miR-99a-3p靶向調(diào)控CD36基因?qū)Ω咛钦T導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞損傷的影響及其機(jī)制

劉倩 白建民

(南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校護(hù)理系，河南 南陽(yáng) 473000)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，也是糖尿病患者死亡的重要原因之一，臨床上其主要病理特征之一為腎小球足細(xì)胞損傷，在DN的發(fā)生、發(fā)展中有重要作用〔1〕。miRNA在腎臟發(fā)育、平衡和疾病中具有重要作用，與腎小管間質(zhì)硬化和終末期腎小球病變的發(fā)生相關(guān)；可作為腎病的一種新的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)〔2〕。miR-99a通過(guò)靶向骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體(BMPR)2基因可調(diào)節(jié)大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的早期軟骨形成分化〔3〕；miR-99a-3p的異位表達(dá)能顯著抑制癌細(xì)胞在前列腺癌(PCa)細(xì)胞中的增殖、遷移和侵襲〔4〕。分化抗原(CD)36是清道夫受體家族成員之一，是巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)的主要受體，與多種配體相結(jié)合可介導(dǎo)先天性免疫及炎癥等〔5〕。CD36在乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝損傷中通過(guò)促進(jìn)肝臟炎性反應(yīng)及促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)揮促進(jìn)炎癥應(yīng)答的作用〔6〕；CD36也與2型糖尿病的發(fā)病有關(guān)，高糖環(huán)境可上調(diào)CD36的表達(dá)，CD36單核苷酸多態(tài)性與胰島素抵抗密切相關(guān)〔7〕。但miR-99a-3p在高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞損傷中的表達(dá)及其對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞損傷的影響，且是否靶向調(diào)控CD36目前還尚未可知。本研究旨在研究miR-99a-3p是否通過(guò)靶向調(diào)控CD36影響高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞損傷。

1 材料與方法

1.1材料 鼠腎臟足細(xì)胞系MPC5購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清、DMEM-F12培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Trizol試劑、熒光定量試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)試劑盒、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京Solarbio公司；RIPA蛋白裂解液、BCA試劑盒、十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將小鼠足細(xì)胞在DMEM-F12完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)，平均3～4 d達(dá)80%以上融合傳代；平均10～14 d分化成熟后，饑餓培養(yǎng)24 h，用終濃度為30 mmol/L的D-葡萄糖溶液刺激細(xì)胞作為高糖(HG)組，同時(shí)以終濃度為5 mmol/L的D-葡萄糖溶液處理細(xì)胞作為正常對(duì)照(NG)組。將miR-NC、miR-99a-3p、anti-miR-NC、anti-miR-99a-3p分別轉(zhuǎn)染至未經(jīng)任何處理的小鼠足細(xì)胞中，記為miR-NC組、miR-99a-3p組、anti-miR-NC組、anti-miR-99a-3p組。將miR-NC、miR-99a-3p、si-NC、si-CD36轉(zhuǎn)染至高糖處理的小鼠足細(xì)胞中，記為HG+miR-NC組、HG+miR-99a-3p組、HG+si-NC組和HG+si-CD36組。將miR-99a-3p與pcDNA、pcDNA-CD36分別共同轉(zhuǎn)染至高糖處理的小鼠足細(xì)胞中，記為HG+miR-99a-3p+pcDNA組、HG+miR-99a-3p+pcDNA-CD36組。

1.2.2qRT-PCR檢測(cè)miR-99a-3p和CD36 mRNA的表達(dá)水平 收集各組細(xì)胞，提取總RNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行PCR擴(kuò)增，循環(huán)條件為95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。

1.2.3Western印跡檢測(cè)蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白后用BCA試劑盒進(jìn)行定量，將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，脫脂奶粉封閉后加入一抗4℃孵育過(guò)夜；再加入二抗室溫孵育2 h，暗室中曝光顯影，定影，分析蛋白條帶吸光度，以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白表達(dá)水平。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各組細(xì)胞，漂洗后用結(jié)合緩沖液重懸，然后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育；上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-99a-3p對(duì)CD36的靶向調(diào)控 構(gòu)建野生型和突變型基因靶點(diǎn)CD36的3′UTR熒光素酶載體(WT-CD36和MUT-CD36)，將其分別與miR-NC和miR-99a-3p轉(zhuǎn)染至小鼠足細(xì)胞中，按試劑盒說(shuō)明檢測(cè)熒光素酶活性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1高糖誘導(dǎo)對(duì)小鼠足細(xì)胞中miR-99a-3p和CD36表達(dá)的影響 與NG組相比，HG組小鼠足細(xì)胞中miR-99a-3p的表達(dá)水平顯著降低；CD36 mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖1，表1?？梢?jiàn)，高糖誘導(dǎo)促進(jìn)小鼠足細(xì)胞中CD36的表達(dá)，抑制miR-99a-3p的表達(dá)。

表1 高糖誘導(dǎo)對(duì)小鼠足細(xì)胞中miR-99a-3p和CD36表達(dá)的影響

圖1 CD36蛋白表達(dá)

2.2miR-99a-3p過(guò)表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞中podocin及nephrin蛋白表達(dá)的影響 與HG+miR-NC組相比，HG+miR-99a-3p組小鼠足細(xì)胞中miR-99a-3p的表達(dá)水平顯著升高，podocin、nephrin蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖2，表2。

1～4：NG組、HG組、HG+miR+NC組、HG+miR-99a-3p組；圖3同圖2 podocin和nephrin蛋白表達(dá)

