高效纖維素復合菌劑對玉米秸稈降解效果的研究

朱 琳，張思月，馮佩瑤，孔慶辰，陳 琦，鐘為章

（河北科技大學 環(huán)境科學與工程學院，河北 石家莊050018）

0 引 言

根據(jù)《中國統(tǒng)計年鑒》（2019年版）數(shù)據(jù)顯示，全國主要農(nóng)作物秸稈產(chǎn)量高達861萬t，產(chǎn)量巨大。其中大約31%的秸稈被露天燃燒、還田和隨意丟棄，這種處理秸稈的方式在我國普遍存在，每年總量高達約2億t的作物秸稈被浪費，同時也引發(fā)了溫室氣體的大量排放，以及農(nóng)作物病蟲害的增多等嚴重的環(huán)境問題。

秸稈是潛在的生物質(zhì)能源的來源，若將其進行有效利用，不僅能減少因室外秸稈自然腐敗而生成的甲烷等溫室氣體的排放，還能獲得清潔能源甲烷和沼渣、沼液等有機肥料，從而有效地緩解現(xiàn)今的能源危機和解決環(huán)境污染問題。

厭氧消化技術(shù)是目前普遍使用的處理技術(shù)，是一個非常復雜的生化反應(yīng)過程，受到相互藕合、相互作用等多重因素的影響。由于厭氧消化技術(shù)對纖維素類生物質(zhì)難以降解，因此，需對農(nóng)作物秸稈進行預(yù)處理。

目前，已有的預(yù)處理方法中機械或物理法、以及化學與物理化學法的能耗較高，且存在不同程度的環(huán)境污染。

相對而言，生物預(yù)處理法具有能耗低、環(huán)境友好的優(yōu)點，符合現(xiàn)今社會提倡的綠色經(jīng)濟、循環(huán)經(jīng)濟以及低碳經(jīng)濟的要求，但其缺點也明顯，預(yù)處理時間和生產(chǎn)周期較長，產(chǎn)氣率低，因而限制了工業(yè)化的應(yīng)用。

近年來，國內(nèi)關(guān)于生物法預(yù)處理秸稈生物質(zhì)制沼氣的研究較多，處理秸稈主要是玉米秸稈、小麥秸稈和稻草等。所用微生物菌種大多數(shù)是篩選出的單菌株，而使用復合菌系的不多，因此效果不是很理想。

劉思穎從腐木中分離獲得一株短小芽孢草桿菌屬J33，將其用于預(yù)處理稻草秸稈進行發(fā)酵產(chǎn)氣實驗，在發(fā)酵20 d后，產(chǎn)氣量比自然堆漚處理的秸稈總產(chǎn)氣量提高了26.7%。

國外關(guān)于生物法預(yù)處理秸稈生物質(zhì)后用于制取沼氣的研究較少，主要底物是作物秸稈和能源草等，其中使用擔子菌類處理的較多。

Ghosh等人利用白色腐敗菌和褐腐菌來處理稻草，最大沼氣產(chǎn)率為479.40 L/kg干物質(zhì)，甲烷產(chǎn)率分別達到了327.90、430.95和295.95 L/kgTS，而未處理組僅為355.8 L/kgTS和224.3 L/kgTS，甲烷產(chǎn)率分別提高了46.19%和31.94%。

本實驗?zāi)M自然條件下纖維素的分解過程，利用微生物之間的協(xié)同關(guān)系，根據(jù)酸堿互補原則，組合優(yōu)化酸堿反應(yīng)不同的纖維素降解菌群，通過纖維素酶活測定，菌系復篩，篩選制備出穩(wěn)定高效降解纖維素的復合菌劑。

這種復合協(xié)同的預(yù)處理菌劑，可以有效地破壞木質(zhì)素的密封，打亂纖維素的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，即減少木質(zhì)素的抗性和不透性，從而使生物質(zhì)中的纖維素和半纖維素易被微生物水解和轉(zhuǎn)化為單糖，加快啟動，大大縮短了處理的時間，進一步提高了生物質(zhì)產(chǎn)沼氣的效率，從而實現(xiàn)了循環(huán)經(jīng)濟、綠色經(jīng)濟和低碳經(jīng)濟。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 玉米秸稈

