膽固醇結(jié)晶誘導的炎癥及腎臟損害

李溪玥 吳 丹 綜述 曾彩虹 審校

膽固醇結(jié)晶相關(guān)腎損害包括膽固醇結(jié)晶栓塞性腎病和腎小管間質(zhì)膽固醇結(jié)晶相關(guān)損害。動脈粥樣硬化病變早期，膽固醇在動脈內(nèi)皮下的積聚導致泡沫細胞的形成，過量的膽固醇在細胞中積聚可形成膽固醇結(jié)晶。膽固醇結(jié)晶的形成是晚期動脈粥樣硬化斑塊的特征。覆蓋斑塊的纖維帽破裂后，斑塊內(nèi)的膽固醇結(jié)晶暴露在血液循環(huán)中，導致小動脈管腔狹窄或閉塞并激活炎相關(guān)癥因子引發(fā)局部和全身炎癥反應。病變可累及腎臟、皮膚、胃腸道、眼睛、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等，腎臟是膽固醇結(jié)晶栓塞的常見靶器官。腎小管膽固醇晶體和腎間質(zhì)膽固醇肉芽腫也并不少見，但具體機制尚缺乏深入研究。本文擬簡介膽固醇在細胞內(nèi)代謝過程，動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)膽固醇結(jié)晶形成原因，膽固醇結(jié)晶誘導炎癥的細胞和分子機制和其對腎臟損害的表現(xiàn)。

細胞內(nèi)膽固醇代謝

膽固醇是哺乳動物細胞膜的重要脂質(zhì)成分，可維持膜的完整性和流動性，脂質(zhì)筏是富含膽固醇和鞘磷脂的一種特殊膜結(jié)構(gòu)，膜流動性更低。膽固醇的合成、攝取、外排、轉(zhuǎn)化、酯化和運輸由復雜的網(wǎng)絡維持。細胞內(nèi)膽固醇含量主要受羥甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG-CoA)活性和細胞從循環(huán)中攝取脂質(zhì)速率的影響。HMG-CoA是膽固醇合成的限速酶，胞內(nèi)膽固醇過載時該酶則受到抑制。膽固醇在血漿中主要以與極低密度脂蛋白(VLDL)及低密度脂蛋白(LDL)結(jié)合成膽固醇酯(ESC)的形式存在。膽固醇酯與細胞膜上的LDL受體(LDLR)、清道夫受體B族I型(SR-BI)、和CD36等受體結(jié)合后內(nèi)吞進入細胞，經(jīng)溶酶體酶解后，上述受體返回細胞膜，而ESC進一步水解為游離膽固醇(FC)滯留在細胞內(nèi)，當細胞內(nèi)FC濃度過高時，可通過負反饋調(diào)節(jié)機制降低上述受體的合成以維持細胞內(nèi)正常的膽固醇濃度[1]。膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運即荷脂細胞將膽固醇分泌至細胞外的過程，涉及的主要因子有高密度脂蛋白(HDL)、載脂蛋白AI(ApoAⅠ)、凹陷蛋白、腺苷三磷酸結(jié)合元件A1(ATP binding cassette A1,ABCA1)和SR-BI等。ABCA1是介導膽固醇流出的最重要膜調(diào)控蛋白，可引起細胞表面脂筏的破壞，使細胞表面相關(guān)受體的聚集受到影響，易化炎癥信號傳導。HDL可促進過氧化物酶體增殖劑激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ，PPAR-γ)的磷酸化，從而提高ABCA1的表達進而降低細胞內(nèi)脂質(zhì)含量。

動脈粥樣硬化斑塊中的膽固醇結(jié)晶形成

動脈粥樣硬化斑塊中的脂質(zhì)主要由膽固醇、磷脂以及少量的三酰甘油和脂肪酸組成，膽固醇本身具有形成結(jié)晶的特性，當溶液中的濃度超過其溶解度，則以水化合物的形式析出形成結(jié)晶，體積膨脹。膽固醇的量越多，體積膨脹得越大[2]，而斑塊纖維帽則相應變薄，當纖維帽厚度<65 μm時斑塊可能破裂[3]。斑塊的形成是一個動態(tài)演變過程，在脂肪條紋向纖維斑塊轉(zhuǎn)變期間，膽固醇結(jié)晶開始形成[4]，膽固醇結(jié)晶可在斑塊壞死核心、內(nèi)皮下及巨噬細胞內(nèi)外出現(xiàn)。?；o酶A-膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(ACAT)催化FC和長鏈脂肪酸合成ESC，將FC轉(zhuǎn)化為酯化狀態(tài)，LDL顆粒中的膽固醇以酯化形式存在。斑塊的形成始于膽固醇與LDL顆粒結(jié)合進入動脈壁內(nèi)觸發(fā)免疫反應，募集巨噬細胞到該區(qū)域，并大量攝取酯化膽固醇形成泡沫細胞。ESC在膽固醇酯水解酶(CEH)的作用下水解為FC，F(xiàn)C在動脈壁內(nèi)積聚易形成膽固醇結(jié)晶[5]。酯化和反酯化平衡的破壞會導致泡沫細胞中的ESC/FC的積累。動脈粥樣硬化早期，膽固醇結(jié)晶還可誘導血管內(nèi)皮鈣黏蛋白和α連環(huán)蛋白酪氨酸磷酸化增強，從而破壞血管內(nèi)皮細胞間黏附連接并增加血管通透性。消退素D1(resolvin D1,RvD1)作為一種特異性促炎癥消退介質(zhì)，可以保護內(nèi)皮細胞屏障功能不受膽固醇結(jié)晶破壞[5]。KellnerWeibel等[6]證實抑制ACAT可導致巨噬細胞泡沫細胞質(zhì)膜雙層中膽固醇一水合物晶體的形成。

