乳酸降解菌在白酒釀造中的研究進(jìn)展

王新葉，李芳香，張依香，鐘艷霞，莫新良，趙 亮

（茅臺(tái)學(xué)院 釀酒工程系，貴州 仁懷 564500）

乳酸（2-羥基丙酸）（C3H6O3）及其酯類是中國(guó)白酒中重要的成分，其在各香型酒中所占的比重差異較大[1]。在清香型白酒中，乙酸乙酯和乳酸乙酯的絕對(duì)含量及兩者之間的比例關(guān)系，對(duì)清香型白酒的質(zhì)量和風(fēng)格特征有很大的影響，一般乙酸乙酯與乳酸乙酯的含量比例為1∶（0.6～0.8）左右[1]。在濃香型白酒中，四大酯（己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸乙酯和丁酸乙酯）、四大酸（己酸、乳酸、乙酸和丁酸）占酒體中酯、酸類物質(zhì)的98%以上，其中己酸乙酯與乳酸乙酯的比值多在1∶（0.5～0.8）之間[2]。但在白酒生產(chǎn)過程中，普遍存在乳酸乙酯含量過高的問題，導(dǎo)致乳酸乙酯與主體香的比例失調(diào)，嚴(yán)重影響白酒的品質(zhì)[1，3]。

在白酒釀造過程中，乳酸乙酯的產(chǎn)生是多種微生物代謝作用的結(jié)果，它分別由乳酸菌代謝產(chǎn)生的乳酸和酵母菌代謝產(chǎn)生的乙醇來(lái)提供酯化的前體，然后在丁酸菌等微生物提供的酯化酶作用下酯化生成[4]。乳酸乙酯性質(zhì)穩(wěn)定，不易被分解，可以通過降低乳酸乙酯的前體物質(zhì)——乳酸，降低白酒中的乳酸乙酯含量[5]。在白酒生產(chǎn)過程中，實(shí)現(xiàn)“降乳”主要有以下幾種方式：①添加輔酶，添加食用級(jí)富馬酸可以抑制乳酸菌生長(zhǎng)。然而添加富馬酸會(huì)增加白酒釀造成本，同時(shí)也會(huì)干擾微生物的其他代謝途徑；②控制與優(yōu)化生產(chǎn)工藝：使用優(yōu)質(zhì)陳曲，減少用曲量；緩火蒸餾，量質(zhì)接酒；及時(shí)清理黃水，確保生產(chǎn)環(huán)境衛(wèi)生。通過優(yōu)化操作工藝，可以在一定程度上降低生產(chǎn)過程和基酒中乳酸乙酯的含量，但是“治標(biāo)不治本”；③在發(fā)酵過程中添加乳酸降解菌，這些乳酸降解菌株來(lái)源于發(fā)酵過程，成本低，不影響其他微生物的生長(zhǎng)代謝[6]。

已見報(bào)道的乳酸降解菌主要是從清香型白酒、濃香型白酒和特香型白酒的釀造過程篩選出來(lái)的8個(gè)屬，種質(zhì)資源有待進(jìn)一步開發(fā)。醬香型白酒生產(chǎn)過程中，乳酸是酒醅中的主要酸類物質(zhì)，在中后期輪次酒醅中乳酸含量可以達(dá)到20～40 g/kg酒醅，在醬香型白酒這樣酸性釀造環(huán)境的脅迫和馴化下，一些釀造微生物已經(jīng)對(duì)乳酸具有較強(qiáng)的耐受性和利用能力[7]。因此，醬香型白酒的釀造環(huán)境可以作為乳酸降解菌菌種的種質(zhì)資源庫(kù)，為篩選獲得具有應(yīng)用價(jià)值的乳酸降解菌提供原材料。

1 乳酸降解菌的種類

乳酸降解菌也稱乳酸利用菌，是指能夠利用乳酸作為碳源或者電子受體的一類微生物[6]。在釀酒環(huán)境中，乳酸降解菌在大曲、窖泥和酒醅中都有分布，大部分是兼性厭氧菌[5-6，8-9]。已見文獻(xiàn)報(bào)道的乳酸降解菌有丙酸桿菌屬、芽孢桿菌屬、梭菌屬、脫硫腸狀菌屬、泥桿菌屬、脫硫腸狀菌屬、葡萄球菌屬、土孢桿菌屬等[6，10]。丙酸桿菌屬的菌株是報(bào)道最早的乳酸降解菌[10-11]。芽孢桿菌屬的菌株最多，包括解淀粉芽孢桿菌、芹菜芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、富馬芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、半乳糖芽孢桿菌、球形芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌及特基拉芽孢桿菌的15個(gè)菌株[5，9，12]。其次是梭菌屬，包括七葉梭菌、肉毒梭狀芽孢桿菌、丁酸梭狀芽胞桿菌、天青梭狀芽胞桿菌、耳蝸梭狀芽孢桿菌、馬氏梭狀芽胞桿菌、玫瑰梭狀芽孢桿菌、塞內(nèi)加爾氏梭菌、梭狀芽孢桿菌、產(chǎn)芽孢梭狀芽孢桿菌、酪丁酸梭菌的11個(gè)菌株[13-15]。

