登革病毒模擬ADE效應(yīng)中肝細(xì)胞lncRNA的差異表達(dá)

王效軍，黃 潔，梁慧琳，徐秀娟（廣東醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東東莞 523808）

登革病毒（DENV）有4 個(gè)血清型（DENV1?4）[1]，肝細(xì)胞對(duì)各型DENV普遍易感，不同血清型間具有一定的交叉免疫反應(yīng)，可發(fā)生抗體依賴的感染增強(qiáng)效應(yīng)（ADE）[2]。NS1 是DENV 中主要的非結(jié)構(gòu)蛋白，NS1抗體與細(xì)胞表面的相應(yīng)抗原相互作用并引起信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)細(xì)胞激活增加病毒產(chǎn)量和釋放，有助于DENV 的ADE 發(fā)病機(jī)制的形成[3]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）作為新的調(diào)控分子具有表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等功能在病毒感染中發(fā)揮重要生物學(xué)調(diào)控功能[4?5]，DENV 感染致肝細(xì)胞損傷中l(wèi)ncRNA 的表達(dá)及可能的生物學(xué)作用尚不明確。本研究模擬建立體外DENV 感染L?02 細(xì)胞的ADE 模型，探討DENV感染致ADE 中l(wèi)ncRNA 差異表達(dá)及可能的生物學(xué)作用，為登革熱的預(yù)防控制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 登革病毒液滴度測(cè)定

調(diào)整C6/36 細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，每孔加入100 μL懸液制備96孔板，DENV2病毒液（南方醫(yī)科大學(xué)病原生物系惠贈(zèng)）用RPMI?1640維持液（2%FBS）連續(xù)10 倍稀釋（10?1～10?8），用Reed?Muench 方法[6]計(jì)算病毒液的滴度（TCID50）。

1.2 L?02 細(xì)胞ADE 模擬感染條件的篩選及樣品制備

（1）RPMI?1640 培養(yǎng)基（10%FBS，1%青鏈霉素混合液）37 ℃（5%CO2）培養(yǎng)L?02細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，每孔加入1 mL懸液制備6孔板。

（2）鼠源抗DENV1 NS1 抗體用RPMI?1640 維持液（2%FBS）進(jìn)行1:160 稀釋，并與DENV2 病毒液（Moi=0.1、0.5、1.0）37 ℃孵育90 min，然后感染6 孔板中L?02 細(xì)胞模擬ADE 效應(yīng)；以RPMI?1640 維持培養(yǎng)基（2%FBS）作為對(duì)照組，每組準(zhǔn)備4份。

（3）染毒37 ℃（5%CO2）培養(yǎng)48 h 后，吸取上清，定量ELISA 試劑盒測(cè)定谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）吸光度值（OD），利用標(biāo)準(zhǔn)品建立回歸方程，用回歸方程計(jì)算每個(gè)感染滴度的數(shù)值。感染滴度計(jì)算AST/ALT 并依據(jù)如下標(biāo)準(zhǔn)判定[7]：AST/ALT<1.0為輕度損傷，AST/ALT≈1.0 為中度損傷，AST/ALT>1為重度損傷，AST/ALT>2為嚴(yán)重?fù)p傷。

（4）每個(gè)6 孔板吸凈培養(yǎng)上清后的細(xì)胞立即加入1 mL TRIzol 試劑，反復(fù)吹吸，吸到另一個(gè)2 mL EP 管中，ADE 和對(duì)照組每個(gè)感染滴度的細(xì)胞樣品各4 份，選擇AST/ALT比值最高的感染滴度，其中3份干冰送檢，另一份－80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RNA?Req及差異表達(dá)判定

（1）由華大基因公司進(jìn)行RNA 的提取、合成cD?NA 第二鏈經(jīng)過試劑盒純化并建立測(cè)序文庫(kù)，并用Il?lumina HiSeqTM2 000進(jìn)行測(cè)序。

（2）以FPKM 值作為衡量轉(zhuǎn)錄本或基因表達(dá)水平的指標(biāo)，ADE 感染組與對(duì)照組比較，計(jì)算log2ratio(ratio=ADE/對(duì) 照)，取log2(ratio)≥1.5 為高表達(dá)，log2(ratio)<1.5為低表達(dá)[8]。

1.4 差異表達(dá)lncRNA 潛在靶基因的功能注釋和預(yù)測(cè)

