華中烏蘞莓乙醇提取物成分分析及功能性研究

李亞婷，江 念

(1.長江大學，湖北 荊州 434026；2.湖北民族大學，湖北 恩施 445000；3.沙洋縣長湖濕地自然保護區(qū)管理局，湖北 荊門 448000)

華中烏蘞莓[Cayratiaoligocarpa(Levl. et Vant.) Gagnep]為葡萄科烏蘞莓屬草質藤本植物[1]，適應性強，性喜溫暖濕潤，在適宜的生存環(huán)境下生長十分迅速，田間、林下、山谷中均有分布，生物量巨大。烏蘞莓屬植物中富含多種有效成分，其中黃酮類物質為主要有效成分[2]，黃酮類物質具有抗氧化、抗炎、降血糖等作用[3-6]。目前從傳統(tǒng)中藥中提取有效成分用于臨床醫(yī)學中為當前研究熱點之一，黃酮類化合物作為功能成分，當前應用非常廣泛。黃酮類物質在乙醇中的溶解度最高，對華中烏蘞莓的乙醇提取物進行分析，深度了解華中烏蘞莓黃酮組分，是華中烏蘞莓的開發(fā)利用過程中必不可少的。

黃酮類獨特的生理結構使之有較強的清除自由基能力，許多植物黃酮均有較好的體內抗氧化活性[7-10]。以血清藥理學方法為基礎，以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazy，DPPH)自由基為指標[11-14]，研究在華中烏蘞莓乙醇提取物連續(xù)灌胃大鼠后，大鼠體內經消化吸收后含藥血清的抗氧化作用。采取長時間灌胃的方式處理大鼠，測定大鼠血清中丙二醛(Malondialdehyde，MDA)水平和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活力，研究華中烏蘞莓醇提物對大鼠體內抗氧化作用；采取連續(xù)灌胃的方式處理數(shù)天后對大鼠進行游泳試驗、閉氣生存試驗、抗饑餓試驗研究烏蘞莓對大鼠的抗疲勞效果和生存能力的影響，旨在為華中烏蘞莓的開發(fā)利用提供理論依據。

1 材料與儀器

1.1 儀器

主要試驗儀器見表1。

表1 主要儀器Table 1 Main instruments

1.2 試劑

蘆丁標準品、槲皮素標準品、綠原酸標準品、甲醇、無水乙醇、丙酮、石油醚均為分析純，乙腈、乙酸為色譜純。超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.3 材料

1.3.1 成分測定材料制備

取華中烏蘞莓全草，用自來水將根、莖和葉上的附著物清洗干凈，再以超純水沖洗3次，烘干粉碎，標號備用。準確稱取華中烏蘞莓粉末2.0 g，加入25 mL 80%的乙醇溶液，于80℃的恒溫水浴索氏提取，提取時間為2.5 h，提取結束后，濾渣抽濾過濾并用少量80%乙醇溶液沖洗，提取3次將提取液合并，用乙醇定容至100 mL，得華中烏蘞莓醇提物樣品液[10，15]。

1.3.2 大鼠灌胃材料材料制備

將華中烏蘞莓全草烘干并粉碎，用石油醚浸泡7天進行脫脂和脫脂溶性蛋白處理，浸泡后濾掉石油醚并烘干。用溶劑提取法進行提取，將提取液合并減壓濃縮。用三倍體積的堿性高濃度乙醇(pH9，濃度95%)溶解，過濾掉沉淀物取上清液，減壓濃縮，60℃烘干至恒重得華中烏蘞苺黃酮粗純物。以蘆丁為標準品經亞硝酸鈉—硝酸鋁—氫氧化鈉法測定黃酮粗純物得黃酮含量為84.35%。

1.3.3 試驗動物

健康昆明種雄性大鼠(SPF級SD大鼠)，購于三峽大學動物實驗中心，合格證號：SCXK(鄂)2011-0012。

2 試驗方法

2.1 光譜掃描

取華中烏蘞莓醇提物樣品液，以80%的乙醇溶液為對照，在190～700 nm波長范圍內對其進行紫外掃描。

2.2 成分分析

以液相色譜分析華中烏蘞莓乙醇提取物，流動相A為乙腈(流動相B為1.0%醋酸)，按0～20 min (18～60%)，20～30 min(60～100%)，柱溫25℃，進樣量20 μL，流速1.0 mL/min，檢測波長280 nm。質譜條件：電離源(EI)；電離電壓：70 V；電子轟擊能量：70.0 eV；氣體：N2；溫度：350℃；掃描范圍100～1 000 m/z[15]。

