鎘抗性細(xì)菌的篩選及其生物礦化硫化鎘去除溶液中的鎘離子

徐韶足，張美麗，秦俊梅，曹曉霞，劉奮武

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，山西 太谷030801）

土壤和水體鎘[Cd（Ⅱ）]污染是一個全球性問題，其不僅對食品安全有負(fù)面影響，而且會增加健康風(fēng)險[1-2]。其中，Cd（Ⅱ）污染水體若未經(jīng)有效處理而任意排放或被用于農(nóng)田灌溉，將造成受納環(huán)境重金屬污染。因此，有必要從源頭上加強(qiáng)Cd（Ⅱ）污染水體的修復(fù)。在水體鎘污染的修復(fù)方面，各種常規(guī)處理方法如膜分離、電化學(xué)處理和化學(xué)沉淀等被廣泛用于重金屬污染廢水修復(fù)[3]。然而，這些常規(guī)方法價格昂貴[4]，尤其是當(dāng)廢水中的Cd（Ⅱ）濃度在1～100 mg·L-1的范圍內(nèi)時[5]。近年來，微生物修復(fù)法作為一種低能量消耗的處理方法，引起廣大科研工作者的高度關(guān)注，由于其材料易獲取、生態(tài)環(huán)保、易于操作等優(yōu)點，成為重金屬污染環(huán)境治理領(lǐng)域的研究熱點[6]。研究證實，微生物修復(fù)是通過微生物作用將生物可利用的有毒Cd（Ⅱ）遷移或轉(zhuǎn)化為低毒或無害物質(zhì)[6-8]。

微生物吸附劑，包括細(xì)菌、藻類、真菌和內(nèi)生菌等，已經(jīng)被廣泛研究并應(yīng)用于吸附重金屬離子[3，9-11]。微生物吸附過程主要發(fā)生在細(xì)胞外，包括物理吸附、離子交換和化學(xué)吸附[12-14]。除了生物吸附，生物礦化在水體重金屬修復(fù)上也有廣泛的應(yīng)用前景。生物礦化是微生物介導(dǎo)下把有毒重金屬轉(zhuǎn)化為不相容的危害較小的化合物[15]。目前，大多數(shù)研究都集中在生物合成金屬硫化物，因為生物體中天然富含硫，并且具有較低的內(nèi)在毒性[16]。已有大量的研究證實硫酸鹽還原菌能在厭氧條件下還原硫酸鹽生成硫化氫并參與多種重金屬離子的沉淀，在重金屬污染廢水處理中具有重要的應(yīng)用價值[16-19]。Wang等[20]研究發(fā)現(xiàn)熒光銅綠假單胞菌PseudomonasaeruginosaCW-96-1在有氧培養(yǎng)過程中，可以通過沉淀硫化鎘去除溶液中99%以上Cd（Ⅱ）。Sanghi等[21]發(fā)現(xiàn)固定化真菌Coriolus versicolor可以通過合成硫化鎘高效去除水溶液中的Cd（Ⅱ），2 h內(nèi)去除率達(dá)98%，同時合成粒徑100～200 nm硫化鎘納米顆粒。工程改造的大腸桿菌Treponema denticola通過過量表達(dá)半胱氨酸脫巰基酶促進(jìn)硫化鎘沉淀并有效去除水溶液中的Cd（Ⅱ）[22-23]。因此，微生物介導(dǎo)生物合成金屬硫化物可以作為一種強(qiáng)大的工具，應(yīng)用于有毒重金屬污水的生物修復(fù)，并有可能轉(zhuǎn)化為功能性納米顆粒[24]。鑒于此，本研究希望通過實驗室篩選純化獲得一株新的鎘抗性細(xì)菌，探究其通過生物合成硫化鎘應(yīng)用于Cd（Ⅱ）污水高效修復(fù)及其轉(zhuǎn)化為功能性納米材料的可能性，并對生物合成的硫化鎘顆粒進(jìn)行表征分析。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