不同種屬的菌株對(duì)乳酸的降解率差異很大，芽孢桿菌屬的菌株中，除個(gè)別菌株外，大部分菌株對(duì)乳酸的降解率都能達(dá)到100%[9]；梭菌屬的菌株中，耳蝸梭狀芽孢桿菌對(duì)乳酸的降解率能達(dá)到90%以上，其他種的菌株對(duì)乳酸的降解率均低于70%[6]。其他屬的菌株中，泥桿菌屬對(duì)乳酸的降解率為100%，脫硫腸狀菌屬、拉烏爾菌屬、葡萄球菌屬、土孢桿菌屬的菌株對(duì)乳酸的降解率均在40%以下[6]。

乳酸降解菌的發(fā)酵產(chǎn)物主要有醇類、酸類和酯類。不同屬的乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物不同，芽孢桿菌屬的菌株發(fā)酵都會(huì)產(chǎn)生乙醇，而梭菌屬、脫硫腸狀菌屬、泥桿菌屬、土孢桿菌屬的菌株發(fā)酵都不產(chǎn)生乙醇，但會(huì)產(chǎn)生丁醇、戊醇、己醇和辛醇等[6，9]。而不同來(lái)源的乳酸降解菌發(fā)酵產(chǎn)物也有一定差異，鎮(zhèn)達(dá)等[9]從黃水、酒糟、大曲中分離得到的乳酸降解菌都屬于芽孢桿菌屬，但是來(lái)源于黃水的乳酸降解菌發(fā)酵產(chǎn)物只有乙醇，而來(lái)源于大曲的乳酸降解菌的發(fā)酵產(chǎn)物除乙醇外，還有丙酸、己酸、異丁醇和異戊醇等。

2 乳酸降解菌的篩選

2.1 培養(yǎng)基的優(yōu)化

乳酸降解菌可以以乳酸或乳酸鈉作為碳源，研究者們?cè)诤Y選培養(yǎng)基中，添加乳酸或乳酸鈉作為唯一碳源，將能在此類選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株初步認(rèn)定為乳酸降解菌[6，16]。張國(guó)政等[16]最先以“乳酸鈉1.0%，酵母膏0.5%，無(wú)機(jī)鹽適量”為基礎(chǔ)培養(yǎng)基從酒醅、窖泥和黃水中篩選出了190株乳酸降解菌，但其中只有10株菌的乳酸降解能力較強(qiáng)，降乳率在30%～60%之間。鎮(zhèn)達(dá)等[9]以“每升含5 g乳酸，2 g酵母膏，2 g（NH4）2SO2，14.3 g Na2HPO4·12H2O，3 g KH2PO4，0.28 mg MnSO4·H2O，0.3 mg FeSO4·7H2O，0.06 mg MgSO4·7H2O，1 mg CaCl2，0.05 mg CuSO4，0.05 mg ZnSO4和0.05 mg H3BO3”的培養(yǎng)基從窖泥、出窖酒糟、黃水和大曲中分離篩選得到了16株乳酸降解菌，其中11株菌的乳酸降解率達(dá)到了100%，大部分菌株的乳酸降解率在60%以上。

2.2 具有耐受性的乳酸降解菌的篩選

酒醅是白酒發(fā)酵的主要載體基質(zhì)，其微環(huán)境具有高濃度乙醇、高濃度有機(jī)酸、低pH等特點(diǎn)[6，17]。因此，菌株在高酸、高乙醇濃度下的降乳率也是重要的考察指標(biāo)。

