尼可地爾對力竭運動大鼠心肌損傷的保護(hù)作用研究

呂 磊，李 瑤，王永園，金 濤，鐘 勇

0 引 言

力竭運動是指機體進(jìn)行大強度超負(fù)荷運動，超出機體的耐受程度。力竭運動作為一種應(yīng)激性刺激，易出現(xiàn)心肌缺血缺氧損傷[1]，防治運動所致心肌損傷、探尋其機制具有重要的臨床意義。尼可地爾是具有類硝酸酯作用擴張血管和開放鉀通道雙重活性的煙酰胺硝酸鹽，能擴張血管、增加冠脈血流，減少因鈣超載引起的心肌細(xì)胞損傷[2-3]。近年研究表明，尼可地爾可減少大鼠心肌梗死后心肌細(xì)胞自噬和凋亡，減輕左室重構(gòu)，改善心功能[4]。然而，尼可地爾對力竭運動所致心肌損傷是否也有保護(hù)作用，其可能機制如何，尚不明確。本研究擬觀察尼可地爾對一次性力竭大鼠運動性心肌損傷的保護(hù)作用，探討其發(fā)揮心肌保護(hù)作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組健康雄性SD大鼠35只，體重150～170 g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，動物合格證號：SCXK(滬)2018-0006。大鼠分籠飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度(22±2)℃，濕度(50±5)%，標(biāo)準(zhǔn)實驗大鼠飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食，純凈水自由飲用，自然光照。實驗動物跑臺(ZH-PT，安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)。尼可地爾購自日本中外制藥株式會社。丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和ATP試劑盒購自南京建成生物工程研究所有限公司。所有大鼠進(jìn)行為期5 d的跑臺適應(yīng)性訓(xùn)練(跑臺坡度為零，速度為15 m/min，時間為15 min)。適應(yīng)性訓(xùn)練后采用隨機數(shù)字表法分為5組，每組7只：對照組、力竭組、尼可地爾低劑量組[1 mg/(kg·d)]、尼可地爾中劑量組[3 mg/(kg·d)]、尼可地爾高劑量組[9 mg/(kg·d)]。尼可地爾各組給予不同劑量尼可地爾灌胃4周，對照組和力竭組予以等滲鹽水3 mg/(kg·d)灌胃4周。除對照組外，其余各組預(yù)處理后均行一次性力竭運動。本研究中動物處置方法均符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)以及國家實驗動物管理條例(倫理批準(zhǔn)號:2018JLHZXKT-001)。

1.2 模型建立參照文獻(xiàn)[5]方法建立一次性力竭運動模型，大鼠在坡度為零的跑臺上進(jìn)行速度為28～30 m/min的跑臺持續(xù)性運動，直至力竭。判斷力竭狀態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)為：大鼠伏地式臥于跑道末端，反復(fù)聲光電刺激及人工驅(qū)趕也不能促使其繼續(xù)運動，大鼠四肢癱軟，翻轉(zhuǎn)后無法進(jìn)行翻正反射[6]。

1.3 心肌組織超微結(jié)構(gòu)觀察于力竭運動后取大鼠心臟，等滲鹽水沖洗，每組隨機取材2份，留取左心室心尖部心內(nèi)膜下同一部位行電鏡檢測。取左室心尖部心內(nèi)膜下1 mm3大小心肌組織，戊二醛固定液中低溫固定，1%鋨酸固定后脫水，醋酸鈾及硝酸鉛雙重電子染色，環(huán)氧樹脂包埋，透射電鏡(JEM-1011，日本JEOL公司)下觀察心肌超微結(jié)構(gòu)。

1.4 血清心肌酶、氧化應(yīng)激水平和血漿兒茶酚胺水平測定實驗結(jié)束后取靜脈血，1500×g(離心半徑15 cm)離心5 min，留取上清，4 ℃保存。全自動生化分析儀(7600型，日本日立)檢測心肌肌鈣蛋白I(cTnI)、血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)活性。嚴(yán)格按試劑盒步驟操作，硫代巴比妥酸比色法在532 nm處測定MDA含量，黃嘌呤氧化酶法在450 nm處測定SOD活性。高效液相色譜法(賽默飛ultimate3000高效液相色譜儀)檢測血漿腎上腺素(E)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)等兒茶酚胺(CA)水平。