土壤樣品采集于中國湖北大冶銅礦區(qū)，用鐵鍬取0～20 cm的地表土，裝入滅菌自封袋后帶回實驗室，保藏于4℃冰箱備用。土壤的部分化學(xué)和物理特性見表1。

1.2 試劑及培養(yǎng)基

主要試劑：硝酸鎘[Cd（NO4）2]、L-半胱氨酸（Lcysteine）；培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基、M9培養(yǎng)基；主要儀器：透射電子顯微鏡（TEM）、掃描電子顯微鏡（SEM）、能量色散X射線光譜（EDS）分析儀、X射線衍射分析（XRD）、熒光分光光度計（Shimadzu RF-5301）等。

1.3 菌種篩選與鑒定

將10 g重金屬污染的土壤添加到90 mL無菌去離子水中，在旋轉(zhuǎn)振蕩器充分振蕩30 min（180 r·min-1，28℃），然后放置0.5 h。取10 mL上清液接種至90 mL新鮮無菌含1 mmol·L-1Cd（Ⅱ）的LB培養(yǎng)基中，放置到28℃、180 r·min-1的搖床中，培養(yǎng)5 d；隨后培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到含有1 mmol·L-1Cd（Ⅱ）濃度的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)馴化培養(yǎng)3次；最后將馴化培養(yǎng)物連續(xù)稀釋接種到含有1 mmol·L-1Cd（Ⅱ）LB瓊脂平板上，28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 d；從含1 mmol·L-1Cd（Ⅱ）的固體平板中挑取單菌落，并進(jìn)行至少兩次劃線純化，將抗性水平穩(wěn)定、生長速度快的菌株甘油保藏于-80℃冰箱中備用。

表1土壤樣品的部分理化性質(zhì)Table 1 Selected chemical and physical properties of soils

純化的抗鎘菌株的分子鑒定通過16SrRNA基因測序確定。通過菌落PCR的方法，使用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-ACGGHTACCTTGTTTACGACTT-3′）擴(kuò)增基因16S rRNA[25]。PCR反應(yīng)條件：95℃，3 min；95℃，30 s；55℃，30 s；72℃，90 s；30個循環(huán)；72℃，7 min。然后使用PCR純化試劑盒（Sangon Biotech Co.Ltd.Shanghai，China）純化PCR產(chǎn)物，并由上海生物工程有限公司測序。將得到的16SrRNA在NCBI GenBank上比對核苷酸序列，并用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

通過在LB固體平板上劃線，培養(yǎng)72 h觀察其顏色、黏度及其他菌落特征。取生長指數(shù)期的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色和莢膜染色，在顯微鏡下觀察其形態(tài)特征。同時參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》，對細(xì)菌進(jìn)行生理生化實驗。

1.4 菌株對多種重金屬抗性測定

將菌株按照1%接種到液體LB培養(yǎng)基中（28℃，180 r·min-1）過夜培養(yǎng)，用新鮮滅菌LB培養(yǎng)基稀釋至初始OD600為0.5作為接種液，然后接種到含有不同濃度的CdNO3（0.5～10 mmol·L-1）、CuSO4·5H2O（0.5～15 mmol·L-1）、ZnSO4（0.5～30 mmol·L-1）、Pb（NO3）2（0.5～10 mmol·L-1）、CoCl3（0.5～10 mmol·L-1）、MnCl2·4H2O（0.5～30 mmol·L-1）和K2Cr2O7（0.5～2 mmol·L-1）的新鮮LB液體培養(yǎng)基中于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h。然后接種到LB瓊脂平板上，根據(jù)有無單克隆生長來評估各金屬的最低抑制濃度（MIC）。同時，按照相同的方法評估菌株N1905在M9培養(yǎng)基中對各金屬的抗性。