在白酒發(fā)酵過程中，伴隨著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的降解和微生物的繁殖生長(zhǎng)，代謝生成大量有機(jī)酸使發(fā)酵酒醅維持酸性環(huán)境，瀘型酒酒醅入窖時(shí)其pH值一般為4.0～5.0，發(fā)酵結(jié)束時(shí)維持在3.5～4.0左右[9，16]。隨著pH的降低，菌株的乳酸利用率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，而不同菌株對(duì)pH的耐受性差異很大。菌株Z4-5在pH 4條件下依然能夠利用乳酸鈉，降乳率可達(dá)到20%[16]。但是，大多數(shù)乳酸降解菌在pH 5以下無(wú)法生長(zhǎng)[6，18]。這可能是由于對(duì)菌株pH耐受性的檢測(cè)是在實(shí)驗(yàn)室液體發(fā)酵條件下進(jìn)行的，而同樣的酸度條件下液體環(huán)境會(huì)加強(qiáng)酸的抑制作用，某些可以在固態(tài)發(fā)酵條件下繁殖生長(zhǎng)的微生物無(wú)法在液體培養(yǎng)條件下生存[18]。

高濃度的乙醇耐受能力是乳酸降解菌應(yīng)用的前提，但目前研究獲得乳酸降解菌的乙醇耐受能力并不理想。酒精度在4%vol以下，大部分乳酸降解菌都能快速生長(zhǎng)；乙醇含量超過6%，菌株的乳酸降解率大幅度下降，而且大部分菌株生長(zhǎng)受到明顯抑制[6，16，18]。

乳酸是酒醅中含量最高的有機(jī)酸，在瀘型酒中，發(fā)酵結(jié)束時(shí)其質(zhì)量濃度范圍在15～20 g/L酒醅左右，而在醬香型酒中，中后期輪次酒醅中乳酸含量達(dá)到20～40 g/kg酒醅[6-7]。王莉等[7]從醬香型白酒發(fā)酵酒醅中篩選到了一株庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母MY-Y01，對(duì)乳酸的耐受性可達(dá)到120 g/L，是醬香型白酒發(fā)酵過程中一株重要的酵母菌。

3 發(fā)酵液中乳酸含量的測(cè)定方法

乳酸是自然界最小的手性分子，主要由微生物發(fā)酵產(chǎn)生[21]。發(fā)酵液中乳酸的測(cè)定方法主要有乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）滴定法、對(duì)羥基聯(lián)苯比色法、酶電極分析法及高效液相色譜法，發(fā)酵液中乳酸含量的測(cè)定方法見表1。

由表1可知，EDTA滴定法和對(duì)羥基聯(lián)苯比色法簡(jiǎn)便快速，但重復(fù)性較差；酶電極分析法和高效液相色譜法測(cè)定更準(zhǔn)確靈敏，但是成本相對(duì)測(cè)試成本較高[21]。此外，選擇何種測(cè)定手段還受測(cè)定方法的成本以及對(duì)檢測(cè)速度要求的影響[21]。

表1 發(fā)酵液中乳酸測(cè)定方法比較Table 1 Comparison of lactic acid determination method in fermentation broth

4 乳酸降解菌在白酒生產(chǎn)中的應(yīng)用

國(guó)內(nèi)對(duì)乳酸降解菌的應(yīng)用研究始于20世紀(jì)80年代，由于丙酸菌在無(wú)氧狀態(tài)下發(fā)酵可以將乳酸轉(zhuǎn)變成二氧化碳、乙酸、丙酸和少量的琥珀酸，可以起到降低酒醅中乳酸含量的作用，因此丙酸菌是被最早應(yīng)用在白酒生產(chǎn)上的菌種[10，26]。20世紀(jì)90年代以后，研究者們開始從白酒釀造環(huán)境中分離篩選具有乳酸降解功能的乳酸菌，直接將其應(yīng)用于白酒生產(chǎn)過程，考察其對(duì)白酒中乳酸及乳酸乙酯的影響，但對(duì)菌株的種屬及發(fā)酵特性并未做深入研究[20，27]。進(jìn)入21世紀(jì)，部分乳酸降解菌的菌株作為菌劑添加到白酒釀造的曲粉和酒醅中，降低了基酒的乳酸及乳酸乙酯的含量，使酒體的香型風(fēng)格更加典型[8，28]。此外，大部分菌株還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，未投入生產(chǎn)使用[12，14，18，29]。