1.5 心肌組織ATP含量測定心肌組織勻漿，取上清液，采用考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)測定蛋白濃度，嚴(yán)格按試劑盒步驟636 nm處測定心肌組織ATP含量。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)電鏡下對照組大鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，肌節(jié)整齊，肌絲清晰，線粒體膜完整，嵴清晰。力竭組部分心肌纖維紊亂，線粒體腫脹明顯，嵴模糊、斷裂，空泡變性，部分重度水腫，肌節(jié)紊亂。尼可地爾低、中、高劑量組線粒體輕度腫脹，大部分嵴尚完整，部分線粒體嵴絮狀改變，損傷程度較輕，尼可地爾中劑量組和高劑量組改善最為明顯。見圖1。

a：對照組;b：力竭組；c-e：分別為尼可地爾低、中、高劑量組

2.2 各組大鼠血清心肌損傷標(biāo)志物和血漿兒茶酚胺水平力竭組大鼠心肌酶、cTnI和兒茶酚胺水平較對照組明顯升高(P<0.05),尼可地爾組大鼠心肌酶水平低于力竭組(P<0.05);尼可地爾低、中、高劑量組NE水平均低于力竭組，高劑量組E和DA水平低于力竭組(P<0.05)。見表1、表2。

表1 各組大鼠心肌損傷標(biāo)志物水平比較

表2 各組大鼠血漿兒茶酚胺水平比較

2.3 各組大鼠血清MDA含量、SOD活性和心肌組織中ATP含量力竭組大鼠血清MDA含量明顯高于對照組，SOD活性和心肌組織中ATP含量低于對照組(P<0.05)。尼可地爾各組MDA含量均低于力竭組(P<0.05)；SOD活性高于力竭組，但僅尼可地爾高劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。尼可地爾中、高劑量組ATP含量高于力竭組，但僅尼可地爾中劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠血清MDA含量、SOD活性和心肌組織ATP含量比較

3 討 論

適度運動可有效改善心血管功能，而力竭運動可能出現(xiàn)心肌缺血缺氧損傷[7]。目前認(rèn)為其可能機制與心肌細(xì)胞能量代謝障礙、氧化應(yīng)激、鈣超載和細(xì)胞凋亡有關(guān)。心肌能量代謝障礙是心肌損傷的重要因素，心肌是體內(nèi)對氧供需求最高的組織，對缺氧損傷敏感。ATP是直接供給心肌能量的磷酸化合物，主要在線粒體合成[8]。心肌缺血損傷時細(xì)胞ATP酶活性下降，ATP供應(yīng)不足，鈣離子內(nèi)流增加導(dǎo)致鈣超載，同時氧自由基大量生成，線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損，細(xì)胞能量代謝障礙，進(jìn)一步加重細(xì)胞損傷[9]。本研究觀察了力竭組和尼可地爾各組心肌超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，力竭運動后線粒體結(jié)構(gòu)破壞，嵴絮狀改變，甚至空泡變性。尼可地爾預(yù)處理后，大鼠心肌線粒體損傷情況減輕，以尼可地爾組中、高劑量更為明顯。

cTnI是心肌損傷的特異性標(biāo)志物，正常情況下cTnI在血循環(huán)中的濃度很低，幾乎檢測不到。當(dāng)心肌細(xì)胞損傷壞死時，心肌細(xì)胞膜完整性就會被破壞，cTnI就會隨循環(huán)血液釋放到心肌間質(zhì)，可在外周血中測出，持續(xù)時間長且不受骨骼肌損傷的影響[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，力竭組大鼠心肌酶較對照組顯著升高，尼可地爾組大鼠血清心肌酶和cTnI水平明顯低于力竭組，提示一次性力竭運動造成心肌損傷，尼可地爾預(yù)處理減少心肌酶釋放，改善心肌超微結(jié)構(gòu)損傷，保護(hù)力竭所致心肌損傷。