表2 miR-99a-3p過(guò)表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞中podocin、nephrin蛋白表達(dá)及凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.3miR-99a-3p過(guò)表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞凋亡的影響 與NG組相比，HG組小鼠足細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，Bax、cleaved-caspase3蛋白表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與HG+miR-NC組相比，HG+miR-99a-3p組小鼠足細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高，Bax、cleaved-caspase3蛋白表達(dá)水平顯著降低，小鼠足細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表2、圖3、圖4。

圖3 細(xì)胞凋亡流式圖

圖4 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

2.4抑制CD36表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞損傷的影響 與HG+si-NC組相比，HG+si-CD36組小鼠足細(xì)胞中podocin、nephrin、Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著升高，CD36、Bax蛋白的表達(dá)水平顯著降低，小鼠足細(xì)胞的凋亡率顯著降低(P<0.05)。圖5，表3。

表3 抑制CD36表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞損傷的影響

圖5 CD36、podocin、nephrin和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

2.5miR-99a-3p靶向調(diào)控CD36的表達(dá) TargetScan預(yù)測(cè)顯示CD36與miR-99a-3p存在結(jié)合位點(diǎn)(圖6)。熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果(表4)顯示，轉(zhuǎn)染miR-99a-3p和WT-CD36后的小鼠足細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染miR-99a-3p和MUT-CD36后的小鼠足細(xì)胞熒光素酶活性差異不顯著。miR-NC組、miR-99a-3p組、anti-miR-NC組、anti-miR-99a-3p組CD36蛋白表達(dá)分別為：0.52±0.05、0.23±0.02、0.49±0.05、0.92±0.08。過(guò)表達(dá)miR-99a-3p，CD36蛋白的表達(dá)水平降低；抑制miR-99a-3p表達(dá)，CD36蛋白的表達(dá)水平升高(P<0.05，n=6)。見(jiàn)圖7。

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

圖6 CD36的3′UTR中含有與miR-99a-3p互補(bǔ)的核苷酸序列

1～4:miR-NC組、miR-99a-3p組、anti-miR-NC組、anti-miR-99a-3p組圖7 miR-99a-3p靶向調(diào)控CD36的表達(dá)

2.6CD36過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-99a-3p過(guò)表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞損傷的作用 與HG+miR-99a-3p+pcDNA組相比，HG+miR-99a-3p+pcDNA-CD36組小鼠足細(xì)胞中podocin、nephrin、Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著降低，CD36、Bax蛋白的表達(dá)水平顯著升高，小鼠足細(xì)胞的凋亡率顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖8、表5。

1～4：HG+miR-NC組、HG+miR-99a-3p組、HG+miR-99a-3p+pcDNA組、HG+miR-99a-3p+pcDNA-CD36組圖8 CD36、podocin、nephrin和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

表5 CD36過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-99a-3p過(guò)表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞損傷的作用

3 討 論

足細(xì)胞損傷是糖尿病腎病DN進(jìn)展的關(guān)鍵，隨著糖尿病腎病的進(jìn)展，損傷積累可導(dǎo)致足細(xì)胞凋亡與脫落、腎小球基底膜破壞等〔8〕。因此，研究足細(xì)胞損傷機(jī)制，有助于糖尿病腎病的治療。研究發(fā)現(xiàn)miRNA在糖尿病及其并發(fā)癥的病理發(fā)生發(fā)展中具有重要調(diào)節(jié)作用〔9〕。miR-99a過(guò)表達(dá)可以減弱腦缺血再灌注誘導(dǎo)的小鼠腦組織損傷和神經(jīng)功能缺損〔10〕。miR-99a通過(guò)激活H9c2細(xì)胞中的Notch途徑可減少脂多糖誘導(dǎo)的氧化損傷〔11〕。miR-99a-3p可預(yù)測(cè)晚期結(jié)直腸癌患者的化療反應(yīng)〔12〕。miR-99a對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用〔13〕。脂多糖可明顯抑制內(nèi)皮細(xì)胞中miR-99a的表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-99a抑制脂多糖導(dǎo)致的炎性因子表達(dá)升高，miR-99a對(duì)脂多糖損傷的內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用〔14〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞中miR-99a-3p低表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-99a-3p表達(dá)可保護(hù)高糖刺激的小鼠足細(xì)胞損傷，且miR-99a-3p可靶向調(diào)控CD36的表達(dá)。

研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠巨噬細(xì)胞中CD36的表達(dá)水平升高，CD36參與糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展〔15〕。CD36參與高脂介導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡，是脂代謝紊亂腎損害的重要機(jī)制之一〔16〕。CD36通過(guò)氧化應(yīng)激介導(dǎo)脂肪酸誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡，可能參與糖尿病腎病的過(guò)程〔17〕。CD36在糖尿病腎病中高表達(dá)，高糖能抑制人腎小管上皮細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而沉默CD36的表達(dá)可通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路減弱高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡〔18〕。在近端腎小管上皮細(xì)胞中，CD36介導(dǎo)近端腎小管上皮細(xì)胞的凋亡而導(dǎo)致糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展〔19〕。炎癥應(yīng)激狀態(tài)下腎臟CD36表達(dá)升高，腎功能損害明顯，CD36缺失或被抑制可以改善炎癥應(yīng)激導(dǎo)致的腎損害〔20〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞中CD36高表達(dá)，抑制表達(dá)CD36可保護(hù)高糖刺激的小鼠足細(xì)胞損傷，且過(guò)表達(dá)CD36能逆轉(zhuǎn)miR-99a-3p過(guò)表達(dá)對(duì)高糖刺激小鼠足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

綜上所述，miR-99a-3p可能通過(guò)下調(diào)CD36表達(dá)對(duì)高糖刺激的小鼠足細(xì)胞損傷有保護(hù)作用。