人源抗c-Met抗體與rAGAP偶聯(lián)物對卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響

馮 恬，龔丹丹，王露瑤，王怡雯，周婷婷，朱 進，張慧林*，童 華*

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院婦科，江蘇 南京 210004；2東部戰(zhàn)區(qū)疾病預(yù)防控制中心，江蘇 南京 210002

卵巢癌作為最常見的婦科惡性腫瘤之一，是婦科惡性腫瘤死亡的主要原因［1］。盡管減瘤手術(shù)、鉑類為主的化學(xué)療法、免疫療法等多種治療方法取得了一定進步，但早期診斷困難、化療耐藥、復(fù)發(fā)率高、預(yù)后不良等一系列問題仍然困擾著相關(guān)醫(yī)療工作者［2］。因此，人們急需研究出一種能夠有效改善卵巢癌患者治療效果特別是減少化療耐藥發(fā)生的治療方法［3］?？贵w藥物偶聯(lián)物（antibody drug conjugate，ADC）是將毒素或藥物與單克隆抗體偶聯(lián)的一種靶向療法，它可以作為一種新型的靶向療法應(yīng)用于卵巢癌的治療，將細(xì)胞毒性藥物傳遞至癌細(xì)胞，降低對正常組織細(xì)胞毒性的同時，增強疏水化合物的溶解度和延長血漿半衰期，以發(fā)揮抗腫瘤的活性［4-5］。

作為ADC的關(guān)鍵成分之一的單克隆抗體，需要高度選擇性地作用于靶細(xì)胞上的抗原，研究表明c-Met 在60%的卵巢癌患者腫瘤中呈過表達(dá)，與卵巢癌發(fā)生以及預(yù)后相關(guān)［6］。c-Met 是由MET 原癌基因編碼，通過二硫鍵連接的由高度糖基化的50 kDa α亞基和跨膜145 kDa β亞基組成的異二聚體［7］。c-Met與配體肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）結(jié)合后被激活，通過觸發(fā)下游磷酸肌醇3-激酶（PI3K）/Akt通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲［8-9］。因此，可以通過靶向c-Met阻斷HGF和c-Met間的相互作用達(dá)到有效治療卵巢癌的目的［10］。另外，蝎毒對某些腫瘤具有顯著的防治作用，其有效組分在癌癥治療方面已取得了顯著效果［11］。東亞鉗蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤多肽（analgesic-antitumor peptide，AGAP）是從蝎毒多肽中分離出來的一種毒素，不僅具有鎮(zhèn)痛作用，還能對膽管細(xì)胞癌［12］、肝癌［13］、腦膠質(zhì)瘤［14］、乳腺癌［15］等多種惡性腫瘤起到抑制作用。因此從東亞鉗蝎蝎毒中提取純化出的重組鎮(zhèn)痛抗腫瘤多肽（recombinant analgesic-antitumor peptide，rAGAP）有望成為構(gòu)建ADC的小分子細(xì)胞毒素［16］。

本研究制備人源抗c-Met的全分子抗體（c-Met-IgG1）及其與rAGAP 偶聯(lián)的新型抗體（c-Met-IgG1-rAGAP），分析它們的生物學(xué)特性，檢測其對卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

CHO-S 細(xì)胞、人卵巢癌細(xì)胞系HO8910、人正常卵巢上皮細(xì)胞IOSE386、pMH3質(zhì)粒、抗c-Met抗體的載體及人源抗炭疽保護性抗原PA 抗體（PA-IgG）均由本實驗室提供和保存。CHO懸浮培養(yǎng)基（上海邁邦公司），DMEM 及DMEM/F12 培養(yǎng)基（Gibco 公司，美國），限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、NoTⅠ（Invitrogen 公司，美國），T4 連接酶（Takara 公司，日本），電轉(zhuǎn)杯（Bio-rad公司，美國），0.22微米濾膜（Millipore公司，美國），Protein A 親和純化柱（GE 公司，美國），重組人c-Met蛋白（R＆D公司，美國），HRP標(biāo)記抗人Fab和FITC 標(biāo)記抗人Fc 的特異性抗體（Sigma 公司，美國），CCK8試劑盒（Dojindo公司，日本），Transwell小室（Corning 公司，美國），DAPI、結(jié)晶紫染液（上海碧云天公司），G418硫酸鹽、DH5α（上海生工公司）。