4.1 作為曲粉添加劑

大曲為酒之骨，白酒釀造用大曲的主要生產(chǎn)原料為小麥，大曲發(fā)酵過程中多種微生物經(jīng)過馴化和富集，為酒醅發(fā)酵提供有益菌，集“物系”、“菌系”和“酶系”于一體，其豐富的微生物種類與酶類及多樣的風(fēng)味物質(zhì)，對(duì)釀造酒的出酒率及酒體品質(zhì)都有很重要的影響[30]。宋克偉等[8]將篩選到的乳酸降解菌B001添加到麩曲中，進(jìn)行正常的清香型基酒生產(chǎn)；與對(duì)照組基酒相比，試驗(yàn)組感官同對(duì)照組一致，基酒中乳酸乙酯降低了25%，并且提高了14.6%的乙酸乙酯，起到了增乙降乳的作用，并且在品評(píng)上體現(xiàn)了清香型酒爽凈、柔順等特點(diǎn)。

4.2 作為酒醅添加劑

白酒生產(chǎn)是以窖池和酒醅為基礎(chǔ)，依靠微生物、大曲微生物和窖泥微生物在窖池中進(jìn)行著復(fù)雜的物質(zhì)能量代謝的過程，酒醅在窖池環(huán)境中充當(dāng)著物質(zhì)循環(huán)、能量流動(dòng)和信息傳遞的“三流運(yùn)轉(zhuǎn)”規(guī)律的載體[31]。劉復(fù)今等[20]將通過紫外誘變得到的乳酸降解菌添加到酒醅中，進(jìn)行正常的清香型白酒發(fā)酵生產(chǎn)，與對(duì)照組相比，酒體中的乳酸乙酯含量降低，乙酸乙酯的含量升高，其感官品評(píng)結(jié)果均比原對(duì)照酒好，且試驗(yàn)酒的清香型風(fēng)格均較對(duì)照酒典型。

4.3 作為窖泥養(yǎng)護(hù)劑

窖池都是濃香型白酒生產(chǎn)的主要設(shè)備和重要的前提條件。要產(chǎn)好酒，就必須有優(yōu)質(zhì)的窖池，而好的窖池其本質(zhì)在于優(yōu)質(zhì)的窖泥，優(yōu)質(zhì)的窖泥能賦予濃香型白酒一種特殊的“窖香”[32]。但是，隨著生產(chǎn)次數(shù)增加，窖泥會(huì)出現(xiàn)老化，老化的窖泥含水量低和透水能力差，并由表及里發(fā)展，窖泥內(nèi)有白色粉末或細(xì)長(zhǎng)針狀結(jié)晶產(chǎn)生，白色粉末為乳酸鈣，而針狀結(jié)晶為乳酸亞鐵[33-35]。造成這一結(jié)果的主要原因是酒醅酸度過大，造成乳酸積累，乳酸與黃泥中的Ca2+、Fe3+結(jié)合形成乳酸鈣、乳酸鐵沉淀，這些沉淀在窖泥中積累，造成窖泥板結(jié)。劉樂樂等[32]將能夠降解乳酸合成己酸的酪丁酸梭菌、生孢梭菌和克氏梭菌按照一定比例混合制成功能微生物菌劑，用黃水稀釋液和大曲粉混合制成糊狀窖泥養(yǎng)護(hù)劑，酒窖起窖后，把糊狀窖泥養(yǎng)護(hù)劑均勻地敷在窖壁和窖底表面能降低窖泥中乳酸積累，有效地避免窖泥板結(jié)。

5 展望

從白酒生產(chǎn)環(huán)境（大曲、窖泥、酒醅及黃水）中分離篩選得到的乳酸降解菌再添加到白酒生產(chǎn)過程，能夠降低酒體中乳酸及乳酸乙酯含量，改善酒體的品質(zhì)。由于乳酸降解菌來(lái)源于生產(chǎn)環(huán)境，這些菌株對(duì)白酒生產(chǎn)過程中其他微生物的代謝活動(dòng)影響很小，具有很好的應(yīng)用前景。但目前研究者只是從發(fā)酵材料中對(duì)乳酸降解菌進(jìn)行分離篩選，對(duì)乳酸降解菌的種質(zhì)資源多樣性、群落結(jié)構(gòu)、代謝調(diào)控方面未作系統(tǒng)深入研究。

利用乳酸降解菌制備低乳酸和乳酸乙酯含量的調(diào)味酒，可以對(duì)高乳酸和乳酸乙酯含量的缺陷酒進(jìn)行調(diào)制，改善原酒的品質(zhì)。與將乳酸降解菌作為菌劑直接添加到釀酒過程相比，制備調(diào)味酒的生產(chǎn)投入更少，成本更低，這必將成為乳酸降解菌應(yīng)用領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。