miR-645靶向EDN3調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲

李豪 姬發(fā)祥 徐曉寧 馬金華 沈存芳 李進(jìn)章 王麗娟

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，青海 西寧 810000)

肝癌是臨床常見惡性腫瘤且病死率極高，其病理基礎(chǔ)較為復(fù)雜，目前臨床主要采用根治術(shù)治療肝癌但患者術(shù)后易復(fù)發(fā)〔1〕。既往研究顯示肝癌靶向藥物治療成為主流，基因及蛋白表達(dá)異常與肝癌復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移等惡性特征有關(guān)〔2〕。因此積極研究基因及蛋白在肝癌發(fā)生及發(fā)展中的作用可為指導(dǎo)肝癌精準(zhǔn)治療提供參考。微小RNA-645(miR-645)在頭鱗癌組織中表達(dá)上調(diào)并與頭鱗癌的轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，上調(diào)miR-645能夠增強(qiáng)頭鱗癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及單克隆形成等能力〔3〕。miR-645在結(jié)腸癌及肝癌組織中表達(dá)上調(diào)，抑制miR-645表達(dá)能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖〔4，5〕。通過生物學(xué)信息軟件預(yù)測內(nèi)皮素(EDN)3是miR-645的靶基因，而EDN3基因在乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌及神經(jīng)膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤中表達(dá)水平明顯降低并可能作為腫瘤靶向治療的潛在靶點(diǎn)〔6～9〕。本研究旨在探討miR-645在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)并采用基因干擾技術(shù)抑制miR-645表達(dá)，分析miR-645表達(dá)量改變對肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響，驗(yàn)證miR-645與EDN3的靶向作用關(guān)系，旨在為肝癌靶向治療提供新作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 肝癌細(xì)胞株HepG2、SMMC-7721、BEL-7402與正常肝細(xì)胞株L02均購自上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫。杜氏改良培養(yǎng)基(DMEM)購自美國Gibco公司；胎牛血清與胰蛋白酶均購自美國Hyclone公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自上海陽光生物科技有限公司；miR-645 mimic及陰性轉(zhuǎn)染質(zhì)粒、miR-645抑制劑(anti-miR-645)、anti-miR-NC均購自廣州易錦生物技術(shù)有限公司；EDN3 siRNA(si-EDN3)與陰性對照siRNA(si-NC)均購自美國Invitrogen公司；EDN3過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA-EDN3)與對照質(zhì)粒(pcDNA)均購自北京合生基因科技有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；噻唑藍(lán)(MTT)檢測試劑盒購自上海澤葉生物科技有限公司；Transwell小室購自北京優(yōu)尼康生物科技有限公司；蛋白裂解液與二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Mgteigel基質(zhì)膠購自美國BD公司；鼠抗人EDN3單克隆抗體購自武漢戴安生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、p21、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9單抗均購自美國CST公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)購自美國Bio-Rad公司；Trizol、反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR試劑盒均購自日本Toyobo公司。

1.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 肝癌細(xì)胞與正常肝細(xì)胞株均培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長匯合達(dá)到60%～70%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期細(xì)胞，胰蛋白酶消化后制備細(xì)胞懸浮液接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，放置在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)胞生長融合至30%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前更換為不含胎牛血清 DMEM培養(yǎng)基，分別用anti-miR-NC、anti-miR-645、miR-NC、miR-645 mimic及pcDNA-EDN3、pcDNA轉(zhuǎn)染入肝癌細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為anti-miR-NC組、anti-miR-645、miR-NC組、miR-645組、pcDNA-EDN3組、pcDNA組。為了驗(yàn)證EDN3對肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的作用，分別將EDN3 siRNA、si-NC分別轉(zhuǎn)染入anti-miR-645組肝癌細(xì)胞，分別為anti-miR-645+si-EDN3組、anti-miR-645+si-NC組。轉(zhuǎn)染后12 h更換完全DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，將轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3qRT-PCR檢測細(xì)胞中miR-645及EDN3 mRNA表達(dá)水平 檢測不同肝癌細(xì)胞株、正常肝細(xì)胞株及轉(zhuǎn)染前后各組細(xì)胞中miR-645、EDN3 mRNA相對表達(dá)量，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄RNA得到cDNA，嚴(yán)格按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作，配置qRT-PCR反應(yīng)體系，qRT-PCR條件為95℃ 2 min，95℃ 30 s，60℃30 s，72℃ 30 s，循環(huán)40次。采用比較閾值(Ct)法定量分析數(shù)據(jù)，miR-645以U6為內(nèi)參基因，EDN3以GAPDH為內(nèi)參基因。

