外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)分析白念珠菌感染小鼠的標(biāo)志物

王澤田， 吳春榮， 齊 越， 徐 丹， 孫科遠(yuǎn)， 唐建國(guó)

（復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院創(chuàng)傷急救危重癥醫(yī)學(xué)中心，上海 200240）

白念珠菌是人類腸道的常見(jiàn)條件致病菌，正常情況下與宿主之間維持平衡狀態(tài)。然而，當(dāng)腸道屏障受損，如休克腸道缺血、消化道穿孔、腸梗阻、腸道手術(shù)等情況下，白念珠菌可入侵腸上皮屏障，進(jìn)入無(wú)菌體腔，如胸腹腔等，甚至進(jìn)入血流，導(dǎo)致侵襲性白念珠菌感染[1-2]。臨床診斷白念珠菌感染主要依靠微生物涂片和培養(yǎng)，但周期較長(zhǎng)，陽(yáng)性率不高。因此，尋找白念珠菌感染的生物標(biāo)志物是急需解決的難題。

外泌體包含許多信號(hào)分子、脂類、蛋白質(zhì)、DNA、mRNA、miRNA和siRNA等，能在細(xì)胞間傳遞重要的介質(zhì)，并順利通過(guò)體液循環(huán)而不受體內(nèi)各種酶的降解[3-5]。因外泌體具有特異性生物標(biāo)志物，能為白念珠菌感染提供有價(jià)值的診斷，所以筆者嘗試分析血清外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)，尋找侵襲性白念珠菌感染的特異性標(biāo)志物。

材料和方法

一、菌株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC10231、金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC29213和大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922購(gòu)于上海魯微科技有限公司；SPF級(jí)別雄性Wistar小鼠60只，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。上海交通大學(xué)生命科學(xué)院動(dòng)物房飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)喂養(yǎng)2周，其中8只用于白念珠菌感染的外泌體蛋白組學(xué)實(shí)驗(yàn)，其余用于差異蛋白鑒定實(shí)驗(yàn)。

二、菌液配置和模型構(gòu)造

國(guó)內(nèi)、外研究顯示，尾靜脈注射LD50菌液濃度2.5×108CFU(colony forming units)1mL建立小鼠白念珠菌侵襲感染模型。本課題組前期研究證明該濃度的有效性[6]。取8只小鼠分為白念珠菌組4只，正常對(duì)照組4只。白念珠菌組尾靜脈注射2.5×108CFU1mL的白念珠菌菌液，正常對(duì)照組注射無(wú)菌生理鹽水，注射量均為0.1 mL110 g。注射后24 h采用心臟采血法采集血液。注入乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)抗凝管，4℃，1 600 r1min離心10 min。上清液分離成血清，-80℃保存。

三、分離富集血清外泌體

取出-80℃血樣品(1 mL1等份)，快速解凍，3 500 r1min離心30 min。4℃下清除細(xì)胞碎片和雜質(zhì)。每管上清液用1×PBS(中國(guó)生工生物)預(yù)冷稀釋至7 mL，用0.22 mm(美國(guó)密理博)過(guò)濾。超離心法分為萃取和洗滌兩步進(jìn)行。所有的超離心法均在160 000 r1min,4℃，使用SW41轉(zhuǎn)子(Beckman Coulter,USA)進(jìn)行。第一步離心后，取出上清液，用1 mL 1×PBS重懸托盤行第二步。在試管底部收集外泌體，最后用200 mL 1×PBS重懸。