1.2 方法

1.2.1 c-Met-IgG1-rAGAP真核表達(dá)載體的構(gòu)建

為制備c-Met-IgG1-rAGAP 真核表達(dá)載體，首先，以pUC57-c-Met-IgG1-rAGAP 載體為模板，PCR擴增獲得與rAGAP 基因相偶聯(lián)的輕鏈（c-Met-IgG1-L-rAGAP）編碼序列，NoTⅠ和EcoRⅠ雙酶切后與同樣雙酶切的pMH3 載體相連，轉(zhuǎn)化DH5α，通過NoTⅠ和EcoRⅠ雙酶切和測序鑒定陽性克隆，從而成功構(gòu)建pMH3-c-Met-IgG1-L-rAGAP真核表達(dá)載體。

1.2.2 c-Met-IgG1和c-Met-IgG1-rAGAP的表達(dá)和鑒定

通過電轉(zhuǎn)染將重鏈和輕鏈真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)進CHO-S 細(xì)胞，以含G418 硫酸鹽的DMEM/F12 培養(yǎng)基進行篩選，通過Dot blot和亞克隆篩選高效表達(dá)抗體的細(xì)胞株，將培養(yǎng)定株的細(xì)胞重懸，收集細(xì)胞上清液，用0.22 μm 濾膜過濾收集細(xì)胞上清液，AKTA 蛋白純化系統(tǒng)和Protein A 親和層析柱純化；用SDS-PAGE 檢測c-Met-IgG1 和c-Met-IgG1-rAGAP 的目的蛋白。

1.2.3 c-Met-IgG1和c-Met-IgG1-rAGAP生物學(xué)特性分析

實時熒光定量PCR（qRT-PCR）：培養(yǎng)HO8910、IOSE386至對數(shù)生長期，利用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，測量調(diào)整RNA濃度，然后應(yīng)用PCR擴增儀將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，10 μL cDNA稀釋4倍，將其作為qRT-PCR模板。qRT-PCR反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為94 ℃5 s；60 ℃15 s，60 ℃15 s，72 ℃30 s，40 次循環(huán)；每個樣品均設(shè)3個復(fù)孔，記錄Ct值。c-Met的mRNA 相對表達(dá)量根據(jù)2-△△Ct方法分析計算，GAPDH用作內(nèi)部參考。

Western blot：培養(yǎng)HO8910、IOSE386 細(xì)胞至對數(shù)生長期，接種到6 孔板，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，裂解細(xì)胞提取總蛋白，加入蛋白上樣緩沖液后，100 ℃煮15 min，上樣進行蛋白電泳，轉(zhuǎn)NC膜后5%脫脂奶粉溶液封閉1 h，抗c-Met抗體4 ℃孵育過夜，PBST 洗滌后加入HRP 標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，曝光儀曝光。

親和力檢測：將重組人c-Met 抗原用緩沖液Kinetic buffer稀釋至5 μg/mL后在傳感器上固化，再將抗體c-Met-IgG1和c-Met-IgG1-rAGAP分別用緩沖液Kinetic buffer 進行梯度稀釋，各濃度的兩種抗體分別與已固化c-Met 抗原的傳感器進行結(jié)合反應(yīng)，結(jié)合反應(yīng)時間為240 s。待結(jié)合反應(yīng)完成后，將傳感器轉(zhuǎn)入Kinetic buffer 緩沖液進行解離，解離時間為900 s。最后將實驗數(shù)據(jù)導(dǎo)入軟件（DATA Analysis HT 12.0）進行分析。

免疫熒光：將HO8910和IOSE386細(xì)胞培養(yǎng)在6孔板中，細(xì)胞匯合度為80%時，用4%多聚甲醛4 ℃固定20 min，5%脫脂奶粉溶液封閉1 h 后分別用兩種抗體孵育2 h，再用羊抗人IgG1-FITC 抗體避光孵育1 h，DAPI 染液染核20 min 后用LSM 800 激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。

流式細(xì)胞術(shù)：將HO8910 和IOSE386 細(xì)胞，消化重懸計數(shù)，每管計數(shù)細(xì)胞5×105個，將每種細(xì)胞分為4組，分別為PBS組、FITC組、c-Met-IgG1組及c-Met-IgG1-rAGAP 組。5%脫脂奶粉溶液37 ℃溫箱封閉1 h 后，依次加入PBS、PBS、c-Met-IgG1、c-Met-IgG1-rAGAP 后37 ℃溫箱孵育1 h，之后向PBS 組加入PBS，其余組都加入FITC 標(biāo)記Fc 特異性的羊抗人IgG1，室溫避光孵育1 h 后洗滌，150 μL PBS 重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測分析。

1.2.4 c-Met-IgG1和c-Met-IgG1-rAGAP對卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響

