銅對背角無齒蚌幼蚌的組織損傷效應(yīng)研究

劉凱，陳修報，劉洪波，姜濤，楊健,*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇 無錫214081；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江中下游漁業(yè)生態(tài)環(huán)境評價和資源養(yǎng)護重點實驗室，江蘇 無錫214081）

銅（Cu）是生物體必需的微量元素之一，在維持機體正常代謝、生長發(fā)育和增強免疫力等方面有不可替代的作用[1]。然而，Cu也是目前我國淡水漁業(yè)生態(tài)環(huán)境中污染形勢最為嚴(yán)峻的重金屬[2]。《2018年中國漁業(yè)生態(tài)環(huán)境狀況公報》指出，我國江河天然重要漁業(yè)水域中Cu超標(biāo)面積占所監(jiān)測面積的8.7%（約4.4萬hm2），Cu平均濃度為0.000 5～0.045 mg·L-1；湖泊、水庫重要漁業(yè)水域中Cu超標(biāo)面積占所監(jiān)測面積的14.9%（約21萬hm2），Cu平均濃度為0.000 6～0.014 mg·L-1[2]。這勢必會威脅我國淡水水生生物安全以及人類健康。值得注意的是，Cu雖然是貝類等無脊椎動物的多種酶及血藍(lán)蛋白的重要成分[3-4]，但是當(dāng)Cu積累超過一定閾值時，便會對貝類等無脊椎動物產(chǎn)生嚴(yán)重的毒性效應(yīng)[5]，甚至?xí)@著降低其子代對Cu的耐受性[6]。

背角無齒蚌（Anodonta woodiana）是我國特有物種，目前在亞洲、歐洲、北美洲和中美洲廣泛分布[7-10]。因其具有營底棲生活（活動范圍狹?。?、對重金屬的高積累性[對重金屬的積累性較褶紋冠蚌（Cristaria plicata）、圓頂珠蚌（Unio douglasiae）、斑馬貽貝（Dreissena polymorpha）、三角帆蚌（Hypriosis cumingii）等貝類更強]及低代謝性、體內(nèi)積累的重金屬含量與水環(huán)境中重金屬含量呈簡單相關(guān)關(guān)系等優(yōu)勢，被篩選為“淡水貝類觀察”研究體系[8-10]中的專用指示生物，已成功應(yīng)用于水污染監(jiān)測及毒理學(xué)研究[8-12]。本實驗室前期研究表明，背角無齒蚌幼蚌較成蚌對重金屬（Cu、Cd）毒性更為敏感[12-13]，如Cu對幼蚌和成蚌的96 h-EC50分別為3.4 mg·L-1和22.1 mg·L-1，后者約是前者的7倍[12]。因此，背角無齒蚌幼蚌可能更適宜用于水環(huán)境Cu污染的毒性效應(yīng)研究。

組織切片在水生生物毒理學(xué)研究中應(yīng)用十分廣泛，是一種十分高效便捷的組織損傷研究技術(shù)。目前，有關(guān)Cu脅迫對背角無齒蚌抗氧化酶影響、細(xì)胞損傷和組織積累方面的研究較多[14-16]，然而組織切片的相關(guān)研究較少。因此本研究擬開展Cu對背角無齒蚌幼蚌的毒性實驗，進(jìn)而利用組織切片技術(shù)探究Cu對幼蚌鰓、斧足、外套膜和消化腺的組織損傷效應(yīng)，以期為淡水漁業(yè)生態(tài)環(huán)境Cu污染監(jiān)測模式動物開發(fā)以及水域生態(tài)環(huán)境污染評價提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

背角無齒蚌幼蚌（1齡），殼長（6.4±0.4）cm，采自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心南泉實驗基地，人工養(yǎng)殖以及水環(huán)境條件參考文獻(xiàn)[17]。

1.2 暴露實驗

鑒于我國尚沒有淡水貝類毒性實驗研究的標(biāo)準(zhǔn)方法，本研究參照被廣泛認(rèn)可的美國“Standard guide for conducting laboratory toxicity tests with freshwater mussel”（ASTME2455-06）[18]開展Cu對背角無齒蚌幼蚌的毒性暴露。

用刷子清洗幼蚌貝殼上的附著物，暫養(yǎng)2周以適應(yīng)實驗條件，每日投喂一次小球藻（Chlorella vulgaris），小球藻的投喂量為4×108個·L-1。實驗開始前3 d停止投喂，排空幼蚌腸道內(nèi)容物。根據(jù)本實驗室前期研究結(jié)果，Cu對背角無齒蚌幼蚌的96 h半效應(yīng)濃度（96 h-EC50）為3.4 mg·L-1[12]，以及我國漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（GB 11607—1989）中Cu限量（0.01 mg·L-1），用人工配制軟水（pH值7.3～7.5、硬度40～48 mg·L-1、堿度30～35 mg·L-1）[18]配制5個濃度（2.0、1.0、0.1、0.01、0.005 mg·L-1）的暴露組和1個對照組（0 mg·L-1）溶液，每組設(shè)置3個平行。實驗在貝類重金屬暴露系統(tǒng)中進(jìn)行，每個一次成型的玻璃缸中加入8 L溶液及16只幼蚌。實驗期間不投喂餌料，水溫控制在（20±1）℃，光照和黑暗比為16 h∶8 h，光強為1 000 lx，溶氧量＞5.0 mg·L-1。為保持Cu濃度穩(wěn)定，每24 h將溶液全部更換。在24、48、72、96 h分別從各濃度組取3只幼蚌用于組織切片，并根據(jù)陳修報等[13]建立的背角無齒蚌幼蚌死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)（幼蚌雙殼張開，用玻璃棒刺激不閉殼定義為死亡）監(jiān)測幼蚌存活情況，實驗期間無幼蚌發(fā)生死亡。