四、外泌體納米粒徑分析

將富集的外泌體懸浮于100 μL PBS溶液，充分震蕩混合。將10 μL樣品，用超純水稀釋至1 mL，注入Nano-Sight S300納米粒度儀，按標(biāo)準(zhǔn)程序測(cè)定粒徑分布和濃度。每個(gè)樣本的采樣分析為3次。采用Nano-Sight NTA(V3.2)軟件分析結(jié)果，擬合3次結(jié)果。將分離富集的外泌體重懸于100 μL PBS溶液中。取10 μL滴在電鏡測(cè)試銅網(wǎng)上，室溫下靜置5 min，用濾紙吸去浮液，用超純水洗3次。待風(fēng)干后加10 μL磷鎢酸溶液于銅網(wǎng)上，靜置染色2 min。用無(wú)塵濾紙吸去殘液，室溫靜置風(fēng)干，制成電鏡測(cè)試樣本，上機(jī)分析。采用透射電鏡(Tecnai G2 Spirit Bio TWIN，USA)80～120 kV下觀察血清外泌體的形態(tài)。采用蛋白質(zhì)免疫印跡檢查血清外泌體的標(biāo)志性蛋白質(zhì)CD63。簡(jiǎn)要實(shí)驗(yàn)步驟為：用10%分離膠和5%濃縮膠。濃縮膠用80 V、分離膠用120 V進(jìn)行電泳。根據(jù)預(yù)染Marker指示，轉(zhuǎn)移相應(yīng)蛋白質(zhì)到PVDF膜。用5%脫脂牛奶封閉液封閉，室溫1 h。封閉后分別用抗 CD63抗體 1∶1 000、β-actin抗體1∶1 000 保溫過(guò)夜，TBST 洗滌 3 次，每次 15 min，保溫二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)志山羊抗兔IgG 1∶20 000，室溫1 h，TBST洗滌3次，每次15 min。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光曝光、顯影，用Image J軟件分析測(cè)定其灰度值。

五、蛋白質(zhì)酶解

首先，外泌體蛋白質(zhì)和50%乙醇組成有機(jī)溶液，50%丙酮和0.1%醋酸的5倍體積完全混合，與獲得的蛋白質(zhì)沉淀溶解在6 mol1L鹽酸胍溶液，-20℃過(guò)夜。加入dl-硫蘇糖 2 μL，60℃下還原60 min。然后加入10 μL吲哚-3-乙酸、烷基化液避光40 min。將得到的蛋白質(zhì)溶液轉(zhuǎn)移到10 kDa的濾管中，4℃，130 00 r1min，離心20 min濃縮蛋白質(zhì)。以酶∶蛋白質(zhì) 1∶20的比例加入胰蛋白酶 (美國(guó)Promega)。酶解后用C18濾芯脫鹽，冷凍干燥，加入40 μL溶解緩沖液復(fù)溶，肽段定量光密度(optical density,OD)280。

六、LC-MS1MS 數(shù)據(jù)采集

用0.1%甲酸重新懸浮干燥的肽至最終濃度為0.5 g1L，每個(gè)樣品用簡(jiǎn)單的nano-UPLC 1000與軌道阱質(zhì)譜儀+質(zhì)譜聯(lián)用儀(Thermo Scientific,USA)分析2 mL。肽用緩沖液B(0.1%TFA在乙腈中)梯度洗脫：0～65 min,3%～35%緩沖液 B；66～68 min,35%～80%緩沖液 B；69～75 min,80%緩沖液 B，流速300 nL1min。質(zhì)譜數(shù)據(jù)文件以數(shù)據(jù)依賴方式獲取。全掃描MS譜質(zhì)荷比(mass-to-charge ratio,m1z,300～1 500)，分辨率為 70 000(m1z，200)，自動(dòng)增益控制(AGC)2×105，最大進(jìn)樣時(shí)間 100 ms，前驅(qū)電荷2～6。從全掃描中選取前20個(gè)豐富的前體，隔離窗為2.0 m1z，在歸一化能量為35%的情況下，被更高能量的碰撞誘導(dǎo)離解碎片化。AGC為1×104，最大注射時(shí)間為35 ms。動(dòng)態(tài)排除時(shí)間為60 s。

七、蛋白質(zhì)鑒定和定量分析

質(zhì)譜測(cè)試原始文件(Raw File)用Maxquant軟件(1.5.5.1版本)檢索相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)，最后得到蛋白質(zhì)鑒定及定量分析結(jié)果。搜索條件設(shè)置為：最多允許2個(gè)胰蛋白酶漏切位點(diǎn)，氧化修飾和乙酰化修飾設(shè)為可變修飾，前體和碎片離子的質(zhì)量誤差分別為6×10-6和 0.5 Da。蛋白質(zhì)鑒定的標(biāo)準(zhǔn)為：至少檢測(cè)到2個(gè)特征肽段，P＜0.05，假陽(yáng)率＜1%。通過(guò)在Maxquant中使用基于強(qiáng)度的絕對(duì)定量(intensitybased absolute protein-quantification,iBAQ)對(duì)鑒定的肽段進(jìn)行定量分析。將每種蛋白質(zhì)的iBAQ對(duì)其所在樣品總iBAQ值的貢獻(xiàn)進(jìn)行歸一化處理，且至少根據(jù)該蛋白質(zhì)的兩個(gè)特征肽段iBAQ值來(lái)確定其相對(duì)豐度。計(jì)算差異蛋白質(zhì)的變化倍數(shù)和P值，P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，變化倍數(shù)＞2為顯著上調(diào)，＜0.5為顯著下調(diào)。