膽固醇結(jié)晶誘導炎癥反應的細胞分子機制

巨噬細胞表達多種細胞表面受體如C型凝集素受體(CLR)等以識別和內(nèi)化致病性顆粒。CLR是一種新發(fā)現(xiàn)的模式識別受體家族，可識別病原體啟動先天性免疫應答。人巨噬細胞誘導型C型凝集素受體(hMincle)是在活化的巨噬細胞和樹突狀細胞上表達的CLR。Kiyotake等[7]研究證實hMincle有一個膽固醇識別氨基酸序列(CRAC)，通過該序列，膽固醇結(jié)晶與巨噬細胞表面的hMincle結(jié)合，從而引發(fā)先天免疫反應。hMincle通過與FcRγ鏈[一種基于免疫受體酪氨酸激活序列(ITAM)的接頭蛋白]偶聯(lián)以激活免疫細胞。有研究證明巨噬細胞和樹突狀細胞內(nèi)膽固醇晶體可激活Nod樣受體蛋白3(NLRP3)[30]。

補體通過感知危險、傳遞危險信號及觸發(fā)細胞碎片的清除，在體內(nèi)平衡中發(fā)揮重要作用。膽固醇結(jié)晶可被補體系統(tǒng)的凝集素途徑和經(jīng)典途徑識別，從而激活C3和C5并釋放炎性介質(zhì)C5a片段。補體被膽固醇結(jié)晶激活后，與NLRP3炎癥小體-caspase-1信號通路產(chǎn)生串擾并產(chǎn)生白細胞介素1β(IL-1β)。體外實驗表明,膽固醇結(jié)晶可通過與甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)和纖維膠凝蛋白2(ficolin-2)結(jié)合激活凝集素途徑，從而導致補體激活產(chǎn)物的沉積[8-9]。在膽固醇結(jié)晶誘導的補體激活過程中，凝集素途徑和經(jīng)典途徑有協(xié)同作用。膽固醇結(jié)晶對補體的強大激活潛能可將免疫細胞招募到斑塊中促進膽固醇結(jié)晶形成，從而導致局部炎癥。補體在細胞碎片和巨噬細胞聚集的區(qū)域與膽固醇結(jié)晶結(jié)合，吸引更多的免疫細胞進入膽固醇結(jié)晶[10]。膽固醇結(jié)晶啟動補體激活途徑后可釋放促炎細胞因子如腫瘤壞死因子(TNF)和IL-1β。在人類全血模型中C5aR1拮抗劑對膽固醇結(jié)晶誘導的TNF和IL-1β有很強的抑制作用[11]，由此可見C5a在這一反應中起主要作用。

嗜中性粒細胞和單核細胞衍生的巨噬細胞具有共同的造血祖先髓樣細胞，它們具有共同和獨特的免疫功能。當組織損傷或感染時，中性粒細胞首先浸潤，隨后是單核細胞。Brinkmann等[12]在2004年發(fā)現(xiàn)中性粒細胞壞死或者凋亡后，可釋放一種網(wǎng)狀物質(zhì)來捕獲、殺滅細菌，他們將其命名為中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular trap，NET)[12],這一過程命名為NET凋零[12]。NET包含DNA、組蛋白、嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和髓過氧化物酶。晶體顆粒以受體相互作用蛋白1-受體相互作用蛋白3-混合系激酶區(qū)域樣蛋白(RIPK1-RIPK3-MLKL)依賴的方式觸發(fā)中性粒細胞壞死進而釋放NET[13]。Warnatsch等[14]證明,細胞外膽固醇晶體與中性粒細胞相互作用觸發(fā)NETs的釋放，引發(fā)巨噬細胞產(chǎn)生炎性細胞因子IL-1β的前體(pro-IL-1β)。除了激活NETosis外，與巨噬細胞表面CD36蛋白結(jié)合的膽固醇可通過內(nèi)吞作用被內(nèi)化并激活炎癥小體信號復合物。炎癥小體通過caspase-1裂解pro-IL-1β促進IL-1β的成熟并釋放到胞外發(fā)揮其生物學效應[14]。