使用TopHat2軟件[9]將對(duì)比組差異表達(dá)的ln?cRNA 映射到不同的參考基因組，如果lncRNA 映射的位置在某個(gè)基因上游的啟動(dòng)子區(qū)域，則lncRNA 可能在轉(zhuǎn)錄或者轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[10]；如果lncRNA映射的位置在某個(gè)基因下游，則lncRNA可能參與其他調(diào)控作用[11]；采用RNAplex軟件[12]，依據(jù)最小自由能預(yù)測(cè)lncRNA 與正義鏈mRNA 最佳堿基配對(duì)結(jié)合而調(diào)控基因沉默、轉(zhuǎn)錄及mRNA 的穩(wěn)定性，通過PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)搜索其功能。

1.5 差異表達(dá)lncRNA的miRNA前體預(yù)測(cè)

研究發(fā)現(xiàn)一部分lncRNA 可做為miRNA 前體，通過酶的剪切后形成miRNA 行使相應(yīng)的功能，特別是成熟的miRNA 可以作用于多個(gè)位點(diǎn)，抑制翻譯過程或?qū)е禄虺聊?。利用miRPara軟件[13]或直接將ln?cRNA比對(duì)到miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)潛在的miRNA前體及其靶基因探討。

1.6 RT?qPCR驗(yàn)證

用TRIzol 試劑提取保存樣品的總RNA，試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，合成lncRNA 引物，在ABI7500 定量PCR 儀中應(yīng)用SYBR Green 法對(duì)差異表達(dá)的lncRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR[14]。擴(kuò)增后的結(jié)果用ΔCt（循環(huán)臨界值的差值）來評(píng)估每個(gè)組lncRNA的表達(dá)水平，計(jì)算方法為ΔCt=（lncRNA 的平均Ct）?（β?actin 的平均Ct），將ΔCt轉(zhuǎn)換為2?ΔCt表示lncRNA的相對(duì)表達(dá)量[15]。取均值計(jì)算，采用兩樣本t檢驗(yàn)比較lncRNA 在ADE組與對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量差異，并繪制柱狀圖。

1.7 主要數(shù)據(jù)庫(kù)

(1) DAVID 在線基因功能注釋數(shù)據(jù)庫(kù)，http://da?vid.abcc.ncifcrf.gov/；(2)Gene Ontology 數(shù)據(jù)庫(kù)，http://geneontology.org/page/go?database；(3)KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)，http://www.kegg.jp/；(4) miRBase 數(shù)據(jù)庫(kù)，http://www.cuilab.cn/hmdd。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS25.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同感染滴度L?02 細(xì)胞病變及培養(yǎng)上清AST、ALT、AST/ALT比值

培養(yǎng)48 h 后在倒置顯微鏡下觀察L?02 細(xì)胞病變，如圖1 可見，其中Moi=0.1 組細(xì)胞出現(xiàn)一定皺縮，折光度有增強(qiáng)；Moi=0.5 組細(xì)胞有一些脫落；Moi=1.0組細(xì)胞脫落明顯，皺縮和折光度增強(qiáng)；對(duì)照組細(xì)胞未出現(xiàn)明顯病變。

圖1 ADE感染L?02細(xì)胞狀態(tài)（48 h，200倍）

根據(jù)回歸方程計(jì)算得到每個(gè)感染滴度下的AST和ALT值，然后計(jì)算AST/ALT比值，如表1所示，L?02細(xì)胞在DENV2 感染48 h 后，感染滴度MOI 為0.5 時(shí)，AST/ALT 比值最高為2.74，因此，以MOI 為0.5，感染48 h為感染的最適條件，后續(xù)送檢樣品及RT?qPCR驗(yàn)證均以此為依據(jù)。

表1 ADE模擬致肝細(xì)胞損傷中轉(zhuǎn)氨酶檢測(cè)結(jié)果

2.2 LncRNA差異表達(dá)譜

本研究根據(jù)log2(ratio)≥1.5 為高表達(dá)，log2(ra?tio)<1.5為低表達(dá)的篩選標(biāo)準(zhǔn)，ADE 組中得到75 個(gè)差異表達(dá)的lncRNA，其中36 個(gè)高表達(dá)，39 個(gè)低表達(dá)。而這75 個(gè)差異表達(dá)的lncRNA 又可分為46 個(gè)已知lncRNA和29個(gè)未知lncRNA。