1.5 不同鎘濃度下菌株生長曲線測定

在液體培養(yǎng)物中評估不同鎘濃度條件下鎘抗性細(xì)菌菌株生長。將細(xì)菌在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，然后將培養(yǎng)物OD600稀釋至0.5作為接種溶液。按照1%的接種量接種到含有0、0.5、1、2、4 mmol·L-1或6 mmol·L-1Cd（Ⅱ）的50 mL LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在28℃下，180 r·min-1振蕩培養(yǎng)72 h，每8 h取樣通過分光光度計在600 nm測定吸光度。

1.6 菌株產(chǎn)硫化氫測定

選擇4種含硫物質(zhì)，分別是硫代硫酸鈉（Na2S2O3）、硫酸鈉（Na2SO4）、硫脲（CH4N2S）和L-半胱氨酸（Lcysteine），作為底物評估菌株的產(chǎn)硫化氫能力。將細(xì)菌在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，通過離心（8 000 r·min-1，15 min）收集細(xì)胞，用去離子（DI）水洗滌兩次，并重懸于M9基本培養(yǎng)基中使用初始OD600=0.5作為接種液。按照1%的接種量分別接種到含有2 mmol·L-1Na2S2O3、Na2SO4、CH4N2S和L-cysteine的M9液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再將滅菌醋酸鉛試紙懸掛于試管中，于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，如果醋酸鉛試紙變黑則為產(chǎn)硫化氫，反之為不產(chǎn)硫化氫。

1.7 菌株生物合成硫化鎘

將重懸于M9培養(yǎng)基的接種液（OD600=0.5）按照1%的接種量接種到含有2 mmol·L-1L-半胱氨酸和0.25～2.0 mmol·L-1硝酸鎘的M9液體培養(yǎng)基中，于28℃、180 r·min-1培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，在培養(yǎng)過程中不斷觀察培養(yǎng)物情況。同時，使用Shimadzu UV-Vis 3600光譜儀測定培養(yǎng)物的吸收光譜，在350 nm激發(fā)波長下使用Shimadzu RF-5301熒光分光光度計測量培養(yǎng)物發(fā)射光譜。

1.8 XRD、SEM-EDS和TEM分析

對于X射線衍射分析（XRD），首先離心（4℃，8 000 r·min-1，8 min）收集上述實驗條件下的樣品，并用PBS（pH 7.0）洗滌兩次并冷凍干燥，使用Cu Kα輻射下記錄2θ范圍從5°到80°的圖譜。為了進(jìn)行透射電子顯微鏡（TEM）分析，在培養(yǎng)24 h后離心收集樣品，然后將樣品沉淀用PBS（pH 7.0）洗滌兩次，并用4%戊二醛固定液固定4 h，然后在30%、50%、70%、90%和100%的乙醇中連續(xù)脫水。通過JEOL JSM-6390LV掃描電子顯微鏡（SEM，Tokyo，Japan）與OXFORD INCA x-sight能量色散X射線光譜儀（EDX，Abingdon，Oxfordshire，UK）觀察測定。上機(jī)前，所有樣品都進(jìn)行了噴金處理。使用200kV JEOL 2000FX常規(guī)TEM分析樣品之前進(jìn)行了超薄切片樣品制備，包括固定、脫水、浸泡、包埋、切片和染色等過程。

