長鏈非編碼RNA-UCA1通過靶向miR-873調控胃癌細胞增殖、侵襲遷移的分子機制

吳欣 黃鴻菲 姜棟棟

(1濰坊護理職業(yè)學院解剖教研室，山東 濰坊 262500；2陽光融和醫(yī)院消化內科；3濰坊市中醫(yī)院病理科)

胃癌是常見的消化系統(tǒng)中的惡性腫瘤之一，雖然放化療能夠延長患者的生存期，但副作用較明顯，隨著分子生物學技術的發(fā)展，在分子水平抑制腫瘤生長的治療方式越來越受到人們關注，眾多靶向藥物為晚期胃癌的治療提供了良好的前景，分子靶向治療已成為一種新興治療手段，在胃癌治療中受到廣泛關注〔1～3〕。

長鏈非編碼RNA(LncRNA)是長度大于200bp的非編碼RNAs，其異常表達在表觀遺傳學、轉錄和轉錄后水平調節(jié)胃癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲、轉移等生物學過程〔4〕。尿路上皮癌胚抗原(UCA)1最初是在膀胱癌中發(fā)現(xiàn)的一種長鏈非編碼RNA〔5〕，UCA1在多種腫瘤中高表達，作為癌基因起作用〔6〕，在胃癌的增殖、分化、轉移、多藥耐藥等方面發(fā)揮重要的作用〔7〕。研究發(fā)現(xiàn)miRNA與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關〔8〕。miR-873能抑制人前列腺癌PC3細胞的侵襲〔9〕。miR-873影響肝癌患者生存率，在肝癌細胞中過表達抑制肝癌細胞的侵襲和遷移〔10〕。miR-873-5p可阻滯膀胱癌細胞周期進展，抑制細胞的增殖〔11〕。本研究將探尋LncRNA UCA1通對胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲的影響，分析UCA1和miR-873的靶向關系。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 胃癌細胞SGC-7901和胃黏膜上皮正常細胞系GES-1均購自中國科學院上海細胞庫。RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；AceQ qPCR SYBR? Green Mix購自南京vazyme生物公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；細胞計數(shù)試劑盒(CCK)-8購自碧云天生物技術研究所。

1.2方法

1.2.1細胞轉染和分組 胃癌細胞SGC-7901和胃黏膜上皮正常細胞系GES-1常規(guī)培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基中，取對數(shù)生長期胃癌細胞SGC-7901，將其分為si-con組(si-con)、si-UCA1組、miR-con組、miR-873組、si-UCA1+anti-miR-con組、si-UCA1+anti-miR-873組。

LncRNA-UCA1干擾序列(siRNA)及陰性對照序列(si-con)分別為：siRNA正義鏈：5′-AAGAGCCGATCAGACAAACAA-3′，反義鏈：5′-UUGUUUGUCUGAUCGGCUCUU-3′；si-con 正義鏈：5′-AATTCTCCGAACGTGTCACGT-3′，反義鏈：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAAUU-3′；miR-873 mimics正義鏈：5′-GCAGGAACTTGTGAGTCTCCT-3′，反義鏈：5′-AGGAGACTCACAAGTTCCT -3′。

1.2.2qRT-PCR分析UCA1及miR-873表達水平 提取細胞總RNA，合成cDNA后進行qRT-PCR方法擴增，相對表達量采用2-△△Ct法計算。UCA1引物序列:上游引物:5′-TTTGCCAGCCTCAGCTTAAT-3′；下游引物:5′-TTGTCCCCATTTTCCATCAT-3′；內參GAPDH：上游引物:5′-AGGTCCACCACTGACACGTT-3′;下游引物:5′-GCCTCAAGATCAGCAAT-3′；miR-873上游引物：5′-ACACTCCAGCTGGGGCAGGAACTTGTGAG-3′；下游引物：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′。

1.2.3CCK-8法測定沉默UCA1、過表達miR-873和抑制表達miR-873逆轉si-UCA1對SGC-7901細胞增殖的影響 分別取si-con組、si-UCA1組、miR-con組、miR-873組、si-UCA1+anti-miR-con組和si-UCA1+anti-miR-873組的對數(shù)生長期細胞，消化后接種于96孔板培養(yǎng)，分別于24 h、48 h和72 h加入CCK-8試劑。孵育2 h后檢測490 nm處OD值。

1.2.4Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力 收集si-con組、si-UCA1組、miR-con組、miR-873組、si-UCA1+anti-miR-con組和si-UCA1+anti-miR-873組細胞，無血清培養(yǎng)，取100 μl接種于 Transwell 小室上層，培養(yǎng)24 h后用結晶紫染色，顯鏡下拍照并計數(shù)。侵襲實驗：在Transwell小室上層加入基質膠，其余同遷移操作。

1.2.5熒光素酶報告實驗 構建野生型和突變型基因靶點UCA1的熒光素酶表達載體(WT-UCA1和MUT-UCA1)，將其分別與miR-873和miR-con共轉染，按試劑盒說明書操作檢測熒光素酶活性。

1.3統(tǒng)計學分析 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗，方差分析。

2 結 果

2.1胃癌細胞SGC-7901中miR-873和UCA1的表達 SGC-7901細胞中miR-873的表達水平顯著低于GES-1細胞；而UCA1 mRNA的表達水平顯著高于GES-1細胞(P<0.05)，見表1。

表1 檢測胃癌細胞SGC-7901和胃黏膜上皮正常細胞系GES-1中miR-873和UCA1的表達

2.2沉默UCA1的表達抑制胃癌細胞SGC-7901增殖 與si-con組細胞相比，si-UCA1組SGC-7901細胞中UCA1 mRNA的表達水平顯著下降，SGC-7901細胞活性顯著降低(P<0.05)，見表2。