試驗采用玉米秸稈，先用鍘刀將秸稈切割成小段（1～3）cm，干燥后用粉碎機粉碎，用40目篩過篩，取篩下物于干燥通風處待用。

1.1.2 微生物復合菌劑

本研究所用微生物復合菌劑為本課題組前期研究開發(fā)得到，其中成分和制作方法見相關(guān)專利。

1.1.3 試驗用培養(yǎng)基

（1）蛋白胨纖維素培養(yǎng)基（PCS）。

（2）基礎(chǔ)培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）；高氏合成一號培養(yǎng)基。

（3）篩選培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基；濾紙條培養(yǎng)基；剛果紅纖維素培養(yǎng)基。

（4）發(fā)酵培養(yǎng)基：發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.2 實驗方法

根據(jù)對秸稈生物質(zhì)成分的分析與特點對比，通過生物質(zhì)預(yù)處理、厭氧消化技術(shù)等的綜合運用，生產(chǎn)出環(huán)境友好型沼氣能源。

以農(nóng)作物秸稈或處理后的材料為原料，進行產(chǎn)品的更新和創(chuàng)新，主要研發(fā)一種高效纖維素降解復合菌劑，優(yōu)化厭氧消化技術(shù)，從而將秸稈轉(zhuǎn)化為生物燃氣和有機肥料進一步加以利用。

1.2.1 纖維素（CMC）酶活的測定分析

纖維素酶活的測定參考中國人民共和國國家標準QB2583-2003。

（1）試劑。

①DNS試劑。

②0.1 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液。

（2）葡萄糖標準曲線。

①1 mg/mL葡萄糖標準液。

②標準曲線繪制。

③以吸光值OD540值為橫坐標，葡萄糖含量（μg）為縱坐標作出標準曲線。

(1)生成k個滿足假設(shè)5和假設(shè)6的隨機整數(shù)xk，表示第k個時間段乘坐電梯的人數(shù)，并將xk個人隨機的分到第l樓；

葡萄糖的標準曲線如圖1所示。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Glucose standard curve

（3）粗酶液的制備。

培養(yǎng)5 d的發(fā)酵液20 mL，在溫度為4℃，轉(zhuǎn)速為8 000 rpm的條件下，在高速離心機中離心15 min，取上清液，即為粗酶液。

（4）CMC酶活測定。

將稀釋至合適濃度的酶液0.5 mL，加入到1 mL質(zhì)量分數(shù)為1%的CMC溶液（溶于0.1 mol/L，pH=4.8的HAc-NaAc緩沖液中）中，水浴鍋50℃下恒溫30 min，再加入1.5 mL DNS試劑，置于沸水浴中5 min，冷卻，稀釋至25 mL，在540 nm下測吸光度值。

每min水解1%的CMC溶液產(chǎn)生1μg葡萄糖的酶量定義為1個CMC酶活力單位（U）。

根據(jù)測得的吸光度值在標準曲線查出對應(yīng)的葡萄糖含量（μg），按下式計算CMC酶活力：

1.2.2 高效纖維素降解菌的復篩

將篩選出的纖維素降解菌株在剛果紅纖維素培養(yǎng)基的中央進行點接種，之后，置于常溫25℃下培養(yǎng)，分別記錄水解圈和菌落的直徑。

根據(jù)水解圈直徑（d）和菌落直徑（D）得到d/D的比值。d/D越大，說明其纖維素分解能力越強，生長速度越快。

1.2.3 高效纖維素降解復合菌群的構(gòu)建

將篩選出的所產(chǎn)纖維素酶活較多的菌株，按正交試驗設(shè)計表進行混合，然后接種到裝有100 mL液體的發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，放置于恒溫振蕩器中，在溫度為25℃，轉(zhuǎn)速為150 rpm條件下恒溫培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基中的濾紙條分解情況，確定效果最佳的高效纖維素降解復合菌群。

2 結(jié)果討論與分析

2.1 掃描電鏡（SEM）觀察

對未預(yù)處理和經(jīng)過高效纖維素降解復合菌劑預(yù)處理的作物秸稈進行了電鏡掃描，觀察其微觀表面形態(tài)，以便從微觀形態(tài)上直觀地了解生物預(yù)處理前后的玉米秸稈的纖維組織的變化情況。

不同生物預(yù)處理時間的玉米秸稈的電鏡掃描照片如圖2所示。

圖2 不同生物預(yù)處理時間的玉米秸稈的電鏡掃描圖像Fig.2 SEMimages of corn straw with different biological pretreatment times