1.9 評估3種環(huán)境因子對菌株N1905去除Cd（Ⅱ）的影響

為了研究菌株N1905通過生物合成硫化鎘修復(fù)Cd（Ⅱ）污染水體的潛在用途，研究了不同初始L-半胱氨酸、不同pH和溶解氧飽和度對菌株去除鎘效果的影響。為了研究初始L-半胱氨酸濃度的影響，將菌株N1905細(xì)胞在LB中培養(yǎng)過夜，通過8 000 r·min-1離心15 min收集細(xì)胞，用去離子（DI）水洗滌兩次，并重懸于M9基本培養(yǎng)基中（初始OD600=0.5），然后向體系中加入L-半胱氨酸（0.5～20 mmol·L-1）和硝酸鎘（1 mmol·L-1），并在28°C、180 r·min-1搖床培養(yǎng)24 h。將24 h時的培養(yǎng)物以8 000 r·min-1離心15 min，使用原子吸收光譜法（AAS）分析上清液的Cd（Ⅱ）含量。在初始Cd（Ⅱ）濃度為1 mmol·L-1時，還測定了初始pH（5～9）和溶解氧對菌株N1905去除Cd（Ⅱ）的影響。所有的實驗設(shè)置3個重復(fù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 耐鎘細(xì)菌的鑒定

通過馴化篩選，獲得了數(shù)株可以在含1 mmol·L-1Cd（Ⅱ）的固體LB平板上生長的菌株。經(jīng)過在含1 mmol·L-1Cd（Ⅱ）的固體LB平板上多次劃線，發(fā)現(xiàn)有1株生長快速的菌株，命名為N1905。菌株N1905菌落較小，淡黃色，表面濕潤；革蘭氏陰性，呈短桿狀，沒有莢膜。生化實驗結(jié)果表明菌株N1905具有運動性，不能水解淀粉，不能液化明膠，也不能水解尿素，但可以利用單糖（葡萄糖）、蔗糖等。氧化酶和過氧化氫酶呈陽性，可以產(chǎn)吲哚乙酸。為了確定菌株N1905與已知菌株的進(jìn)化關(guān)系，將獲得的N1905菌株的16SrRNA基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對，通過序列同源性分析，N1905最接近Enterobacter ludwigii，顯示99%相似性，并且根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析（圖1），菌株N1905與Enterobacter ludwigii在同一類群中，關(guān)系最密切，故命名為Enterobacter ludwigiiN1905。

2.2 菌株重金屬離子最小抑菌濃度（MIC）

由表2可知，在液體LB和M9培養(yǎng)基中，菌株Enterobacter ludwigiiN1905可以分別耐受8 mmol·L-1和10 mmol·L-1Cd（Ⅱ）。除此，菌株N1905對其他多種重金屬如Cu（Ⅱ）、Mn（Ⅱ）、Zn（Ⅱ）、Pb（Ⅱ）、Co（Ⅱ）和Cr（Ⅵ）具有耐受性。這些結(jié)果說明，篩選的Cd（Ⅱ）抗性菌株N1905有著廣泛的重金屬抗性，這可能是由于其篩選純化自多種重金屬污染的土壤。生活在被污染土壤中的微生物往往會通過改變自身的生化和結(jié)構(gòu)特征、生理特性和遺傳基因等來適應(yīng)環(huán)境，從而產(chǎn)生各種機(jī)制應(yīng)對各種復(fù)雜的環(huán)境[26]。這一特性暗示菌株N1905對于多種重金屬復(fù)合污染的水體具有修復(fù)潛能。

表2菌株Enterobacter ludwigii N1905對不同重金屬的抗性/（mmol·L-1）Table 2 Tolerance/resistance of bacteria N1905 to heavy metals/（mmol·L-1）

2.3 菌株生長曲線

圖2顯示了菌株N1905在不同鎘濃度下測量的生長曲線，在含2 mmol·L-1Cd（Ⅱ）液體LB中仍然可以達(dá)到較高的生物量（48 h，OD600約為1.8）。同時也發(fā)現(xiàn)2 mmol·L-1Cd（Ⅱ）會干擾細(xì)菌的正常生長并延遲對數(shù)期，細(xì)菌生長受到明顯抑制。這可能是由于細(xì)胞正常代謝被細(xì)胞內(nèi)攝取的Cd（Ⅱ）或被吸附在細(xì)胞外表面上的Cd（Ⅱ）抑制[27-28]。