ATP主要在線粒體合成，是直接供給心肌能量的磷酸化合物。既往研究發(fā)現(xiàn)急性跑臺力竭運動大鼠骨骼肌組織中ATP含量顯著下降[12]。本研究觀察了一次性力竭運動后心肌組織ATP含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，力竭運動后ATP含量明顯下降。這與超微結(jié)構(gòu)改變一致。尼可地爾預(yù)處理后，尼可地爾中劑量組心肌組織ATP含量較力竭組大鼠顯著增加，提示尼可地爾保護(hù)了心肌。其可能原因為尼可地爾能開放ATP敏感鉀通道，引起細(xì)胞膜的超極化，抑制電壓依賴性鈣離子通道的開放，減少細(xì)胞外鈣內(nèi)流，清除細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子，降低ATP消耗。

機體新陳代謝過程中會伴有自由基的產(chǎn)生，正常情況下，自由基生成與清除之間處于動態(tài)平衡。過度大強度運動常伴有氧需求的急劇增加，自由基大量生成，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡[13-14]。SOD能催化超氧陰離子的歧化反應(yīng)，降低機體氧化應(yīng)激損傷，MDA是細(xì)胞膜不飽和脂肪酸過氧化物產(chǎn)物，是活性氧終級代謝產(chǎn)物，可反映氧自由基活性。本研究結(jié)果顯示，大鼠一次性力竭運動后血清SOD活性明顯降低，MDA含量顯著增加，而尼可地爾預(yù)處理可增加力竭大鼠血清SOD活性，降低MDA含量，提示力竭運動能引起機體內(nèi)源性氧自由基脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強，增加機體自由基水平，尼可地爾可通過降低氧化應(yīng)激反應(yīng)保護(hù)力竭運動所致大鼠心肌損傷。其可能機制與ATP敏感鉀通道的開放能抑制線粒體內(nèi)的氧自由基生成有關(guān)[15]。

兒茶酚胺是由腎上腺髓質(zhì)和一些交感神經(jīng)元嗜鉻細(xì)胞分泌的一類重要的神經(jīng)遞質(zhì)，在機體心血管活動和神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)中起重要作用。機體處于高強度運動狀態(tài)時，交感-腎上腺素系統(tǒng)被激活，興奮性增高，交感神經(jīng)和腎上腺髓質(zhì)產(chǎn)生并合成CA[16]。E和NE水平激增會引起心率增快、全身血管阻力增大等全身反應(yīng)，也可引起冠狀動脈痙攣、心肌頓抑、心肌缺血造成心肌損傷甚至心肌細(xì)胞壞死[17]。本研究結(jié)果表明，一次性力竭運動后，大鼠血漿E、NE和DA水平均顯著升高，提示過度運動作為一種應(yīng)激性刺激導(dǎo)致交感-腎上腺素系統(tǒng)被激活，血液中CA水平升高。尼可地爾預(yù)處理后CA水平低于力竭組，提示尼可地爾抑制CA過度釋放，降低交感神經(jīng)興奮性，減少交感神經(jīng)對心血管的調(diào)節(jié)作用，有利于減少心肌氧耗量，降低心臟工作負(fù)荷。

力竭運動易導(dǎo)致心肌缺血缺氧損傷，如何有效應(yīng)用藥物防治運動所致心肌損傷有重要的臨床意義。本研究表明一次性力竭運動可導(dǎo)致心肌超微結(jié)構(gòu)損傷，心肌酶和CA水平增高，心肌組織ATP含量降低，尼可地爾預(yù)處理具有良好的心肌保護(hù)作用，能減輕心肌損傷，可能與降低氧化應(yīng)激損傷和兒茶酚胺水平，提高心肌組織ATP含量有關(guān)，在減少力竭運動所致心肌損傷防治中具有良好的應(yīng)用前景，其具體機制仍需進(jìn)一步探討研究。