓力，加速能量?jī)?chǔ)備，以應(yīng)對(duì)病原體誘導(dǎo)的能量應(yīng)激。

綜上，本研究從免疫、解毒、發(fā)育相關(guān)基因和病原基因表達(dá)及蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、葡萄糖、糖原等營(yíng)養(yǎng)成分含量來(lái)揭示球囊菌侵染對(duì)意大利蜜蜂幼蟲(chóng)的影響，結(jié)果表明球囊菌侵染意大利蜜蜂幼蟲(chóng)后影響其免疫、解毒、發(fā)育相關(guān)基因和病原基因表達(dá)，影響意大利蜜蜂的能量應(yīng)激反應(yīng)，加速蛋白質(zhì)、脂質(zhì)的損失及葡萄糖和糖原能量?jī)?chǔ)備，影響機(jī)體正常的生理活動(dòng)。