1.4Western印跡檢測EDN3、CyclinD1、p21、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞后加入蛋白裂解液，12 000 r/min離心10 min提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白(蛋白上樣量40 μg)，電泳結(jié)束后將其轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，BSA封閉1 h后置于4℃孵育過夜，分別加入各蛋白一抗，EDN3蛋白稀釋比為1∶200，CyclinD1、p21、MMP-2、MMP-9蛋白稀釋比均為1∶500，TBST洗滌，分別加入二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌，ECL顯色，X線膠片曝光后用蒸餾水清洗，利用凝膠分析系統(tǒng)分析各條帶吸光度值。

1.5熒光素酶報(bào)告基因檢測miR-372-3p靶基因 將熒光素酶報(bào)告載體WT-EDN3、MUT-EDN3分別與miR-645 mimic、miR-NC共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染36 h后收集細(xì)胞，根據(jù)熒光素酶活性檢測試劑盒說明書檢測HepG2細(xì)胞相對熒光素酶活性(螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值)。

1.6MTT檢測細(xì)胞增殖 收集對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞，胰蛋白酶消化(濃度5×104個(gè)細(xì)胞/ml)，以每孔體積100 μl接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，放置在溫度37℃、相對濕度95%、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，棄培養(yǎng)液，按照“1.2”進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別在轉(zhuǎn)染后0、24、48、72 h加入MTT溶液(體積為20 μl/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后分別在每孔中加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩混勻，利用酶標(biāo)儀檢測波長為490 nm處各孔吸光度(OD)值。

1.7Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移及侵襲 用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋Matrigel基質(zhì)膠(稀釋比1∶8)，將100 μl稀釋液鋪于Transwell小室底部的上室面，同時(shí)將各組轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后采用DMEM培養(yǎng)基重懸(2×105個(gè)/ml)，取200 μl細(xì)胞懸浮液置于Transwell小室上室，取含胎牛血清DMEM培養(yǎng)基600 μl加入Transwell小室下室，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后采用多聚甲醛固定，20 min后使用結(jié)晶紫溶液染色，15 min后用棉簽擦拭Transwell小室內(nèi)面細(xì)胞，置于顯微鏡下觀察并隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)算侵襲細(xì)胞個(gè)數(shù)。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中無需在Transwell小室底部的上室面鋪Matrigel基質(zhì)膠，其余步驟同細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后置于顯微鏡下觀察遷移細(xì)胞個(gè)數(shù)。實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-645和EDN3在肝癌HepG2、SMMC-7721、BEL-7402細(xì)胞和正常肝細(xì)胞L02中的表達(dá) qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，miR-645在不同肝癌HepG2、SMMC-7721、BEL-7402細(xì)胞中表達(dá)水平明顯高于正常肝細(xì)胞L02(P<0.05)，而EDN3 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；Western印跡檢測結(jié)果顯示，不同肝癌HepG2、SMMC-7721、BEL-7402細(xì)胞中EDN3蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，見圖1、表1。肝癌HepG2細(xì)胞中miR-645表達(dá)水平最高，EDN3 mRNA及蛋白表達(dá)最低，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中主要以HepG2細(xì)胞為研究材料。