CCK-8實驗：將HO8910細(xì)胞及IOSE386細(xì)胞消化重懸后按每孔8×103個細(xì)胞數(shù)鋪96 孔板，c-Met-IgG1、c-Met-IgG1-rAGAP 和PA-IgG 分別設(shè)置5 個濃度梯度：0、25、50、100、200 μg/mL，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔。37 ℃5%CO2孵箱中培養(yǎng)48 h。實驗結(jié)束時棄去原培養(yǎng)基，向每孔加入100 μL DEME培養(yǎng)基和10 μL CCK8，37 ℃孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度值。

劃痕實驗：將HO8910 細(xì)胞和IOSE386 細(xì)胞分別接種到24 孔板培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度為80%，用200 μL 移液管徑直劃出1 條直線，PBS 洗滌后分別用200 μg/mL c-Met-IgG1和c-Met-IgG1-rAGAP處理，并于0 h、24 h、48 h在顯微鏡下拍照、測量。

Transwell 侵襲實驗：將HO8910 和IOSE386 細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，每種細(xì)胞PBS 組、c-Met-IgG1、c-Met-IgG1-rAGAP。向小室中加入200 μL 細(xì)胞懸液，并于下室中加入600 μL含15%FBS的培養(yǎng)基，37 ℃5%CO2孵箱中培養(yǎng)48 h。用4%多聚甲醛固定下室30 min，結(jié)晶紫染色20 min后，用棉簽擦去上室中未穿過的細(xì)胞，在顯微鏡下觀察、拍片和計數(shù)分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用Stata 12.0 和Graphpad 5.0 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組樣本均數(shù)間比較采用配對t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組c-Met-IgG1 和c-Met-IgG1-rAGAP 真核表達(dá)載體的構(gòu)建

凝膠電泳鑒定結(jié)果顯示：c-Met-IgG1-H、c-Met-IgG1-L、c-Met-IgG1-rAGAP-L 基因的大小分別為1 500 bp、750 bp、900 bp，與預(yù)期結(jié)果相符。將目的條帶分別與線性化的pMH3質(zhì)粒相連接完成真核表達(dá)載體的構(gòu)建（圖1）。將重組后的真核表達(dá)載體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入DH5α，通過NoTⅠ和EcoRⅠ雙酶切篩選出陽性克隆送公司測序，證實與設(shè)計序列完全相同。

圖1 c-Met-IgG1 和c-Met-IgG1-rAGAP 真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定Figure 1 Construction and identification of recombinant c-Met-IgG1 and c-Met-IgG1-rAGAP eukaryotic expression vectors

2.2 c-Met-IgG1和c-Met-IgG1-rAGAP的表達(dá)與純化

將c-Met-IgG1和c-Met-IgG1-rAGAP的重組質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)染CHO-S 細(xì)胞，用含G418 硫酸鹽的DMEM/F12 培養(yǎng)基篩選獲得陽性細(xì)胞，經(jīng)Dot blot及亞克隆篩選出能夠高效表達(dá)抗體的單克隆細(xì)胞株（圖2A）。將定株的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)以收集細(xì)胞上清，用Protein A 柱純化，獲得c-Met-IgG1 和c-Met-IgG1-rAGAP 兩種抗體。將上清液、流穿液及純化所得的抗體進行SDS-PAGE 凝膠電泳，結(jié)果顯示純化后的抗體條帶大小與預(yù)期相符且無明顯雜帶（圖2B）。

圖2 c-Met-IgG1和c-Met-IgG1-rAGAP的純化與鑒定Figure 2 Purification and identification of c-Met-IgG1 and c-Met-IgG1-rAGAP

2.3 c-Met-IgG1 和c-Met-IgG1-rAGAP 生物學(xué)特性分析

2.3.1 c-Met-IgG1、c-Met-IgG1-rAGAP的親和力測定

重組人c-Met 抗原用緩沖液Kinetic buffer 稀釋后在傳感器上固化，將c-Met-IgG1、c-Met-IgG1-rAGAP抗體梯度稀釋后與其反應(yīng)，結(jié)果顯示，c-Met-IgG1和c-Met-IgG1-rAGAP與重組人c-Met抗原結(jié)合的親和力分別為5.607×10-8mol/L（圖3A）和8.389×10-8mol/L（圖3B）。

圖3 c-Met-IgG1及c-Met-IgG1-rAGAP與重組人c-Met抗原的親和力檢測Figure 3 Affinity detection of c-Met-IgG1 and c-Met-IgG1-rAGAP with recombinant human c-Met antigen

2.3.2 qRT-PCR檢測卵巢癌細(xì)胞c-Met mRNA的表達(dá)