由圖2（a）可以看出，未預(yù)處理的秸稈表面比較完整光滑，纖維組織排列有序，結(jié)構(gòu)致密，無明顯的破損和孔隙。

由經(jīng)過復合菌劑預(yù)處理后的圖2（b）和（c）可以看出，作物秸稈的表面粗糙，凹凸不平，疏松多孔，出現(xiàn)了明顯的裂紋、裂片，甚至呈蜂窩狀，這說明其中的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)遭到了部分的破壞和分離，纖維和纖維束出現(xiàn)了卷曲折疊，變得柔軟疏松，排列凌亂。表面上出現(xiàn)的碎片狀的物質(zhì)很可能是其中的半纖維素和木質(zhì)素溶出物。

由圖2可以看出如下內(nèi)容。

（1）玉米秸稈經(jīng)過生物預(yù)處理后，原本致密、完整和有序的結(jié)構(gòu)受到了嚴重的破壞，這使水解酶和水解菌與其深入接觸的表面積增大，從而提高了水解效率，使水解這一厭氧消化的限速步驟得到了很好地解決。

（2）生物預(yù)處理玉米秸稈中的纖維素、半纖維素和其他有機物質(zhì)能更容易地被厭氧消化和利用，其可利用性和生物降解性得到了顯著提高。

2.2 X-射線衍射（XRD）分析

通過X-射線衍射（XRD）分析生物預(yù)處理對纖維素結(jié)晶度的影響，分析纖維素結(jié)晶度與生物質(zhì)酶解抗性之間存在的關(guān)系。

未預(yù)處理和不同預(yù)處理時間的作物秸稈的X-射線衍射圖如圖3所示。

圖3 不同生物預(yù)處理時間的作物秸稈的X-射線衍射圖Fig.3 X-ray diffraction pattern of corn straw with different biological pretreatment times

由圖3可以看出如下內(nèi)容。

（1）經(jīng)過復合菌劑預(yù)處理后作物秸稈的衍射圖譜的形狀基本與未經(jīng)預(yù)處理的相同，沒有發(fā)生根本的改變，只是存在強度上的差異。

（2）秸稈原料與經(jīng)過復合菌劑預(yù)處理后物料的晶型結(jié)構(gòu)為典型纖維素Ⅰ型，其XRD圖譜均在2θ為16°和22°出現(xiàn)了典型的纖維素Ⅰ型的特征峰，生物預(yù)處理后，物料僅在兩處的衍射峰強度減少，說明生物預(yù)處理并沒有破壞秸稈物料的結(jié)晶結(jié)構(gòu)。

（3）隨著生物預(yù)處理時間的增加，在2θ為16°和22°附近的波峰的衍射強度越來越大。

2.3 纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量變化與分析

未預(yù)處理和生物預(yù)處理的玉米秸稈中的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的含量見表1。

表1 不同生物預(yù)處理時間后的玉米秸稈中主要成分的變化Table 1 Changes of main compositions in corn strawafter different biological pretreatment time

由表1可以看出如下內(nèi)容。

（1）未經(jīng)預(yù)處理的玉米秸稈中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素分別占玉米作物秸稈干物質(zhì)含量的41.16%、28.13%和8.72%，三者之和占到玉米秸稈干物質(zhì)量的78.01%。將其用于厭氧消化，是厭氧微生物生長的主要碳源，其含量和可生物降解性能對玉米秸稈的消化性能是最直接的決定因素，同時也決定了玉米秸稈的產(chǎn)氣量的高低和厭氧消化時間的長短。

（2）經(jīng)復合菌劑預(yù)處理后，玉米秸稈的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量都有了明顯的降低，與未預(yù)處理的相比，5、10、15和20 d的總纖維素分別下降了5.44%、10.06%、21.27%和25.10%。由此可以看出，相當數(shù)量的木質(zhì)纖維素被分解而生成了其它的成分。

（3）經(jīng)過生物預(yù)處理的玉米秸稈的木質(zhì)素與纖維素的比值均比未預(yù)處理的比值小，從另一方面反應(yīng)出生物預(yù)處理后的玉米秸稈的生物降解性的增強。

（4）生物預(yù)處理作用降解了相當數(shù)量的木質(zhì)纖維素，從而預(yù)處理后的玉米秸稈中木質(zhì)纖維素的含量也降低不少，這樣阻礙厭氧菌作用的物質(zhì)越少，也越有利于其消化。