表1 miR-645和EDN3在肝癌HepG2、SMMC-7721、BEL-7402細(xì)胞和正常肝細(xì)胞L02中的表達(dá)

圖1 EDN3蛋白表達(dá)

2.2miR-645靶向調(diào)控EDN3的表達(dá) 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，miR-645 mimic可明顯抑制WT-EDN3的熒光素酶活性(P<0.05)，但miR-645 mimic對MUT-EDN3的熒光素酶無明顯抑制作用(P>0.05)，見圖2、表2。Western印跡法結(jié)果顯示，miR-645組HepG2細(xì)胞中EDN3蛋白表達(dá)顯著低于miR-NC組(P<0.05)，anti-miR-645組顯著高于anti-miR-NC組(P<0.05)，見表3，圖3。

圖2 EDN3的3′UTR中含有與miR-645互補(bǔ)的核苷酸序列

表2 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

表3 miR-645調(diào)控EDN3蛋白的表達(dá)

1～4：miR-NC組、miR-645組、anti-miR-NC組、anti-miR-645組圖3 EDN3蛋白表達(dá)

2.3干擾miR-645表達(dá)對肝癌HepG2增殖、遷移、侵襲的影響 干擾miR-645表達(dá)后，采用qRT-PCR法驗(yàn)證沉默效果，結(jié)果顯示anti-miR-645組HepG2細(xì)胞中miR-645表達(dá)水平較anti-miR-NC組明顯降低(P<0.05)，提示沉默效果良好可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。MTT法檢測結(jié)果顯示，培養(yǎng)48 h后anti-miR-645組HepG2細(xì)胞增殖活性明顯低于anti-miR-NC組(P<0.05)。下調(diào)miR-645表達(dá)后HepG2細(xì)胞遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著低于anti-miR-NC組(P<0.05)，見圖4，圖5，表4。anti-miR-645組HepG2細(xì)胞中CyclinD1、MMP-2、 MMP-9蛋白表達(dá)顯著低于anti-miR-NC組(P<0.05)，而p21蛋白表達(dá)顯著高于anti-miR-NC組(P<0.05)，見表5。

表5 干擾miR-645表達(dá)對肝癌HepG2增殖、遷移、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖4 Western印跡檢測相關(guān)蛋白表達(dá)

圖5 HepG2的遷移、侵襲(×200)

表4 干擾miR-645表達(dá)對肝癌HepG2增殖、遷移、侵襲的影響

2.4EDN3過表達(dá)對肝癌HepG2增殖、遷移、侵襲的影響 pcDNA-EDN3組HepG2細(xì)胞中EDN3蛋白表達(dá)明顯高于pcDNA組(P<0.05)。pcDNA-EDN3組HepG2細(xì)胞OD值(48、72 h)、遷移細(xì)胞及侵襲細(xì)胞數(shù)目均顯著低于pcDNA組(P<0.05)。pcDNA-EDN3組HepG2細(xì)胞中CyclinD1、MMP-2、 MMP-9蛋白表達(dá)顯著低于pcDNA組(P<0.05)，而p21蛋白表達(dá)顯著高于pcDNA組(P<0.05)，見圖6、表6、表7。

表6 EDN3過表達(dá)對肝癌HepG2增殖、遷移、侵襲的影響

表7 EDN3過表達(dá)對肝癌HepG2增殖、遷移、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖6 EDN3和增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

2.5抑制EDN3表達(dá)逆轉(zhuǎn)了干擾miR-645表達(dá)對肝癌HepG2增殖、遷移、侵襲的作用 相對于anti-miR-645+si-NC組，抑制EDN3表達(dá)后，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示HepG2細(xì)胞OD值(48、72 h)、遷移細(xì)胞及侵襲細(xì)胞數(shù)目增加(P<0.05)，p21蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，而CyclinD1、MMP-2、 MMP-9蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，見圖7、表8、表9。