根據(jù)RNA 提取試劑盒說明書提取HO8910、IOSE386細(xì)胞總RNA后分別逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用qRTPCR 方法檢測細(xì)胞中c-Met 的mRNA 表達(dá)水平。qRT-PCR 分析顯示，HO8910 細(xì)胞中的c-Met mRNA明顯高于IOSE386細(xì)胞（圖4）。

圖4 qRT-PCR 檢測卵巢癌細(xì)胞c-Met mRNA的表達(dá)Figure 4 Detection of c-Met mRNA expression in ovarian cancer cells by qRT PCR

2.3.3 Western blot 檢測卵巢癌細(xì)胞c-Met蛋白的表達(dá)

c-MET 陽性的HO8910 細(xì)胞可檢測到c-Met 蛋白的前體（170 kDa）和成熟體（140 kDa），而未在IOSE386 細(xì)胞中檢測到c-Met蛋白（圖5）。

圖5 Western blot檢測卵巢癌細(xì)胞c-Met的表達(dá)Figure 5 Dectection of c-Met exprssion in ovarian cancer cells by Western Blot

2.3.4 免疫熒光檢測

共聚焦顯微鏡下觀察本研究制備的c-Met-IgG1和c-Met-IgG1-rAGAP 與細(xì)胞的結(jié)合特性及其在細(xì)胞中的定位。結(jié)果顯示c-Met-IgG1 和c-Met-IgG1-rAGAP 可以與細(xì)胞膜上c-Met 蛋白特異性結(jié)合（圖6）。

圖6 免疫熒光檢測c-Met-IgG1及c-Met-IgG1-rAGAP與細(xì)胞的特異性結(jié)合（×100）Figure 6 The specific binding of c-Met-IgG1 and c-MET-IgG1-rAGAP with cells surface by immuofluorescence microscopy（×100）

2.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測c-Met-IgG1 和c-Met-IgG1-rAGAP與抗原的結(jié)合能力

流式細(xì)胞術(shù)檢測c-Met-IgG1 和c-Met-IgG1-rAGAP 對c-Met 陽性細(xì)胞的特異性結(jié)合能力。結(jié)果顯示，經(jīng)過c-Met-IgG1 和c-Met-IgG1-rAGAP 分別處理后，HO8910細(xì)胞檢測到的熒光強度大于IOSE386細(xì)胞，顯示c-Met-IgG1 和c-Met-IgG1-rAGAP 可特異性結(jié)合到c-Met陽性的HO8910的細(xì)胞膜上，而不與幾乎不表達(dá)c-Met蛋白的IOSE386細(xì)胞結(jié)合（圖7）。

圖7 流式細(xì)胞術(shù)檢測c-Met-IgG1及c-Met-IgG1-rAGAP能特異性結(jié)合于卵巢癌細(xì)胞膜Figure 7 Specific binding of c-Met-IgG1 and c-Met-IgG1-rAGAP to ovarian cancer cells detected by flow cytometry

2.4 體外評估c-Met-IgG1 和c-Met-IgG1-rAGAP 對卵巢癌細(xì)胞惡性行為的影響

2.4.1 c-Met-IgG1和c-Met-IgG1-rAGAP對細(xì)胞增殖能力的影響

CCK-8 結(jié)果顯示，c-Met-IgG1 和c-Met-IgG1-rAGAP 對卵巢癌細(xì)胞的增殖均有抑制作用，且在相同濃度下，c-Met-IgG1-rAGAP 抑制HO8910 細(xì)胞增殖的能力要高于c-Met-IgG1，而這兩種抗體對IOSE386 細(xì)胞增殖的影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義。另外，陰性對照PA-IgG 對IOSE386 和HO8910 這兩種細(xì)胞增殖的影響差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（圖8）。

圖8 CCK-8實驗檢測c-Met-IgG1、c-Met-IgG1-rAGAP和PA-IgG對卵巢癌細(xì)胞增殖的抑制作用Figure 8 Effect of anti-tumor cytotoxicity of c-Met-IgG1，c-Met-IgG1-rAGAP and PA-IgG on proliferation of ovarian cancer cells detected by CCK-8 test