2.3 大鼠抗氧化試驗

2.3.1 短期試驗

2.3.1.1 含藥血清的制備 40只6周健康昆明種雄性鼠，體重(120±5) g，隨機分成8組，每組5只，灌服華中烏蘞莓黃酮樣品，灌胃劑量分別為10 ～250 mg/kg，對照組灌服5 mL蒸餾水，試驗前只給適量清水，禁食24 h，連續(xù)7次灌胃。每次給藥1.5 h后再次給藥，末次給藥后2 h斷頭取血，常溫靜置后，在轉速3 500 r/min的離心機中離心20 min，取血清置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆肹7]。

2.3.1.2 含藥血清對 DPPH清除率的測定 取經華中烏蘞莓黃酮粗提物處理后的大鼠血清0.5 mL，加入無水乙醇補足至2 mL，將2 mL血清—乙醇溶液和2 mL DPPH乙醇溶液(濃度為0.032 mg/mL)搖勻、震蕩至充分反應，充分搖勻后避光放置30 min，在轉速4 000 r/min的離心機中離心25 min，吸取上清液在波長517 nm下測定吸光度值。

清除率計算方式：清除率/%=[(A0-A1)/A0]×100，式中A0為DPPH—乙醇溶液的吸光度值，A1為樣品溶液的吸光度值[7]。

2.3.2 長期喂養(yǎng)試驗

40只昆明種大鼠隨機分為5組：正常對照組(灌胃4 mL蒸餾水)、維生素C陽性對照組(灌胃劑量50 mg/kg)、華中烏蘞莓黃酮處理低劑量組(灌胃劑量 50 mg/kg)、華中烏蘞莓黃酮處理中劑量組(灌胃劑量100 mg/kg)和華中烏蘞莓黃酮處理高劑量組(灌胃劑量200 mg/kg)，每組8只。每天上午9時灌胃，連續(xù)給藥7 周，試驗期間正常飲食。試驗進行7周后結束，禁食12 h，斷頭取血。按照試劑盒測定方法測定SOD與MDA。

2.4 大鼠抗疲勞試驗

24只昆明種大鼠隨機分為4組：正常對照組(灌胃4 mL蒸餾水)、華中烏蘞莓黃酮處理低劑量組(灌胃劑量50 mg/kg)、華中烏蘞莓黃酮處理中劑量組(灌胃劑量100 mg/kg)和華中烏蘞莓黃酮處理高劑量組(灌胃劑量200 mg/kg)，每組6只大鼠。每天上午9點灌胃，連續(xù)給藥7周，每周測體重一次，試驗期間正常飲食，注意觀測，7周后試驗結束[16]。

連續(xù)給藥7周后，每組取6只大鼠，讓大鼠在恒溫水槽(溫度37℃)中進行游泳，水槽深度為50 cm，長度60 cm，寬度50 cm，水槽中無障礙物。記錄大鼠開始游泳到沉底溺亡的時間，此時間即為游泳力竭時間。

2.5 大鼠生存能力試驗

48只昆明種大鼠隨機分為4組，每組12只大鼠。

2.5.1 大鼠抗缺氧試驗

連續(xù)給藥7周后，每組取6只大鼠，讓每只大鼠在2 L的密封性容器中，記錄大鼠窒息死亡時間[17]。

2.5.2 大鼠抗饑餓試驗

連續(xù)給藥7周后，每組取6只大鼠，正常飲水，禁止進食，觀察開始絕食開至大鼠因饑餓而死的時間。

2.6 數(shù)據分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據分析。

3 結果與分析

3.1 紫外-可見分光分析

由圖1可得，華中烏蘞莓乙醇提取物在280 nm處有最大紫外吸收。

圖1 華中烏蘞莓乙醇提取物紫外-可見光圖譜Fig. 1 UV-vis spectrum of ethanol extract from C. oligocarpa