2.4 菌株催化L-半胱氨酸產(chǎn)硫化氫

在液體培養(yǎng)基中評估菌株N1905產(chǎn)硫化氫能力，分別在M9液體培養(yǎng)基中加入Na2S2O3、Na2SO4、CH4N2S和L-半胱氨酸4種底物，通過醋酸鉛試劑定性測定。結(jié)果表明，只有外加L-半胱氨酸情況下菌株N1905通過代謝產(chǎn)生硫化氫（表3）。已有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonasmaltophiliastrain SMCD1在提供L-半胱氨酸同樣能夠合成硫化氫，并沉淀硫化鎘[29]。因此，有必要評估L-半胱氨酸對菌株N1905去除Cd（Ⅱ）的影響。

表3菌株Enterobacter ludwigii N1905產(chǎn)硫化氫能力Table 3 Hydrogen sulfide production capacity of strainEnterobacter ludwigii N1905

2.5 添加L-半胱氨酸對菌株去除Cd（Ⅱ）的影響

如圖3所示，添加2 mmol·L-1L-半胱氨酸到不同初始Cd（Ⅱ）濃度的培養(yǎng)體系中可以明顯地去除或降低溶液中的Cd（Ⅱ）濃度。在初始Cd（Ⅱ）濃度為0.25、0.5 mmol·L-1和1 mmol·L-1時，培養(yǎng)3 h后，溶液中的Cd（Ⅱ）完全被菌株N1905固化，Cd（Ⅱ）去除率為100%。在Cd（Ⅱ）濃度高達(dá)2 mmol·L-1時，菌株N1905同樣可以明顯降低溶液中的Cd（Ⅱ），在3 h時去除溶液40.0%的Cd（Ⅱ）；隨著培養(yǎng)時間延長，繼續(xù)沉淀Cd（Ⅱ），在24 h時Cd（Ⅱ）去除率最大，達(dá)55.3%。同時在細(xì)菌N1905、硝酸鎘和L-半胱氨酸的共存培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)物懸浮液由最初白色不透明狀最終變?yōu)辄S色懸浮物，根據(jù)以前的報道初步證實菌株N1905通過生物合成硫化鎘高效去除溶液中的Cd（Ⅱ）[30]。該結(jié)果表明鎘抗性細(xì)菌N1905可以通過生物礦化硫化鎘用于Cd（Ⅱ）污染水體的生物修復(fù)。

2.6 不同環(huán)境因素對菌株生物合成硫化鎘去除Cd（Ⅱ）的影響

如圖4所示，結(jié)果表明初始L-半胱氨酸含量、pH和溶解氧飽和度均影響菌株對Cd（Ⅱ）的去除能力。在初始Cd（Ⅱ）濃度為1 mmol·L-1和初始L-半胱氨酸為2 mmol·L-1條件下，隨pH值升高，Cd（Ⅱ）去除率升高，在pH為4～9范圍內(nèi)，菌株N1905對Cd（Ⅱ）去除率為64.3%～100%（圖4A）。L-半胱氨酸是菌株產(chǎn)硫化氫沉淀硫化鎘的關(guān)鍵，因此有必要探究不同L-半胱氨酸添加量對菌株生物沉淀硫化鎘的影響。結(jié)果表明，初始Cd（Ⅱ）濃度為1 mmol·L-1，當(dāng)L-半胱氨酸濃度分別為0.5、1、2、4 mmol·L-1和8 mmol·L-1時，菌株N1905對Cd（Ⅱ）去除率分別為91.9%、73.7%、100%、100%和100%（圖4C）。不同初始Cd（Ⅱ）濃度處理的實驗結(jié)果表明，高濃度Cd（Ⅱ）濃度限制菌株高效解毒（圖3）。這些結(jié)果表明，水體Cd（Ⅱ）污染水平及L-半胱氨酸添加量對于高效Cd（Ⅱ）去除非常重要。同時，研究發(fā)現(xiàn)菌株N1905可以在少量氧氣存在條件下高效去除Cd（Ⅱ），其中液封條件下，鎘去除率最高，達(dá)97.7%（圖4B）。上述這些結(jié)果表明，菌株N1905可以通過生物合成硫化鎘應(yīng)用于多種復(fù)雜水溶液中重金屬Cd（Ⅱ）的高效去除。