NLRP3炎癥小體是由NLRP3亞基、與凋亡相關(guān)的斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC)和無活性的caspase-1前體組成的蛋白復合物。NLRP3亞基由亮氨酸富集結(jié)構(gòu)域(LRR)、Nod結(jié)構(gòu)域和熱結(jié)構(gòu)域(PYD) 或caspase募集結(jié)構(gòu)域(CARD)組成，可識別配體、介導自身聚集反應及轉(zhuǎn)導下游信號。在受到刺激時，NLRP3炎癥小體通過NLRP3-ASC-caspase-1-IL-1β/IL-18 軸的逐級活化在炎癥免疫性疾病過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。目前研究表明有多種不同的炎癥小體激活機制，包括鉀外排、鈣內(nèi)流、線粒體功能障礙、線粒體活性氧的產(chǎn)生、線粒體DNA或心磷脂的釋放、溶酶體的不穩(wěn)定和破裂[15]。已證明NLRP3炎癥小體對膽固醇結(jié)晶等刺激有應答。NLRP3炎癥小體發(fā)揮作用需要雙重信號的刺激，第一信號為預刺激信號，通過活化MAPK和核因子κB(NF-κB)信號途徑而上調(diào)NLRP3和 IL-1β、IL-18 前體的表達；第二信號又稱活化信號，NLR的寡聚化及變構(gòu)進而募集 ASC，活化 caspase-1促使pro-IL-1β活化為IL-1β并釋放[16]。IL-1β是一種強有力的促炎細胞因子，是動脈粥樣硬化的主要致病細胞因子，并與疾病的嚴重程度有關(guān)[17]。IL-1β通過減少ABCA1的表達抑制膽固醇向細胞外流出,從而提高細胞內(nèi)膽固醇的濃度。在NLRP3基因敲除的糖尿病腎病小鼠模型研究中，敲除鼠的腎小管上皮細胞的空泡變性輕于對照組，提示NLRP3可增加細胞脂質(zhì)負載[18]。有研究表明，被吞噬的顆粒導致溶酶體膜破裂后可引起NLRP3激活和細胞死亡[19-20]。針對組織蛋白酶b的特異性抑制劑可抑制NLRP3活化所致的細胞死亡和IL-1β分泌[21-23]。目前還發(fā)現(xiàn)了多種組織蛋白參與IL-1β產(chǎn)生，并促進pro-IL-1β的合成和NLRP3依賴的pro-IL-1β的活化[24]。

動脈粥樣斑塊破裂后，針對動脈內(nèi)膜損傷，淋巴細胞局部反應性產(chǎn)生IL-6，IL-6循環(huán)到肝臟啟動超敏C反應蛋白的合成，從而導致全身炎癥反應[25]，可出現(xiàn)貧血、血小板減少、白細胞增多、紅細胞沉降率高、 C反應蛋白水平升高、低補體血癥等。

膽固醇結(jié)晶栓塞性腎病

主動脈或其他大動脈的動脈粥樣斑塊破裂后，膽固醇結(jié)晶暴露于血液循環(huán)中并向下游血管床沖淋，引起動脈遠端栓塞即稱為膽固醇晶體栓塞或稱動脈粥樣硬化栓塞，導致遠端組織的缺血和梗死。膽固醇晶體栓塞可能自發(fā)，但通常由動脈造影或血管內(nèi)手術(shù)操作引起的醫(yī)源性誘因所致。膽固醇晶體栓塞作為一種多系統(tǒng)疾病，可累及腎臟、皮膚、胃腸道、眼睛、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等多臟器，腎臟血流動力學的特性使其成為最易受累的器官。膽固醇結(jié)晶常阻塞弓形動脈和葉間動脈，從而導致整個腎單位的皮質(zhì)區(qū)域缺血，造成腎損傷、腎功能下降，出現(xiàn)膽固醇晶體栓塞性腎病。膽固醇結(jié)晶栓塞性腎病臨床表現(xiàn)分為急性、亞急性和慢性。急性、亞急性形式表現(xiàn)為腎功能突然下降，由不穩(wěn)定斑塊突然破裂后大量膽固醇晶體栓子堵塞到腎小動脈所致。慢性膽固醇結(jié)晶栓塞性腎病臨床起病緩慢，與破裂的斑塊內(nèi)膽固醇晶體頻繁而緩慢的遷移有關(guān)。當腎臟發(fā)生小的膽固醇晶體栓塞時，患者可不出現(xiàn)臨床癥狀。慢性膽固醇晶體栓塞性腎病與其他慢性腎臟疾病(如慢性腎小球硬化、高血壓性腎硬化)的癥狀相似，僅依據(jù)臨床鑒別診斷較為困難，需腎活檢進一步明確。皮膚表現(xiàn)是膽固醇結(jié)晶栓塞最常見的臨床癥狀，如網(wǎng)狀青斑、壞疽、藍腳趾綜合癥等。當出現(xiàn)特征性的藍腳趾綜合癥時，臨床上需考慮可能累及腎臟損傷。

