銀質(zhì)針對大鼠肩袖岡上肌骨-肌腱結(jié)合部位損傷的修復(fù)作用

趙智龍,丁國萍,胡 媛,王芙蓉,馬維斌,時(shí) 沛,歐陽簽

肩袖是維持肩關(guān)節(jié)穩(wěn)定和活動(dòng)的主要解剖結(jié)構(gòu)，肩袖損傷可導(dǎo)致肩關(guān)節(jié)疼痛與功能障礙，嚴(yán)重影響患者的生活及工作質(zhì)量[1-2]。隨著人口老齡化加劇，肩袖疾病逐漸發(fā)展已成為人們一種主要的醫(yī)療和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。岡上肌為肩袖的結(jié)構(gòu)組織之一，也是最易受損的肩袖肌結(jié)構(gòu)[4]。西醫(yī)治療肩袖損傷的方法以消炎止痛、關(guān)節(jié)鏡等為主，但存在只緩解癥狀并不能醫(yī)治其根本，毒副作用較多，手術(shù)收費(fèi)昂貴且術(shù)后并發(fā)癥嚴(yán)重等不足[5]。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為肩袖損傷是由于風(fēng)寒痹阻、氣滯血瘀后不通則痛而發(fā)病，治療時(shí)應(yīng)祛風(fēng)散寒、活血化瘀、疏通經(jīng)絡(luò)。研究發(fā)現(xiàn)，針灸推拿在治療肩袖損傷方面具有一定的優(yōu)勢[5]。銀質(zhì)針療法是一種經(jīng)改良后的特殊針灸療法，在臨床上多用于治療各種原因?qū)е碌奶弁?，具有消炎止痛的功效[6]。但關(guān)于銀質(zhì)針對肩袖岡上肌損傷的研究卻少有報(bào)道，因此，本研究通過構(gòu)建SD大鼠肩袖岡上肌骨-肌腱結(jié)合部位損傷來模仿人體肩袖岡上肌損傷，采用銀質(zhì)針進(jìn)行修復(fù)治療，觀察其效果，以期為銀質(zhì)針治療肩袖損傷提供一定的基礎(chǔ)研究資料。

1 資料與方法

1.1 一般資料：本研究于2019年12月-2020年1月在武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。選擇39只SPF級(jí)雄性SD大鼠，6周齡，體質(zhì)量180～220 g，來源于遼寧長生生物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：1107261911000185。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(鄂)2018-0104，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度為22～26 ℃，相對濕度為50%～60%，人工光照明暗各12 h。

1.2 試劑與儀器：戊巴比妥鈉購自Sigma(貨號(hào)：P3761)；蘇木精、伊紅染液購自北京雷根生物技術(shù)有限公司(貨號(hào)：DH0010、DH0045)；大鼠白細(xì)胞介素6(IL-6)ELISA試劑盒、大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒購自武漢貝茵萊生物科技有限公司(貨號(hào)：RA20607、RA20035)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所(貨號(hào)：A003-1、A001-1)。0.30×40無菌銀質(zhì)針購自北京科苑達(dá)醫(yī)療用品廠；微型電鉆購自韓國世新；石蠟切片機(jī)購自杭州艾普儀器設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組與造模：將39只SD大鼠分為3組，其中正常組3只，模型組18只，治療組18只。正常組大鼠進(jìn)行正常飼養(yǎng)，模型組和治療組大鼠均構(gòu)建肩袖岡上肌損傷模型：采用2%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射大鼠進(jìn)行麻醉，剪除大鼠左肩部毛發(fā)，在肩胛骨下緣切2～3 cm橫行皮膚切口，顯露出肱骨頭。將岡上肌腱骨-肌腱結(jié)合部位切斷，用微型電鉆在原岡上肌附著處建立2個(gè)平行的骨性隧道，采用縫合線穿過骨道將岡上肌腱縫合在原位[7]。逐層縫合切口后，進(jìn)行正常飼養(yǎng)。治療組在造模后第12天開始進(jìn)行銀質(zhì)針治療：采用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，俯臥位放置于手術(shù)板上，前肢屈曲放于頭兩側(cè)，左肩關(guān)節(jié)近肱骨頭區(qū)均勻涂抹耦合劑，避開皮膚切口處，給予銀質(zhì)針治療，1周治療1次。分別于治療1、2、4周后選取大鼠(正常組1只，模型組6只，治療組6只)，采用戊巴比妥鈉過量麻醉致死，收集大鼠左肩骨-肌腱結(jié)合部位組織，進(jìn)行組織學(xué)觀察及實(shí)驗(yàn)檢測。