八、差異蛋白鑒定

為驗(yàn)證上述差異蛋白在不同病原菌感染中的表達(dá)差異，筆者取30只小鼠再次構(gòu)建白念珠菌感染模型，分別在感染12、24、36 h每組依次處死10只小鼠。取20只小鼠構(gòu)建金黃色葡萄球菌感染模型和大腸埃希菌感染模型，每組10只。金黃色葡萄球菌感染組尾靜脈注射LD50濃度為4.5×108CFU1mL的菌液[7]。大腸埃希菌感染組尾靜脈注射LD50濃度為 2×109CFU1mL的菌液[8]，在感染12 h后處死小鼠。采用心臟采血法采集各組小鼠血液，置入EDTA抗凝管，4℃，1 600 r1min離心10 min，將上清液分離成血漿，-80℃保存。

使用ELISA法檢測(cè)血漿中差異蛋白含量。分別取上述小鼠的部分血漿加入ELSIA試劑盒中，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。各孔用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定吸光度值。用標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與吸光度值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)線性回歸方程和樣品的吸光值計(jì)算獲得對(duì)應(yīng)的濃度。樣品最終濃度=所測(cè)濃度×稀釋倍數(shù)。同時(shí)取部分血漿送至本院檢驗(yàn)科，檢測(cè)白細(xì)胞、C反應(yīng)蛋白、白介素6的表達(dá)水平。

為在感染早期鑒定差異蛋白的診斷價(jià)值，在各組小鼠感染12 h后，根據(jù)差異蛋白在白念珠菌感染組、金黃色葡萄球菌感染組和大腸埃希菌感染組中的表達(dá)水平建立受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)，計(jì)算曲線下面積(area under curve，AUC)及 95%CI。

結(jié) 果

一、血清外泌體的分離富集

提取白念珠菌感染的小鼠血清進(jìn)行外泌體分離后，筆者觀察到小鼠血清外泌體的粒徑為100～150 nm(見(jiàn)圖1A)，與外泌體的形態(tài)特征一致。透射電鏡驗(yàn)證獲得的外泌體，顯示出粒徑為100～150 nm的典型外泌體，具有雙層杯狀結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖1B)。用已知外泌體標(biāo)記CD63的免疫印跡分析，檢測(cè)外泌體制備的效率(見(jiàn)圖1C)。以上結(jié)果表明，血清外泌體已成功富集，可用于實(shí)驗(yàn)。