2.3 差異表達(dá)lncRNA潛在靶基因的注釋和預(yù)測(cè)

對(duì)差異表達(dá)lncRNA（前10）可能位于某潛在的靶基因上、下游預(yù)測(cè)結(jié)果如表2 所示：ADE 中有2 個(gè)lncRNA（XLOC023862，XLOC039796）位于某基因上游，2 個(gè)lncRNA（n344659，XLOC017926）位于某基因下游。通過堿基互補(bǔ)配對(duì)及最小自由能預(yù)測(cè)差異表達(dá)未知lncRNA（前10）與mRNA 是否存在互作關(guān)系，結(jié)果如表3所示：2個(gè)lncRNA（XLOC008997，XLOC029149）與mRNA（NM_002864，NM_032487）存在相互作用。對(duì)差異表達(dá)lncRNA調(diào)控的基因通過PubMed 數(shù)據(jù)庫(kù)搜索該基因的功能，檢索到n344659潛在靶標(biāo)為基因10236，其編碼蛋白具有miRNA前提處理功能。

表2 差異表達(dá)lncRNA(前10)與潛在靶基因上下游關(guān)系預(yù)測(cè)

表3 差異表達(dá)lncRNA(前10)與靶mRNA相互作用預(yù)測(cè)

2.4 差異表達(dá)lncRNA的pre?miRNA預(yù)測(cè)

在miRBase 數(shù)據(jù)庫(kù)中，已知lncRNA（前10）預(yù)測(cè)pre?miRNA，結(jié)果如表4。其中n344462 的預(yù)測(cè)結(jié)果中，hsa?let?7a?1 為腫瘤活性抑制因子，而hsa?let?7f?1可抑制Bcl?xL 基因的表達(dá)；未知lncRNA 預(yù)測(cè)得到的pre?miRNA，由于尚無(wú)成熟的數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)果僅以堿基序列的形式表達(dá)，見表5。

表4 已知lncRNA的pre?miRNA預(yù)測(cè)結(jié)果

表5 未知lncRNA的pre?miRNA預(yù)測(cè)結(jié)果

2.5 差異表達(dá)lncRNA驗(yàn)證結(jié)果

在ADE 與對(duì)照組中8 個(gè)高表達(dá)lncRNA（4 個(gè)已知，4 個(gè)未知）和8 個(gè)低表達(dá)lncRNA（4 個(gè)已知，4 個(gè)未知）中擴(kuò)增出8 個(gè)已知lncRNA，5 個(gè)未知lncRNA。根據(jù)循環(huán)參數(shù)差值在兩組間計(jì)算的相對(duì)表達(dá)量值2?ΔCt進(jìn)行兩樣本t檢驗(yàn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖2。

圖2 ADE與對(duì)照組lncRNA差異表達(dá)（2?Δct）

3 討論

LncRNA 參與宿主與病毒之間的相互作用及調(diào)控[10]，還可作為小RNA 的前體發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用[16]，影響細(xì)胞內(nèi)及生物體發(fā)育過程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[17]。在感染性疾病中差異表達(dá)及作用機(jī)制受到愈來愈多的關(guān)注。本研究通過建立ADE 模擬感染肝細(xì)胞，利用RNA?Seq 及生物信息學(xué)方法，根據(jù)設(shè)定的差異表達(dá)閾值得到差異表達(dá)的lncRNA。作為抗病毒感染和抗炎癥反應(yīng)中的負(fù)調(diào)控因子[18]，宿主的lncRNA可參與病毒的復(fù)制以及調(diào)控宿主的先天免疫反應(yīng)[19]以及調(diào)控內(nèi)源性miRNA 的表達(dá)功能[20]。本研究通過預(yù)測(cè)差異表達(dá)lncRNA 潛在的靶基因和miRNA 的前體，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了某些差異表達(dá)lncRNA 具有重要的生物學(xué)功能，利用RT?qPCR擴(kuò)增結(jié)果轉(zhuǎn)換成的相對(duì)表達(dá)量在對(duì)比組間的數(shù)值關(guān)系與生物信息學(xué)分析的差異表達(dá)結(jié)果基本一致。本研究初次得到的差異表達(dá)lncRNA信息可為深入研究登革病毒感染引起肝細(xì)胞損傷機(jī)制提供一定科學(xué)依據(jù)。