1.3 組織切片與觀察

解剖出幼蚌的鰓、外套膜、斧足及消化腺，放于組織20倍體積的波恩氏液中固定3 h，之后將組織塊置于自來水下，流水過夜沖洗以去除固定液。用梯度乙醇（70%1 h、80%1 h、90%40 min、95%40 min、100%Ⅰ20 min、100%Ⅱ20 min）浸泡使組織脫水，用分析純二甲苯將組織依次透明兩次（每次透明10 min），二甲苯∶石蠟（1∶1）浸泡1 h，石蠟（62℃）浸蠟3 h，用ES300-1型包埋機（金華市華速科技有限公司）將組織包埋在石蠟塊中，并用HS-3345型全自動切片機（金華市華速科技有限公司）切片，切片厚度為6μm，水浴鍋攤片，烘箱烘片，H.E染色（蘇木精染色5 min，1%鹽酸乙醇分色8 s，自來水返藍(lán)10 min，伊紅染色45 s），中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。本文參照李陽等[19]和Otludil等[20]報道的方法，以損傷效應(yīng)最為明顯的暴露96 h的蚌組織切片圖體現(xiàn)各類組織結(jié)構(gòu)的變化。

1.4 Cu濃度的測定

實驗開始前取各濃度組水樣30 mL用于測定Cu實際濃度。使用7500ce型ICP-MS（Agilent，美國）測定Cu濃度，通過元素標(biāo)準(zhǔn)添加回收法確定測定精度（Cu回收率為108.4%）。實際測得的Cu濃度為2.1、1.0、0.1、0.01、0.003 mg·L-1。由于實際濃度和理論濃度總體很接近，因此本研究應(yīng)用理論濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cu脅迫對鰓組織結(jié)構(gòu)的影響

背角無齒蚌的鰓主要由排列緊密的鰓絲構(gòu)成。對照組鰓絲結(jié)構(gòu)完整，鰓絲之間由絲間隔相連，其表面覆蓋有大量纖毛，鰓絲內(nèi)部由結(jié)締組織以及各種血細(xì)胞組成（圖1 A）。經(jīng)24 h暴露，各濃度組鰓組織均未出現(xiàn)明顯組織損傷。經(jīng)48 h暴露，0.1 mg·L-1暴露組開始出現(xiàn)色素細(xì)胞增多，且色素細(xì)胞數(shù)量隨著Cu濃度增加而逐漸增多；2.0 mg·L-1暴露組開始出現(xiàn)部分纖毛脫落。經(jīng)72 h暴露，0.01 mg·L-1暴露組開始出現(xiàn)色素細(xì)胞增多；1.0 mg·L-1暴露組開始出現(xiàn)少量細(xì)胞空泡化和部分纖毛脫落；2 mg·L-1暴露組開始出現(xiàn)細(xì)胞壞死。經(jīng)96 h暴露，0.01 mg·L-1暴露組色素細(xì)胞顯著增多且細(xì)胞出現(xiàn)空泡化（圖1C）；0.1 mg·L-1暴露組開始出現(xiàn)部分纖毛脫落且巨噬細(xì)胞增多（圖1D）；1.0 mg·L-1暴露組巨噬細(xì)胞持續(xù)增多，細(xì)胞空泡化和纖毛脫落加?。▓D1E）；2.0 mg·L-1暴露組鰓絲結(jié)構(gòu)出現(xiàn)萎縮，纖毛脫落和細(xì)胞空泡化嚴(yán)重，結(jié)締組織發(fā)生糜爛壞死（圖1F）。