1.3.2 HE染色:將骨-肌腱結(jié)合部位組織浸泡于5倍體積的脫鈣液中，置于搖床上振蕩，每天更換1次脫鈣液，脫鈣結(jié)束后，流水沖洗骨組織24 h。將骨組織縱切并放置于包埋盒中包埋，切出厚度為3 μm的切片水浴中展開。將組織切片脫蠟至水，水洗1～2 min，加入蘇木精染液染色5 min，流水沖洗。加入促藍(lán)液返藍(lán)5 s，流水沖洗，加入0.5%伊紅染液染色3 min，蒸餾水沖洗。加入梯度乙醇脫水，二甲苯透明，然后進(jìn)行中性樹脂封片。

1.3.3 ELISA檢測:稱取0.1 g大鼠骨-肌腱結(jié)合部位組織于離心管中，加入0.9 mL PBS，充分勻漿，2 500 r/min離心10 min，取上清液。將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋，向酶標(biāo)包被板標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入50 μl標(biāo)準(zhǔn)品，待測孔中加入40 μl上述樣本上清液，再加入10 μl抗體。加入50 μl酶標(biāo)試劑，室溫孵育30 min，洗滌5次。加入顯色劑，室溫避光顯色10 min，加入50 μl終止液。酶標(biāo)儀檢測450 nm處各孔的吸光度(OD值)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，計(jì)算待測樣品的實(shí)際濃度。

1.3.4 生化檢測：稱取0.1 g大鼠骨-肌腱結(jié)合部位組織于離心管中，加入0.9 mL PBS，用手持勻漿器將樣本充分勻漿，以2 500 r/min離心10 min，取上清液待測。根據(jù)試劑盒說明書配制試劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測，計(jì)算上清液中MDA濃度及SOD活性水平。

2 結(jié)果

2.1 組織形態(tài)觀察:觀察各組大鼠左前肢活動(dòng)情況，模型組大鼠前2周的活動(dòng)情況均較差，左側(cè)前肢上舉無力，或不能上舉、外展，嚴(yán)重者有肩部不穩(wěn)感，第4周逐漸恢復(fù)正常；治療組大鼠經(jīng)過第1周治療后，前肢活動(dòng)情況出現(xiàn)好轉(zhuǎn)，第2周活動(dòng)恢復(fù)正常。采集骨-肌腱結(jié)合部位組織觀察，與正常組比較，模型組和治療組損傷愈合處瘢痕增生。隨著時(shí)間的增加，模型組和治療組骨-肌腱結(jié)合部位損傷愈合處瘢痕增生均減輕，與模型組相比，同一時(shí)間段的治療組瘢痕增生得到緩解。

2.2 HE染色結(jié)果比較：正常組大鼠組織中肌腱纖維、軟骨以及骨組織層次清楚，呈典型的骨腱結(jié)合部組織狀排列，而模型組組織細(xì)胞排列紊亂，且有炎性細(xì)胞浸潤，治療組隨著治療時(shí)間的延長，組織病理變化得到改善，細(xì)胞排列逐漸恢復(fù)正常，炎性細(xì)胞浸潤減少。

2.3 深化實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果比較：與對照組比較，模型組大鼠骨-肌腱結(jié)合部位組織IL-6、TNF-α和MDA水平均顯著升高(P<0.05)，而SOD活性顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，治療組骨-肌腱結(jié)合部位組織IL-6、TNF-α和MDA水平顯著降低(P<0.05)，SOD活性顯著升高(P<0.05)。與第1周治療組比較，第2周治療組IL-6、TNF-α和MDA水平顯著降低(P<0.05)，SOD活性顯著升高(P<0.05)；第4周治療組IL-6、TNF-α和MDA水平顯著降低(P<0.05)，見表1，說明銀質(zhì)針治療效果存在一定的時(shí)間依賴性。