3.2 成分分析

3.2.1 HPLC檢測

華中烏蘞莓黃酮粗提物由高效液相色譜(High performance liquid chromatography，HPLC)分離后，如圖2所示，檢測出華中烏蘞莓乙醇提取物成分主要有3種，出峰時間分別為8.34、14.64、19.14 min，由出峰時間以及和標準品相比對，初步判定三種成分為綠原酸、蘆丁和槲皮素[18]。

圖2 華中烏蘞莓乙醇提取物HPLC檢測Fig.2 Determination of ethanol extract in crude extracts by HPLC

3.2.2 質譜分析

由圖3可知，出峰時間為8.34 min的物質，其負離子量為353.1，正離子量為355.2。負離子圖中產生的兩個主要碎片質量為191.2和135.1，正離子圖中產生的兩個主要碎片質量為163.2和151.1。通過其碎片質量和正負離子量及綠原酸相對分子質量，確定為綠原酸。

圖3 綠原酸質譜圖Fig.3 Mass spectrum of the chlorogenic acid

由圖4可知，出峰時間為14.64 min的物質，負離子量為609.1，正離子量為611.2。負離子圖中產生的兩個主要碎片質量為301.1和273.1，正離子圖中產生的主要碎片質量為465.2。通過其碎片質量和正負離子量及蘆丁相對分子質量，確定為蘆丁。

圖4 蘆丁質譜圖Fig.4 Mass spectra of rutin

由圖5可知，出峰時間為19.14 min的物質，負離子量為301.2，正離子量為303.2。負離子圖中產生的兩個主要碎片質量為273.2和257.3，正離子圖中產生的主要碎片質量為275.1和257.1。通過其碎片質量和正負離子量及槲皮素相對分子質量，確定為槲皮素。

圖5 槲皮素質譜圖Fig.5 Mass spectrum of quercetin

3.3 含藥血清對DPPH清除率

圖6為不同灌胃劑量大鼠血清對DPPH的清除率，在給藥劑量0～150 mg/kg范圍內，隨著劑量的加大。大鼠血清對DPPH自由基的清除作用逐漸增加，劑量達到150 mg/kg后，隨著劑量的加大清除率呈現(xiàn)遞減趨勢。推測導致這一現(xiàn)象的原因為劑量過大對大鼠造成一定的毒害作用使其對黃酮的吸收能力減低；在劑量低于50 mg/kg范圍內隨著劑量的增加，大鼠血清對DPPH的清除率顯著增加(P<0.05)，劑量達到50 mg/kg后清除率增加不明顯，并在劑量150 mg/kg達到最大清除率。

圖6 劑量對DPPH清除率的影響Fig.6 The impacts of different gavage dose on DPPH scavenging rate注：不同小寫字母代表在p<0.05水平有顯著性差異，下同。

3.4 華中烏蘞莓醇提物對大鼠血清中SOD活性影響

表2為不同給藥劑量大鼠血清中的SOD活性，通過7周的給藥處理后，陽性對照(50 mg/kg VC處理)和華中烏蘞莓醇提物提高了大鼠血液中SOD活性；在給藥劑量范圍內，隨著劑量的加大大鼠血液中SOD活性逐漸增加，呈現(xiàn)出遞增趨勢，給藥劑量低、中、高三個濃度范圍內高濃度(200 mg/kg)SOD活性最高，且和其它組達到顯著性差異(P<0.05)，說明華中烏蘞莓醇提物能顯著提高大鼠血液中SOD活性。

表2 大鼠血清中SOD活性Table 2 Activities of SOD in serum of rats

3.5 華中烏蘞莓醇提物對大鼠血液中MDA含量影響

表3為不同給藥劑量大鼠血清中MAD含量，通過7周的給藥處理后，陽性對照(50 mg/kg VC處理)和華中烏蘞莓醇提物顯著降低了大鼠血液中的MDA值(P<0.05)；在給藥劑量范圍內，隨著劑量的加大大鼠血液中MDA值逐漸降低，并呈現(xiàn)出良好的線性，給藥劑量低、中、高三個濃度范圍內高濃度(200 mg/kg)MDA值最低，說明華中烏蘞莓醇提物能顯著降低大鼠血液中的MDA。