（5）纖維素和半纖維素隨著木質(zhì)素的去除而被釋放出來，從而增加了纖維素和半纖維素中微生物的可利用的程度，使得被厭氧微生物更易接觸和作用。

（6）木質(zhì)素、纖維素和半纖維素這些大分子物質(zhì)被轉(zhuǎn)化成小分子物質(zhì)，上述作用共同促進了玉米秸稈的消化性能，提高了其產(chǎn)氣率。

2.4 每日生物氣產(chǎn)量

未預(yù)處理與不同生物預(yù)處理時間的玉米秸稈的每日生物氣產(chǎn)量如圖4所示。

圖4 未預(yù)處理與不同生物預(yù)處理時間的玉米秸稈的每日產(chǎn)氣量Fig.4 Daily biogas production of corn straw untreated and different biological pretreatment times

由圖4可以看出如下內(nèi)容。

（1）每日生物氣產(chǎn)量有著類似的趨勢，未預(yù)處理與經(jīng)復合菌劑預(yù)處理的玉米秸稈的主要不同是峰數(shù)、每日產(chǎn)氣量值以及生物氣產(chǎn)生的持續(xù)時間。一般而言，與未預(yù)處理玉米秸稈對照樣相比，經(jīng)預(yù)處理的玉米秸稈在更短的發(fā)酵時間內(nèi)有更高的每日沼氣產(chǎn)量。

（2）在第10 d出現(xiàn)了1個產(chǎn)氣高峰，這說明生物預(yù)處理使能更好的被厭氧消化的成分增加了。

（3）經(jīng)復合菌劑預(yù)處理樣品的每日生物氣產(chǎn)氣峰數(shù)與產(chǎn)量值均比未預(yù)處理的多。

（4）經(jīng)預(yù)處理后的玉米秸稈的產(chǎn)氣性能出現(xiàn)了明顯的加強。

經(jīng)預(yù)處理后玉米秸稈的可厭氧消化的有效成分增多，從而在相同的秸稈量下有更多的生物氣產(chǎn)量，即單位玉米秸稈的產(chǎn)氣量得到了提高，也即玉米秸稈的利用效率得到了有效提高。

2.5 累積生物氣產(chǎn)量

未預(yù)處理和不同生物預(yù)處理時間的玉米秸稈在30 d內(nèi)的累積產(chǎn)氣量情況如圖5所示。

圖5 未預(yù)處理與不同生物預(yù)處理時間的玉米秸稈的累積產(chǎn)氣量Fig.5 Cumulative biogas production of corn straw untreated and different biological pretreatment time

由圖5可以看出如下內(nèi)容。

（1）各組玉米秸稈的累積產(chǎn)氣量曲線趨勢相似，但未預(yù)處理的累積產(chǎn)氣量的曲線較平緩，說明其增速較緩慢。

（2）微生物預(yù)處理玉米秸稈在前15 d中累積產(chǎn)氣量的增速較高，之后放緩，直到第20 d，變化幅度較小，而第20 d以后產(chǎn)氣基本停止。

（3）在30 d里的不同時間，復合菌系預(yù)處理的玉米秸稈的總產(chǎn)氣量均要明顯高于未預(yù)處理玉米秸稈。其中，15 d和20 d生物預(yù)處理的玉米秸稈的累積產(chǎn)氣量相對較高，且在總產(chǎn)氣量上差別不大，分別為342 mL和365 mL；而5 d和10 d生物預(yù)處理的玉米秸稈的累積產(chǎn)氣量較低，總產(chǎn)氣量分別為286 mL和306 mL。這說明在20 d的預(yù)處理時間內(nèi)，預(yù)處理時間越長，越有利于提高玉米秸稈的產(chǎn)氣率。

2.6 產(chǎn)氣率和平均甲烷含量

未處理和不同生物預(yù)處理時間的玉米秸稈的生物氣產(chǎn)氣率如圖6所示。

圖6 未預(yù)處理與不同生物預(yù)處理時間的玉米秸稈的生物氣產(chǎn)氣率Fig.6 Biogas production rate of corn straw untreated and different biological pretreatment times

由圖6可以看出，復合菌劑預(yù)處理的玉米秸稈的產(chǎn)氣能力比未處理的玉米秸稈均有提高，其中15 d和20 d預(yù)處理時間的產(chǎn)氣率達到了342 mLN/gTS和365 mLN/gTS，分別提高了33.07%和42.02%。