表2 沉默UCA1的表達抑制胃癌細胞SGC-7901增殖

2.3沉默UCA1的表達抑制胃癌細胞SGC-7901遷移和侵襲 si-UCA1組胃癌細胞SGC-7901的遷移和侵襲數(shù)量顯著低于si-con組(P<0.05)，見圖1，表3。

圖1 Transwell檢測胃癌細胞SGC-7901遷移數(shù)和侵襲數(shù)(結晶紫染色，×200)

表3 沉默UCA1的表達抑制胃癌細胞SGC-7901遷移和侵襲個)

2.4UCA1靶向調控miR-873的表達 TargetScan預測顯示UCA1與miR-873存在結合位點(圖2)。轉染miR-873和WT-UCA1后的細胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；而miR-873和MUT-UCA1的細胞熒光素酶活性差異不顯著。見表4。抑制UCA1表達后miR-873的表達水平升高(si-con組0.38±0.05，si-UCA1組1.69±0.13，P<0.05)；而過表達UCA1后miR-873的表達水平降低(pcDNA組0.41±0.05、pcDNA-UCA1組0.16±0.03，P<0.05)。

表4 雙熒光素酶報告實驗

圖2 UCA1靶向調控miR-873的序列信息

2.5過表達miR-873抑制胃癌細胞SGC-7901增殖、遷移和侵襲 與miR-con組比較，miR-873組胃癌細胞中miR-873的表達水平顯著升高，細胞活性顯著降低，胃癌細胞遷移和侵襲數(shù)量顯著降低(P<0.05)，見表5。

表5 過表達miR-873抑制胃癌細胞SGC-7901增殖、遷移和侵襲

2.6抑制miR-873表達逆轉了沉默UCA1對胃癌細胞SGC-7901增殖、遷移和侵襲的影響 與si-con組比較，si-UCA1組miR-873的表達水平顯著升高，SGC-7901細胞活性顯著降低，SGC-7901細胞遷多和侵襲數(shù)顯著降低(P<0.05)；與si-UCA1+anti-miR-con組比較，si-UCA1+anti-miR-873組SGC-7901細胞活性顯著升高，SGC-7901細胞遷移和侵襲數(shù)顯著升高(P<0.05)，見表6。

表6 抑制miR-873表達逆轉了沉默UCA1對胃癌細胞SGC-7901增殖、遷移和侵襲的影響

3 討 論

LncRNAs的發(fā)現(xiàn)對胃癌發(fā)病的分子機制研究及發(fā)現(xiàn)新的分子標志物提供了可能〔12〕。研究發(fā)現(xiàn)UCA1在多種消化系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著關鍵作用〔13〕。LncRNA UCA1在胃癌耐藥細胞中顯著高表達，干擾UCA1表達可明顯逆轉胃癌耐藥性，可作為治療胃癌耐藥的重要分子靶標〔14〕。UCA1在腫瘤組織中高表達，下調UCA1表達可明顯抑制胃癌細胞增殖〔15〕。UCA1通過調控細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(CDKN)1B和細胞分裂周期25磷酸酶(CDC25)B改變細胞周期分布從而影響細胞增殖；通過調控腫瘤蛋白(TP)53和磷酸化蛋白激酶(p-AKT)影響胃癌細胞增殖和遷移，通過結合 miR-143調控人腺激肽釋放酶(HK)2表達影響胃癌細胞糖代謝過程〔16〕。本實驗結果表明抑制UCA1表達可抑制SGC-7901細胞增殖、遷移和侵襲；與上述研究結果一致。

研究報道，miR-873-5p在胃癌組織中低表達，過表達miR-873-5p通過靶向負調控膠質瘤相關瘤基因(Gli)1降低細胞活力，增加細胞凋亡和細胞周期停滯，在胃癌中起腫瘤抑制劑的作用〔17〕。miR-873-5p高表達可抑制阿爾茨海默病中神經細胞凋亡〔18〕。生長停滯特異性轉錄本(GAS)5可通過與miR-873的相互作用抑制HIV-1復制〔19〕。miR-873通過靶向腫瘤壞死因子受體相關因子(TRAF)5和轉化生長因子β活化激酶結合蛋白(TAB)1抑制結直腸癌細胞增殖〔20〕。miR-873通過靶向GLI1抑制H9C2心肌細胞增殖〔21〕。miR-873可通過抑制分化的胚胎軟骨細胞表達基因(DEC)2的表達抑制食管癌的進展〔22〕。本實驗結果表明，胃癌細胞中miR-873低表達；過表達miR-873可降低胃癌細胞活性，減少遷移和侵襲數(shù)。

UCA1是胃癌細胞中的促癌因子，UCA1能夠下調miR-27b表達從而增強胃癌多藥耐藥性〔23〕。UCA1通過靶向miR-122促進膠質瘤細胞的增殖，遷移和侵襲〔24〕。UCA1通過調節(jié)miR-96/叉頭轉錄因子(FOXO)3影響胰腺癌的細胞增殖，侵襲和遷移〔25〕。UCA1可靶向調節(jié)mi-R143調控前列腺癌細胞的增殖和凋亡〔26〕。UCA1通過miR-184影響青蒿琥酯對前列腺癌細胞增殖和遷移的抑制作用〔27〕。UCA1可與miR-507相結合參與黑素瘤的細胞增殖，侵襲和G0/G1細胞周期停滯〔28〕。而UCA1與miR-873之間的靶向機制還未明確，本實驗結果表明，UCA1可靶向調控miR-873的表達，抑制miR-873表達可逆轉抑制UCA1對胃癌細胞SGC-7901的作用。