2.7 菌株生物合成硫化鎘及其特征

為了進(jìn)一步分析合成的黃色沉淀物是否為硫化鎘晶體，離心收集培養(yǎng)后的黃色懸浮物，經(jīng)冷凍干燥，并通過XRD分析，見圖5A。從XRD圖譜中發(fā)現(xiàn)，在26.5°、44.0°和52.1°處顯示出3個明顯的峰，它們分別指向硫化鎘的（111）、（220）和（311）晶體面（圖5A），這與硫化鎘的面心立方（FCC）晶體結(jié)構(gòu)基本一致。XRD分析結(jié)果進(jìn)一步證實了硫化鎘晶體的形成。SEM分析結(jié)果表明細(xì)胞表面存在大量的顆粒物質(zhì)，經(jīng)EDS元素分析顯示其富含大量S元素和Cd元素，暗示顆粒物質(zhì)為硫化鎘納米顆粒（圖5C）。這一結(jié)果也說明菌株N1905可能主要在細(xì)胞外沉淀硫化鎘。超薄切片的TEM圖像進(jìn)一步證實菌株N1905在細(xì)胞外合成硫化鎘納米顆粒（圖5B）。這與光合細(xì)菌Rhodopseudomonas palustris生物合成硫化鎘顆粒機(jī)制不同，后者是在細(xì)胞內(nèi)合成后轉(zhuǎn)運至細(xì)胞外[31]。

同時，測定培養(yǎng)液的吸收和熒光光譜特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)物有明顯的吸收光譜峰和熒光光譜峰（圖6），這與先前所報道的硫化鎘納米顆粒的吸收峰一致。該結(jié)果表明菌株能夠利用L-半胱氨酸產(chǎn)硫化氫沉淀Cd（Ⅱ），并轉(zhuǎn)化為具有光學(xué)特性的硫化鎘納米顆粒。已有研究證明生物合成硫化鎘納米粒子依賴于由半胱氨酸脫巰基酶及其催化的L-半胱氨酸的硫化氫產(chǎn)生[29，32-34]。這說明菌株N1905可以向胞外分泌半胱氨酸脫巰基酶并參與沉淀硫化鎘顆粒。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，新篩選獲得的鎘抗性菌株N1905能夠利用L-半胱氨酸高效去除水溶液中的Cd（Ⅱ），并轉(zhuǎn)化為具有光學(xué)特性的硫化鎘納米顆粒。

3 結(jié)論

（1）從重金屬污染土樣中，通過馴化篩選分離獲得一株高抗Cd（Ⅱ）的菌株N1905，基于16SrRNA分析鑒定為Enterobacter ludwigiiN1905。

（2）菌株Enterobacter ludwigiiN1905具有多種重金屬耐受性，在液體LB中，N1905可以最高耐受8 mmol·L-1Cd（Ⅱ），液體M9中可以最高耐受10 mmol·L-1Cd（Ⅱ）。在不同Cd（Ⅱ）濃度下的生長曲線表明，高濃度重金屬Cd（Ⅱ）會干擾細(xì)菌的正常生長。

（3）菌株Enterobacter ludwigiiN1905在提供L-半胱氨酸條件下產(chǎn)硫化氫，并在細(xì)胞外沉淀Cd（Ⅱ），轉(zhuǎn)化為具有光學(xué)特性的硫化鎘納米顆粒。

（4）菌株Enterobacter ludwigiiN1905在培養(yǎng)基條件下通過生物礦化形成硫化鎘，對消除Cd（Ⅱ）污染有較好應(yīng)用潛力。

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