圖1 血清外泌體表征

二、差異蛋白質(zhì)篩選和聚類分析

正常對(duì)照組小鼠血清(n=4)和白念珠菌組小鼠血清(n=4)經(jīng)LC-MS技術(shù)分析，共鑒定到4 055個(gè)不同肽段，對(duì)應(yīng)到418個(gè)蛋白質(zhì)。對(duì)418個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以符合白念珠菌組1正常對(duì)照組差異變化＜0.7倍至＞1.5倍，同時(shí)P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)，共得到差異蛋白91個(gè)(見(jiàn)圖2A)。根據(jù)白念珠菌組1正常對(duì)照組差異變化＜0.5倍至＞2.0倍，同時(shí)P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)，篩查出蛋白質(zhì)10個(gè)(見(jiàn)表1)。應(yīng)用Omicsbean生物信息學(xué)分析軟件對(duì)91個(gè)差異蛋白進(jìn)行基因本體分析和KEGG通路分析。在生物學(xué)過(guò)程、分子功能、細(xì)胞組成方面進(jìn)行基因本體分析。結(jié)果顯示，這些差異蛋白主要涉及的生物學(xué)過(guò)程包括：蛋白質(zhì)活化級(jí)聯(lián)、免疫反應(yīng)、防御應(yīng)答、補(bǔ)體激活、經(jīng)典激活途徑。涉及的分子功能包括：免疫球蛋白受體結(jié)合、抗原結(jié)合、絲氨酸型內(nèi)肽酶抑制劑活性、肽酶調(diào)節(jié)活性、受體結(jié)合、內(nèi)肽酶抑制劑活性。涉及的細(xì)胞組成包括細(xì)胞間隙、血液微粒、免疫球蛋白復(fù)合物、外泌體(見(jiàn)圖2B)。KEGG通路分析顯示，這些差異蛋白主要涉及補(bǔ)體系統(tǒng)、黏著斑、血小板激活、PPAR信號(hào)通路、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、吞噬體、氮素代謝、維生素的消化與吸收、集合管酸分泌、溶酶體、細(xì)胞凋亡(見(jiàn)圖2C)。研究蛋白質(zhì)之間的相互作用及其形成的網(wǎng)絡(luò)對(duì)揭示蛋白質(zhì)的功能具有重要意義。同時(shí)，結(jié)合蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析和pathway注釋的結(jié)果，可在分子水平上獲得更全面、系統(tǒng)的細(xì)胞活性模型(見(jiàn)圖2D)。

圖2 外泌體蛋白生物信息分析

表1 在白念珠菌感染中變化顯著的10個(gè)候選蛋白質(zhì)

三、差異蛋白的驗(yàn)證

在白念珠菌組的特異表達(dá)蛋白質(zhì)中，找出與白念珠菌密切相關(guān)的2個(gè)蛋白質(zhì)，Cathepsin B和Pentraxin 3。在白念珠菌感染 12、24、36 h后，觀察上述差異蛋白和感染標(biāo)志物白細(xì)胞、C反應(yīng)蛋白和白介素6表達(dá)變化趨勢(shì)，發(fā)現(xiàn)隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)，差異蛋白的表達(dá)量逐漸升高，并與上述感染標(biāo)志物變化一致。而且小鼠活動(dòng)下降、食欲減退、尾巴潮濕等癥狀隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)而加重(見(jiàn)圖3A)。在感染12 h后采用GraphpadPrim 6.0軟件建立ROC診斷模型，比較 Cathepsin B AUC為 0.9587，95%CI為0.885～1.032，靈敏度80.0%，特異度90.0%。Pentraxin 3 的 AUC 為 0.97，95%CI為 0.907～1.033，靈敏度81.8%，特異度90.9%(見(jiàn)圖3B)。構(gòu)建大腸埃希菌感染的動(dòng)物模型(n=10只)和金黃色葡萄球菌感染的動(dòng)物模型(n=10只)。金黃色葡萄球菌感染組尾靜脈注射LD50濃度為4.5×108CFU1mL的菌液[7]。大腸埃希菌感染組尾靜脈注射LD50濃度2×109CFU1mL的菌液[8]。分別使用ELISA，驗(yàn)證上述蛋白質(zhì)在白念珠菌感染組、大腸埃希菌感染組和金黃色葡萄球菌感染組的表達(dá)差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cathepsin B、Pentraxin 3在白念珠菌感染組中大量表達(dá)，在正常對(duì)照組、金黃色葡萄球菌感染組、大腸埃希菌感染組少量表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見(jiàn)圖3 C、D)。

圖3 差異蛋白的驗(yàn)證

討 論

白念珠菌是一種常見(jiàn)的條件致病真菌，常寄生于人體腸道黏膜表面。因腸道的物理屏障、化學(xué)屏障、生物屏障和免疫屏障等保護(hù)作用，通常白念珠菌不引起致病[9-11]。當(dāng)機(jī)體處于手術(shù)等高度應(yīng)激或腸道功能紊亂時(shí)，腸道屏障受損，白念珠菌可致病，嚴(yán)重時(shí)危及生命[12-13]。對(duì)于圍術(shù)期病人，早期診斷白念珠菌感染具有重要的臨床意義。