表8 抑制EDN3表達(dá)逆轉(zhuǎn)了干擾miR-645表達(dá)對肝癌HepG2增殖、遷移、侵襲的作用

表9 抑制EDN3表達(dá)逆轉(zhuǎn)了干擾miR-645表達(dá)對肝癌HepG2增殖、遷移、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的作用

1～4：anti-miR-NC組、anti-miR-645組、anti-miR-645+si-NC組、anti-miR-645+si-EDN3組圖7 EDN3蛋白表達(dá)

3 討 論

肝癌患者復(fù)發(fā)率極高，細(xì)胞侵襲性強(qiáng)等病理特征造成臨床治療困難，由于肝癌發(fā)病隱匿導(dǎo)致患者確診時(shí)已處于中晚期〔10〕。miRNA表達(dá)異?？赏ㄟ^調(diào)控靶基因表達(dá)進(jìn)而影響肝癌發(fā)生及發(fā)展，研究表明部分miRNA可提高肝癌診斷敏感性及特異性，還可為肝癌治療提供作用靶點(diǎn)〔11〕。因而探尋新型miRNA對肝癌細(xì)胞遷移及侵襲的影響有助于提高臨床靶向治療效果。

miR-645可通過調(diào)控下游靶基因表達(dá)進(jìn)而參與乳腺癌細(xì)胞侵襲等生物學(xué)過程〔12〕。Chen等〔13〕研究表明miR-645可通過靶向GK5促進(jìn)腎透明細(xì)胞癌的細(xì)胞轉(zhuǎn)移和增殖。Feng等〔14〕研究表明miR-645還可作為致癌基因促進(jìn)胃癌發(fā)生及發(fā)展過程。本研究結(jié)果說明miR-645可能參與肝癌發(fā)生過程。提示miR-645可能作為臨床早期診斷肝癌的重要分子標(biāo)志物。Wang等〔15〕研究表明長鏈非編碼RNA LINC00161可通過調(diào)節(jié)miR-645-IFIT2軸使骨肉瘤細(xì)胞對順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感。Cai等〔16〕研究表明抑制miR-645表達(dá)可通過靶向DCDC2抑制乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。本研究采用基因干擾技術(shù)抑制miR-645表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾miR-645表達(dá)后HepG2細(xì)胞增殖活性、遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)目均明顯降低。采用Western blot法檢測細(xì)胞增殖、遷移及侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)，結(jié)果表明MMP-2、MMP-9激活后可通過促進(jìn)惡性腫瘤血管生成進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及遷移，CyclinD1蛋白表達(dá)升高可促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，p21可通過抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶激活進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖〔17〕。提示抑制miR-645表達(dá)可通過抑制CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)并促進(jìn)p21蛋白表達(dá)進(jìn)而降低肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。但關(guān)于miR-645如何調(diào)控肝癌發(fā)生及發(fā)展相關(guān)信號通路仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

EDN3在乳腺癌、結(jié)直腸癌及宮頸鱗癌等癌組織或細(xì)胞中均呈低表達(dá)并可抑制癌細(xì)胞遷移及侵襲能力〔18～20〕。本研究結(jié)果顯示不同肝癌細(xì)胞中EDN3表達(dá)水平均明顯降低，與上述研究結(jié)果相似。提示EDN3表達(dá)水平降低可促進(jìn)肝癌發(fā)生。通過構(gòu)建EDN3過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入肝癌細(xì)胞，結(jié)果提示上調(diào)EDN3表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證EDN3是miR-645的靶基因，miR-645可負(fù)向調(diào)控EDN3表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-645是通過負(fù)向調(diào)控EDN3蛋白表達(dá)而發(fā)揮作用，本研究將EDN3 siRNA及si-NC分別與anti-miR-645共轉(zhuǎn)染入肝癌細(xì)胞，結(jié)果提示miR-645可通過調(diào)控EDN3表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。