表1 大鼠骨-肌腱結(jié)合部位組織IL-6、TNF-α、MDA和SOD水平比較

3 討論

有研究報(bào)告肩袖損傷占肩關(guān)節(jié)患者的40%～60%[8-9]，而岡上肌是肩部力量集中的交叉點(diǎn)，為肩袖中受力最大的部位，因此極易受損[10]。肩袖損傷發(fā)病率隨著年齡的增長而增加，口服藥物或局部封閉等保守治療對于老齡化嚴(yán)重的肩袖損傷所造成的弊端也更加明顯[11]。針灸具有疏通經(jīng)絡(luò)、調(diào)和氣血的作用，也可改善局部組織微環(huán)境，亦能抑制炎癥，進(jìn)而達(dá)到緩解疼痛的作用，對于“筋脈不通、氣血凝滯”的肩部疾病具有較好的治療效果[12]。郭長利等[13]研究發(fā)現(xiàn)，針灸配合物理康復(fù)鍛煉對肩袖損傷的疼痛緩解以及功能恢復(fù)是有效的，且未發(fā)生并發(fā)癥。王延武等[14]臨床研究結(jié)果顯示，電針配合Mulligan動(dòng)態(tài)關(guān)節(jié)松動(dòng)術(shù)對肩袖損傷后的肩關(guān)節(jié)疼痛具有很好的改善作用，治療過程中也無不良反應(yīng)出現(xiàn)。仉樂[15]的研究數(shù)據(jù)也說明了針灸、推拿配合理療對于運(yùn)動(dòng)性肩袖損傷的治療效果更優(yōu)于單純的理療。這些臨床報(bào)告提示針灸對于肩袖損傷具有令人滿意的臨床療效，但缺少相應(yīng)的基礎(chǔ)研究。銀質(zhì)針療法是一種特殊的針刺手法，可松解軟組織，刺激痛點(diǎn)，從而達(dá)到消炎止痛的作用[6]。本研究采用銀質(zhì)針治療大鼠左肩袖岡上肌損傷，改善了大鼠的左前肢活動(dòng)情況，緩解了大鼠骨-肌腱結(jié)合部位瘢痕增生，且組織結(jié)構(gòu)變化也得到了恢復(fù)，炎性細(xì)胞減少，提示銀質(zhì)針對肩袖岡上肌損傷具有較好的治療效果。

肩袖損傷的發(fā)病機(jī)制較多，其中包括炎癥反應(yīng)，炎癥可使肌腱結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使肌纖維排列紊亂[16]。郭銳等[17]發(fā)現(xiàn)肩袖損傷大鼠的關(guān)節(jié)液中炎癥因子出現(xiàn)過度表達(dá)，當(dāng)炎癥因子逐漸減少時(shí)，疼痛逐漸減輕，而IL-6、TNF-α等炎癥因子與關(guān)節(jié)疼痛呈正相關(guān)，因此認(rèn)為這些炎癥因子水平可作為肩袖損傷疼痛診治以及療效評(píng)價(jià)的客觀依據(jù)。也有觀點(diǎn)認(rèn)為，疼痛在一定程度上是氧化應(yīng)激和炎癥所導(dǎo)致的結(jié)果[18]。MDA為氧化應(yīng)激標(biāo)志物之一，SOD可抑制氧化應(yīng)激所引起的炎癥反應(yīng)[19]，但關(guān)于氧化應(yīng)激在肩袖損傷中的影響卻研究較少。本研究在檢測銀質(zhì)針對肩袖損傷大鼠炎癥反應(yīng)影響的同時(shí)，也觀察了氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA及SOD，發(fā)現(xiàn)肩袖損傷大鼠骨-肌腱結(jié)合部位組織的IL-6、TNF-α和MDA水平均顯著升高(P<0.05)，而SOD活性減低(P<0.05)，說明肩袖損傷大鼠的炎癥反應(yīng)以及氧化應(yīng)激水平均出現(xiàn)升高；經(jīng)過銀質(zhì)針的治療后，大鼠骨-肌腱結(jié)合部位組織的IL-6、TNF-α和MDA水平降低，SOD活性升高(P<0.05)，且隨著治療次數(shù)的增加，治療時(shí)間的延長，大鼠IL-6、TNF-α和MDA水平越低(P<0.05)，提示銀質(zhì)針治療可緩解肩袖損傷大鼠的炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激。

綜上所述，銀質(zhì)針治療可改善肩袖岡上肌損傷大鼠的肢體活動(dòng)情況以及組織病理變化，這一治療作用可能與抑制大鼠炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激水平有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。