實驗結(jié)果表明，復合菌系預(yù)處理能大幅提高玉米秸稈的生物氣產(chǎn)量。

為了比較能源轉(zhuǎn)化率和生物降解能力，未處理和不同生物預(yù)處理時間的玉米秸稈的甲烷產(chǎn)氣率如圖7所示。

圖7 未預(yù)處理與不同預(yù)處理時間的玉米秸稈的甲烷產(chǎn)氣率Fig.7 Methane production rate of corn straw untreated and different biological pretreatment time

由圖7可以看出，5、10、15、20 d生物預(yù)處理的玉米秸稈的甲烷產(chǎn)率在（131～239）mLNCH4/gTS范圍內(nèi)，比未預(yù)處理的玉米秸稈的甲烷產(chǎn)率提高了26.70%～75.57%。這個結(jié)果更加證明了生物預(yù)處理能有效地增加玉米秸稈的生物降解能力和生物能產(chǎn)率。

本研究的生物預(yù)處理后的甲烷產(chǎn)氣率比先前的報道要高，這主要是由于微生物預(yù)處理提高了其產(chǎn)氣率。

沼氣中所含能量不僅取決于沼氣的體積，還和其中的有效成分甲烷有關(guān)。未預(yù)處理和不同生物預(yù)處理時間的玉米秸稈所產(chǎn)生物氣中有效成分甲烷的平均含量見表2。

表2 未預(yù)處理和不同生物預(yù)處理時間的玉米秸稈所產(chǎn)生物氣中平均甲烷含量Table 2 Average methane content in biogas produced by corn strawuntreated and different biological pretreatment times

由表2可以看出，復合菌劑預(yù)處理不僅能提高玉米秸稈所產(chǎn)生物氣體積，還能提高其中甲烷的含量，即提高其品質(zhì)。

3 結(jié) 論

在本研究中，對復合菌劑預(yù)處理玉米秸稈的重要影響因素進行了深入分析，對秸稈表面微觀物理結(jié)構(gòu)變化進行了SEM掃描觀察，化學結(jié)構(gòu)變化進行了XRD分析，化學成分變化進行了半纖維素、纖維素、木質(zhì)素含量和每日產(chǎn)氣量，累積產(chǎn)氣量及甲烷產(chǎn)氣率等的測定，主要結(jié)果如下：

（1）通過SEM觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)復合菌劑預(yù)處理后的玉米秸稈的表面物理結(jié)構(gòu)變得疏松和凹凸不平，出現(xiàn)了明顯的分層脫落和很多水解破洞，且去纖維化隨著預(yù)處理時間的延長而加劇。被木質(zhì)素緊裹的纖維素和半纖維素裸露出來，使得其更易被厭氧消化細菌接觸到并消化利用。

（2）通過XRD分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)復合菌劑預(yù)處理后的玉米秸稈中纖維素的化學結(jié)構(gòu)變化顯著，部分纖維素和半纖維素中的重要連接鍵被破壞，從而被降解成了易消化利用的小分子物質(zhì)。此外，木質(zhì)素和纖維素、半纖維素之間的酯鍵發(fā)生斷裂，從而使木質(zhì)纖維素的網(wǎng)聯(lián)結(jié)構(gòu)遭到破壞。

（3）通過纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)復合菌劑預(yù)處理后的玉米秸稈的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量有了明顯的降低，并且預(yù)處理時間越長，纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的含量下降越多。

（4）經(jīng)復合菌劑預(yù)處理樣品的產(chǎn)氣性能出現(xiàn)了明顯的加強，可厭氧消化的有效成分增多，從而在相同的秸稈量下有更多的生物氣產(chǎn)量，即單位玉米秸稈的產(chǎn)氣量得到了明顯提高。

（5）復合菌劑預(yù)處理不僅能夠提高玉米秸稈所產(chǎn)生物氣的體積，還能提高其中甲烷的含量，即提高其品質(zhì)。經(jīng)復合菌劑預(yù)處理的玉米秸稈的甲烷產(chǎn)率相對于未預(yù)處理的玉米秸稈的甲烷產(chǎn)率有明顯提高，由此證明了復合菌劑預(yù)處理能有效地提高玉米秸稈可生物降解性和甲烷產(chǎn)率。