2.4.2 c-Met-IgG1和c-Met-IgG1-rAGAP對細(xì)胞遷移的影響

200 μg/mL 的c-Met-IgG1 和c-Met-IgG1-rAGAP分別處理細(xì)胞，結(jié)果顯示（圖9）：細(xì)胞劃痕48 h 后，HO8910細(xì)胞組中，PBS組的劃痕愈合率為63.69%，c-Met-IgG1 組劃痕愈合率為51.17%，c-Met-IgG1-rAGAP組細(xì)胞劃痕愈合率為38.44%。表明兩種抗體對HO8910 細(xì)胞的遷移能力均有抑制作用，且c-Met-IgG1-rAGAP 對細(xì)胞遷移的抑制作用要高于c-Met-IgG1 組（P＜0.05）。而在IOSE386 細(xì)胞中，不同處理的細(xì)胞遷移率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖9 劃痕實驗檢測c-Met-IgG1和c-Met-IgG1-rAGAP對卵巢癌細(xì)胞遷移的抑制作用Figure 9 c-Met-IgG1 and c-Met-IgG1-rAGAP inhibited the migration of ovarian cancer cells detected by wound healing assay

2.4.3 c-Met-IgG1和c-Met-IgG1-rAGAP對細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell 侵襲實驗結(jié)果顯示，200 μg/mL 的c-Met-IgG1 和c-Met-IgG1-rAGAP 分別處理48 h 后，HO8910 細(xì)胞中經(jīng)抗體處理的細(xì)胞侵襲數(shù)均低于PBS組（P＜0.05），且c-Met-IgG1-rAGAP抑制細(xì)胞穿膜的作用比c-Met-IgG1 明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而在IOSE386 細(xì)胞中，不同處理組細(xì)胞侵襲數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖10）。

圖10 Transwell侵襲實驗檢測c-Met-IgG1和c-Met-IgG1-rAGAP對卵巢癌細(xì)胞侵襲的抑制作用Figure 10 The inhibition of the invasion of IgG1-AGAP and Met-IgG1 to ovarian cancer cells by Transwell migration assay

3 討論

c-Met 是異二聚體受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinases，RTK）亞家族的成員，并且是HGF的受體［17］。HGF與其配體c-Met的結(jié)合可誘導(dǎo)多種復(fù)雜的信號通路，促進腫瘤細(xì)胞的惡性行為［18］。另外，在癌細(xì)胞耐藥機制研究中還發(fā)現(xiàn)c-Met 可與各種膜受體間發(fā)生交叉作用，而且與吉非替尼和厄洛替尼等多種酪氨酸激酶抑制劑的耐藥發(fā)生有關(guān)［19］。此外，c-Met 作為新的腫瘤治療靶點已經(jīng)應(yīng)用于肝癌［20］、腦腫瘤［21］、鼻咽癌等多種惡性腫瘤的實驗研究。本研究是在前期實驗室制備的全分子人源化抗c-Met 抗體的基礎(chǔ)上，將抗體與抗腫瘤藥物蝎毒素相偶聯(lián)，研究其對卵巢癌細(xì)胞的惡性行為的抑制效果。本研究通過構(gòu)建c-Met-IgG1 和c-Met-IgG1-rAGAP真核表達(dá)載體，電轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞后篩選出穩(wěn)定表達(dá)兩種抗體的細(xì)胞株，經(jīng)AKTA 蛋白純化系統(tǒng)純化得到抗體。細(xì)胞免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)證實兩種抗體均可與c-Met 陽性細(xì)胞系細(xì)胞膜上的c-Met 蛋白選擇性結(jié)合。CCK-8 實驗顯示c-Met-IgG1和c-Met-IgG1-rAGAP 對卵巢癌細(xì)胞的增殖均有抑制效果，且融合了rAGAP的新型抗體對細(xì)胞增殖的抑制效果更明顯。劃痕實驗和Transwell 侵襲實驗比較了兩種抗體對卵巢癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響，研究結(jié)果表明在相同濃度下，c-Met-IgG1-rAGAP組的細(xì)胞愈合率更低，且小室中腫瘤細(xì)胞遷移數(shù)量更少，這些都表明了與c-Met-IgG1相比，偶聯(lián)了細(xì)胞毒素rAGAP 的新型抗體對卵巢癌細(xì)胞的惡性行為具有更明顯的抑制作用。ADC 作為一種新型的抗腫瘤靶向藥物，將細(xì)胞毒性分子與腫瘤細(xì)胞靶向抗體結(jié)合在一起，從而將化療藥物選擇性遞送至腫瘤細(xì)胞，增加了細(xì)胞毒性藥物的治療范圍且減少藥物不良反應(yīng)，目前已經(jīng)是臨床上腫瘤治療研究的一個重要方向［20］，本研究中抗體融合蛋白c-Met-IgG1-rAGAP 既保留了c-Met-IgG1 的靶向特性，又將蝎毒肽集中在腫瘤部位發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，會減輕藥物對其他正常組織的損傷。綜上所述，未來該抗體可能會在c-Met 陽性腫瘤的疾病診斷、靶向治療中發(fā)揮重要價值。