目前已確定具有多種亞型的多功能循環(huán)外泌體存在于多類疾病，如心血管疾病、感染性疾病和自身免疫性疾病等。此外，外泌體還具有調(diào)節(jié)免疫、抗原呈遞的功能，對(duì)適應(yīng)性免疫應(yīng)答具有重要的作用[14-16]。外泌體也作為一種可調(diào)控的新型藥物，用于膿毒癥的診斷和治療[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，白念珠菌組小鼠與正常對(duì)照組小鼠的血漿外分泌蛋白存在差異。共篩選出10個(gè)在白念珠菌組中表達(dá)顯著增加的血漿外泌體蛋白。篩選出Cathepsin B、Pentraxin 3與白念珠菌密切相關(guān)。Cathepsin B是木瓜蛋白酶家族中的半胱氨酸蛋白水解酶，廣泛分布于各種組織細(xì)胞中，是溶酶體中重要的蛋白水解酶[19]。有研究報(bào)道，吞噬細(xì)胞外細(xì)菌導(dǎo)致溶酶體失穩(wěn)和Cathepsin B的釋放，調(diào)控白念珠菌誘導(dǎo)的核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白3炎癥小體激活[20]。Cathepsin B增強(qiáng)表達(dá)與結(jié)腸直腸癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有關(guān)，但在腸道損傷及炎癥反應(yīng)中無(wú)研究報(bào)道，因此可進(jìn)一步研究，驗(yàn)證其在白念珠菌侵襲導(dǎo)致腸道損傷中的作用及意義[21]。Pentraxin 3是一種可溶性的體液先天免疫模式識(shí)別受體，被稱為“抗體前體”。其能識(shí)別外來(lái)微生物，并作為調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)劑[22]。Pentraxin 3由血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，由中性粒細(xì)胞儲(chǔ)存，并在介導(dǎo)真菌病原體的抵抗中發(fā)揮作用，其水平可直接反映炎癥狀態(tài)。因其肝外合成，與C反應(yīng)蛋白相反；Pentraxin 3水平被認(rèn)為是疾病活動(dòng)性的一個(gè)真正獨(dú)立指標(biāo)[23]。

為進(jìn)一步驗(yàn)證差異蛋白與白念珠菌感染的相關(guān)性，再次構(gòu)建白念珠菌感染的小鼠模型。通過(guò)ELISA定量分析Cathepsin B、Pentraxin3，隨著白念珠菌感染時(shí)間的延長(zhǎng)，及炎癥介質(zhì)的進(jìn)行性加重，差異蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行性升高，而且建立ROC診斷模型。實(shí)驗(yàn)證明上述差異蛋白與白念珠菌感染的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。為驗(yàn)證Cathepsin B、Pentraxin3是否在其他菌株感染中表達(dá)，再次建立金黃色葡萄球菌感染和大腸埃希菌感染的小鼠模型，在感染12 h后經(jīng)小鼠眼眶取血提取血漿。ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Cathepsin B、Pentraxin 3僅在白念珠菌感染中大量表達(dá)，在正常對(duì)照組、金黃色葡萄球菌感染組和大腸埃希菌感染組中少量表達(dá)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，上述差異蛋白可作為白念珠菌感染的標(biāo)志物。

外泌體蛋白組學(xué)在臨床研究中已廣泛應(yīng)用。有研究者發(fā)現(xiàn)，乳腺癌病人血清外泌體膜蛋白GPC-1表達(dá)水平高于健康對(duì)照和乳腺良性病組，含量與腫瘤分期正相關(guān)。GPC-1陽(yáng)性病人較陰性病人易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，臨床分期較晚，腫瘤細(xì)胞增殖程度較高，對(duì)乳腺癌的診斷有潛在應(yīng)用價(jià)值[24]。抽提骨巨細(xì)胞瘤病人和非腫瘤病人的血清外泌體，采用LC-MS1MS分析鑒定外泌體的蛋白質(zhì)組學(xué)特征，對(duì)檢測(cè)蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，尋找骨巨細(xì)胞瘤的血漿標(biāo)志物[25]。Cathepsin B、Pentraxin 3目前僅有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，尚需進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)，研究Cathepsin B、Pentraxin 3在白念珠菌感染中的應(yīng)用價(jià)值，為早期預(yù)防和治療白念珠菌感染提供幫助。