腎小管間質(zhì)與膽固醇結(jié)晶

細胞膜的流動性主要由膜磷脂和膽固醇構(gòu)建。在培養(yǎng)皿中，晶體可在細胞間緊密連接破壞后附著于腎小管上皮細胞，提示正常細胞膜的極性喪失可能是晶體-膜相互作用所需的條件[26]。Hirose等[27]最近研究草酸鈣晶體形成早期腎小管細胞的超微結(jié)構(gòu)變化，因氧化應激和脂質(zhì)過氧化，使線粒體表現(xiàn)為空泡化、脂質(zhì)變化和鈣化，隨后可在腎小管管腔中觀察到晶核形成。人腎小管上皮細胞株HK-2在高糖培養(yǎng)下可出現(xiàn)膽固醇蓄積現(xiàn)象[28]。

在腎臟活檢標本中可觀察到在腎小管或腎動脈內(nèi)膽固醇結(jié)晶表現(xiàn)為狹長、兩頭尖、腰部凸的梭形空隙[29]。1985 年Nast等[30]在5例腎病綜合征患者腎活檢標本中觀察到腎間質(zhì)中膽固醇肉芽腫形成，認為其與腎小管膽固醇晶體之間存在聯(lián)系。上述5例患者腎小管細胞中均含有脂滴，因此他們認為膽固醇晶體最初可能來源于腎小管上皮內(nèi)的脂質(zhì)。膽固醇或ESC在腎小管上皮細胞內(nèi)持續(xù)沉積可能導致胞內(nèi)膽固醇晶核的形成。尿液中的膽固醇過飽和也可能形成小的膽固醇結(jié)晶。當上皮細胞內(nèi)較大的晶體形成后可在其臨近管腔內(nèi)也發(fā)現(xiàn)膽固醇結(jié)晶。目前關(guān)于細胞內(nèi)晶體釋放到管腔內(nèi)的機制尚未明確，而膽固醇結(jié)晶一旦從上皮細胞內(nèi)進入管腔，晶體在管腔內(nèi)可進一步擴大伸長或者隨尿液排出。針狀的膽固醇結(jié)晶達到一定的長度后可以在腎小管某個位置被卡住，尖銳邊緣可以扭曲破壞腎小管上皮細胞，并穿透基膜，隨后暴露于間質(zhì)單核細胞形成膽固醇肉芽腫(圖1)。此后有關(guān)腎小管中膽固醇結(jié)晶的相關(guān)報道極少。Hu等[31]研究表明，炎癥通過上調(diào)血清CXC趨化因子配體16途徑促進了腎小管間質(zhì)中脂質(zhì)的蓄積并導致腎小管間質(zhì)損傷。

圖1 膽固醇結(jié)晶誘導腎臟損害的機制

針狀的膽固醇結(jié)晶在腎小管腔中逐漸增大后陷入腎小管上皮細胞最終刺破腎小管基膜后引發(fā)巨噬細胞、淋巴細胞介導的炎癥反應，腎間質(zhì)成纖維細胞激活轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細胞。

小結(jié)：脂質(zhì)代謝紊亂造成膽固醇蓄積進而形成結(jié)晶誘發(fā)炎癥，可導致多種疾病的發(fā)生和進展。膽固醇穩(wěn)態(tài)通常由膽固醇流入和膽固醇外排途徑控制，一旦膽固醇穩(wěn)態(tài)被破壞，隨著膽固醇或ESC的持續(xù)沉積，細胞內(nèi)膽固醇過飽和可形成膽固醇結(jié)晶，引起單核吞噬細胞等介導的炎癥反應，炎癥應激也可反向誘導脂質(zhì)蓄積而加劇腎臟損傷。腎臟疾病伴脂質(zhì)代謝異常的患者在臨床并不少見，腎病綜合征中腎小管膽固醇結(jié)晶也并非罕見的病理改變。因此,在臨床診治過程中應予以重視,尤其是腎小管內(nèi)的膽固醇結(jié)晶，以便早期發(fā)現(xiàn)早期診治。