杜鵑屬ISSR-PCR 反應(yīng)體系優(yōu)化

趙麗華，李 強

（1 西昌學(xué)院農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)院，四川西昌 615000；四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川宜賓 644000）

ISSR（inter-simple sequence repeat）是一種DNA 分子標(biāo)記技術(shù)，其原理和操作與SSR、RAPD 非常相似，但其產(chǎn)物多態(tài)性遠(yuǎn)比SSR、RAPD、RFLP 更加豐富，可以提供更多的關(guān)于基因組的信息，且操作簡單、重復(fù)性好、多態(tài)性豐富、DNA 樣品用量少和成本低的特點。目前已應(yīng)用于枇杷[4]、觀賞桃[5]、龍荔[6]等植物的遺傳多樣性研究、品種鑒定等研究中。但是ISSR-PCR 反應(yīng)體系的質(zhì)量往往受到DNA、引物、Tap DNA 聚合酶、Mg2+等的濃度影響[4-6]。本研究旨在對杜鵑屬植物ISSR-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，以獲得良好的試驗結(jié)果，為進(jìn)行杜鵑屬植物種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性研究、分子標(biāo)記輔助育種等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以“毛葉杜鵑”為供試材料。

1.2 試劑及儀器

1.2.1 試劑。Taq DNA 聚合酶、dNTPs、DL 2000 購自TaKaRa 有限公司；引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 儀器。Eppendorf Mastercycler Gradient PCR 儀、六一廠DYY-8B 型電泳儀、復(fù)日FR-200A 全自動紫外與可見分析裝置等。

1.3 方法

1.3.1 DNA 提取及檢測。應(yīng)用CTAB 法提取“毛葉杜鵑”葉片基因組DNA[6-7]，稀釋為100ng/μL 工作液，放入4℃冰箱里備用。

1.3.2 ISSR-PCR 體系優(yōu)化。以UBC811 為引物，對“毛葉杜鵑”葉片基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。對影響PCR反應(yīng)的Taq DNA 聚合酶、Mg2+、引物、模板DNA 濃度進(jìn)行正交試驗設(shè)計L9（34）（表1），按表1 編號加樣后，每管加入2.0μL 的10×PCR buffer，用滅菌后的ddH2O補足20μL。每個處理重復(fù)1 次。

表1 ISSR-PCR 反應(yīng)體系正交試驗設(shè)計L9（34）

參照潘麗梅等[6,8-10]的設(shè)定擴(kuò)增程序為：94℃預(yù)變性4min；94℃變性45s，退火1min，72℃延伸2min，40個循環(huán)；72℃延伸8min，4℃保存。

采用2%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，用紫外與可見分析裝置觀察并拍照記錄。根據(jù)電泳的正交試驗結(jié)果，對各處理進(jìn)行綜合評定。

根據(jù)電泳的正交試驗結(jié)果，選出正交試驗結(jié)果中較佳PCR 體系組合，再在此體系基礎(chǔ)上進(jìn)行UBC820引物單因素調(diào)整（表2），按表2 編號加樣后，每管加入2.0μL 的10×PCR buffer，用滅菌后的ddH2O 補足20μL。

表2 單因素調(diào)整表

1.3.3 ISSR-PCR 反應(yīng)體系穩(wěn)定性檢測。根據(jù)正交試驗結(jié)果篩選出最佳體系，對5 個杜鵑屬植物種DNA 進(jìn)行ISSR-PCR 擴(kuò)增，2%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測ISSR-PCR 反應(yīng)體系穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR 反應(yīng)體系優(yōu)化

按表1 正交設(shè)計的9 個處理進(jìn)行PCR 反應(yīng)后，電泳結(jié)果如圖1 所示。圖1 顯示：在9 個處理中，擴(kuò)增效果存在著明顯差異。經(jīng)綜合評定處理1、2、3 的擴(kuò)增DNA 條帶數(shù)較多，但背景彌散較嚴(yán)重，其中處理2、3的擴(kuò)增DNA 條帶數(shù)多于處理1，并且亮度較高。處理4、5、6、7、9 背景較彌散較嚴(yán)重，且DNA 條帶數(shù)較少。處理8 條帶數(shù)較少，且背景彌散。綜合擴(kuò)增的DNA 條帶數(shù)及背景彌散程度，處理2、3 相對擴(kuò)增效果較好。

圖1 正交設(shè)計試驗PCR 產(chǎn)物電泳圖

以處理2 為基礎(chǔ)，調(diào)整著引物濃度，電泳結(jié)果如圖2 所示。在9 個處理中，處理a、b 的DNA 條帶數(shù)較多，但背景彌散較嚴(yán)重；處理c、d、f、h 背景干凈但條帶數(shù)較少；處理i 沒有清晰的DNA 條帶，且背景彌散；處理e、g 的背景輕微彌散，DNA 條帶數(shù)較多且清晰，處理e的綜合效果優(yōu)于處理g。

圖2 單因素調(diào)整試驗PCR 產(chǎn)物電泳圖

2.2 ISSR-PCR 反應(yīng)體系穩(wěn)定性檢測

根據(jù)體系優(yōu)化試驗結(jié)果，用引物UBC 810 對5 個杜鵑種進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示（圖3）：擴(kuò)增譜帶清晰，背景彌散輕，多樣性豐富，表明所建立的杜鵑屬ISSR-PCR 反應(yīng)體系穩(wěn)定可靠。

圖3 UBC 810 對部分杜鵑的PCR 擴(kuò)增結(jié)果

3 討論與結(jié)論

ISSR-PCR 反應(yīng)體系中 的Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA 聚合酶、模板DNA 等各因素都會影響PCR 產(chǎn)物的穩(wěn)定性，而且不同物種的最佳ISSR-PCR 反應(yīng)體系也不相同。因此，應(yīng)先對ISSR-PCR 反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，以保證試驗結(jié)果的可靠性[11-12]。Mg2+濃度不僅影響Taq DNA 聚合酶活性，還能影響引物與模板的結(jié)合效率、模板與PCR 產(chǎn)物的解鏈溫度。引物濃度過低，則不能進(jìn)行有效的擴(kuò)增；引物濃度過高，則會引起錯配和非特異性擴(kuò)增。Taq DNA 聚合酶濃度過高，反應(yīng)特異性降低。模板DNA 濃度過高，則導(dǎo)致引物或dNTPs 過早耗盡，出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，產(chǎn)生彌散；DNA 濃度過低，則反應(yīng)產(chǎn)物減少，會使擴(kuò)增的條帶變?nèi)鮗13-14,16]。本研究采用正交試驗設(shè)計L9（34）進(jìn)行DNA 模板、引物、Taq 酶、Mg2+不同濃度水平組合，試驗結(jié)果顯示：正交試驗設(shè)計L9（34）不同組合間，擴(kuò)增效果存在著明顯差異（圖1），其中2、3反應(yīng)體系綜合效果最好，但背景彌散仍較嚴(yán)重，而正交試驗設(shè)計L9（34）中引物濃度已為最低，在此基礎(chǔ)上對PCR 引物再進(jìn)行單因素的調(diào)整，確定杜鵑屬植物ISSR-PCR 的20μL 最優(yōu)反應(yīng)體系為：Mg2+1.5mmol/L、Taq DNA 聚合酶1U、模板DNA 20ng、引物0.9μmol/L、dNTPs 0.2mmol/L、1×PCR buffer?？蔀镮SSR 技術(shù)對杜鵑屬植物進(jìn)行遺傳分析以及輔助育種提供參考。