表3 大鼠血清中MDA含量Table 3 Contents of MDA in serum of rats

3.6 華中烏蘞莓醇提物對大鼠體重的影響

表4為大鼠體重，在7周的給藥處理中，華中烏蘞莓醇提物低劑量組和正常對照組各個時期體重基本一樣，有細微偏差；中劑量和高劑量組在試驗中期(中劑量組第4周開始，高劑量組第3周開始)大鼠在體重上略高于正常對照組，但效果不顯著(P<0.05)，說明華中烏蘞莓醇提物對大鼠體重有一定的增加效果，但效果不明顯。

表4 大鼠體重Table 4 Rat weights

3.7 華中烏蘞莓醇提物對大鼠游泳時間的影響

由表5可得，在給藥處理7周后，給藥低劑量組和中劑量組均能提高大鼠游泳時間，且中劑量組和其它組對比達到顯著水平(P<0.05)；高劑量組降低大鼠游泳時間，且和對照達到顯著水平(P<0.05)，可能是：大鼠在高劑量給藥處理7周后，體重增加造成游泳時間降低，或者是高劑量華中烏蘞莓醇提物長期處理對大鼠造成一定的生理毒害，造成體力有所下降[19]。

表5 華中烏蘞莓醇提物對大鼠游泳時間Table 5 Rat swimming time

3.8 華中烏蘞莓醇提物對大鼠抗窒息時間的影響

表6為不同給藥劑量大鼠窒息死亡時間，在給藥處理7周后，華中烏蘞莓醇提物三個劑量組均能提高大鼠在密封環(huán)境中的存活時間，且中劑量組效果最好，但和對照沒有顯著性差異。

表6 華中烏蘞莓醇提物對大鼠窒息死亡時間Table 6 Death time of rat asphyxia

3.9 華中烏蘞莓醇提物對大鼠饑餓時間的影響

由表7可得，在給藥處理7周后，華中烏蘞莓醇提物低劑量組合、中劑量組合和對照存活時間基本一致，中劑量組存活時間最長，高劑量處理組明顯低于對照。華中烏蘞莓黃酮處理大鼠后對其抗饑餓時間有一定影響，主要表現(xiàn)為中劑量延長饑餓致死時間，但效果不顯著，高劑量明顯縮短饑餓致死時間。分析原因為，高劑量組對大鼠有一定的毒害作用，或者高劑量組大鼠體重較大導致耗能較快以至于抗饑餓能力差。

表7 華中烏蘞莓醇提物處理后大鼠抗饑餓時間Table 7 Starvation leads to death

4 結論與討論

經液相色譜和質譜分析，華中烏蘞苺醇提物主要成分為蘆丁、綠原酸、和槲皮素。從試驗結果來看，灌服華中烏蘞莓醇提物能顯著增強小鼠的抗氧化能力，給藥劑量低于150 mg/kg范圍時，藥量與藥效呈現(xiàn)正相關趨勢，隨著劑量的增加，抗氧化效果越強，但達到150 mg/kg后，隨著劑量增加藥效反而下降，試驗說明短時間連續(xù)服用華中烏蘞莓黃酮時應注意劑量低于150 mg/kg。在試驗范圍內，華中烏蘞莓醇提物隨著劑量的增加對大鼠血液中SOD活性呈現(xiàn)出遞增的趨勢，在中、高劑量組中SOD活性高于陽性對照VC；隨著給藥劑量的加大，大鼠血液中MDA值逐漸降低，并呈現(xiàn)出良好的線性關系，在中、高劑量組中MDA值低于陽性對照VC。試驗說明在長期給藥試驗中，華中烏蘞莓醇提物對大鼠有很好的抗氧化效果[20]。在試驗范圍內，低劑量和中劑量的華中烏蘞莓醇提物對大鼠的抗疲勞有增效作用，中劑量組達到顯著水平；高劑量組對其抗疲勞效果以及抗饑餓能力有顯著性下降作用，目前分析為高劑量組體重增加造成游泳能力和抗饑餓能力下降或長時間高劑量給藥造成一定的毒害作用[19-21]。