2.2 Cu脅迫對斧足組織結(jié)構(gòu)的影響

斧足是背角無齒蚌的運動器官，主要由肌細(xì)胞組成，還存在一些色素細(xì)胞、黏液細(xì)胞及上皮細(xì)胞。實驗結(jié)果表明，對照組斧足組織結(jié)構(gòu)完整，肌細(xì)胞排列密集、核染色清晰，上皮細(xì)胞排列緊密，表面覆蓋有大量纖毛（圖2A）。經(jīng)24 h暴露，各濃度組斧足均未出現(xiàn)明顯組織損傷。經(jīng)48 h暴露，1.0 mg·L-1暴露組開始出現(xiàn)黏液細(xì)胞變形；2.0 mg·L-1暴露組開始出現(xiàn)黏液細(xì)胞變形以及上皮層損傷。經(jīng)72 h暴露，1.0 mg·L-1暴露組黏液細(xì)胞變形加重；2.0 mg·L-1暴露組黏液細(xì)胞變形且上皮層損傷加重。經(jīng)96 h暴露，0.005mg·L-1和0.01 mg·L-1暴露組的斧足均未出現(xiàn)明顯損傷（圖2B和圖2C）；0.1 mg·L-1暴露組開始出現(xiàn)細(xì)胞空泡化及上皮層損傷（圖2D）；1.0 mg·L-1暴露組細(xì)胞空泡化以及上皮層損傷進(jìn)一步加重（圖2E）；2.0 mg·L-1暴露組上皮層損傷和細(xì)胞空泡化嚴(yán)重，空泡相互連接導(dǎo)致表皮細(xì)胞處出現(xiàn)斷連，從而無法維持正常的組織形態(tài)（圖2F）。

2.3 Cu脅迫對外套膜組織結(jié)構(gòu)的影響

外套膜主要由內(nèi)、外單層表皮及結(jié)締組織組成，結(jié)締組織中分布著色素細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及少量肌細(xì)胞。對照組外套膜組織結(jié)構(gòu)始終保持完整，內(nèi)外上皮層細(xì)胞排列緊密，表面覆蓋有大量纖毛，少量色素細(xì)胞和巨噬細(xì)胞均勻地分布在結(jié)締組織中（圖3A）。經(jīng)24 h暴露，0.01 mg·L-1暴露組開始出現(xiàn)色素細(xì)胞增多，且色素細(xì)胞數(shù)量隨暴露濃度的增加而增多。經(jīng)過48 h和72 h暴露，各濃度組色素細(xì)胞持續(xù)增多。經(jīng)96 h暴露，0.01 mg·L-1暴露組色素細(xì)胞和巨噬細(xì)胞顯著增多（圖3C），0.1、1.0、2.0 mg·L-1暴露組色素細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量隨著暴露濃度的升高而增加（圖3D至圖3F）；2.0 mg·L-1暴露組開始出現(xiàn)上皮層損傷（圖3F）。

2.4 Cu脅迫對消化腺組織結(jié)構(gòu)的影響

消化腺由消化小管、結(jié)締組織和淋巴區(qū)域組成。對照組消化腺組織結(jié)構(gòu)始終保持完整，小管上皮排列整齊，結(jié)締組織充盈（圖4A）。經(jīng)24、48、72 h暴露，各濃度組消化腺均未出現(xiàn)明顯組織損傷。然而，經(jīng)過96 h暴露，0.01 mg·L-1暴露組開始出現(xiàn)小管上皮細(xì)胞變形、淋巴區(qū)域擴大以及結(jié)締組織萎縮（圖4C）；0.1、1.0、2.0 mg·L-1暴露組開始出現(xiàn)小管上皮細(xì)胞變形以及結(jié)締組織萎縮（圖4D至圖4F）。

3 討論

Cu是生物必需元素，參與合成多種酶。然而，當(dāng)Cu在生物體富集超過一定的閾值，就會對生物體產(chǎn)生嚴(yán)重的毒害作用。當(dāng)Cu濃度達(dá)到0.005～0.01 mg·L-1時，就可能對無脊椎動物產(chǎn)生毒性[21]。需要高度重視的是，我國江河、湖泊、水庫等重要漁業(yè)水域中Cu平均濃度為0.000 5～0.045 mg·L-1[2]，超標(biāo)率為8.7%（江河）～14.9%（湖泊、水庫）[2]，而養(yǎng)殖池塘中Cu濃度更是可高達(dá)2.0 mg·L-1[22]。本研究結(jié)果表明，當(dāng)Cu濃度達(dá)到0.01 mg·L-1時，便會對背角無齒蚌幼蚌的鰓、外套膜和斧足產(chǎn)生明顯的組織損傷，且損傷程度隨著Cu濃度的升高和暴露時間的延長不斷加重。值得注意的是，不同組織的損傷程度有明顯差異，這可能與不同組織對元素積累具有特異性有關(guān)[23]。這與尖膀胱螺（Physa acuta）經(jīng)Cu暴露的組織損傷結(jié)果相似[20]。

3.1 Cu對鰓的組織損傷效應(yīng)

隨著Cu濃度的增加，鰓出現(xiàn)色素細(xì)胞和巨噬細(xì)胞增多、細(xì)胞空泡化、鰓絲萎縮以及結(jié)締組織糜爛等現(xiàn)象。巨噬細(xì)胞增多一方面可以抵抗Cu對機體造成的損傷，另一方面其過量釋放的酶也會破壞正常的組織結(jié)構(gòu)、造成組織糜爛等現(xiàn)象。陳彩芳等[24]在以Cd脅迫泥蚶（Tegillarca granosa）的相關(guān)實驗中也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果。對紫貽貝（Mytilusedulis）鰓的研究也表明，Cu脅迫會引起鰓組織發(fā)生炎癥反應(yīng)，造成血細(xì)胞增多、鰓絲膨大等現(xiàn)象[25]。李雨奎[26]研究發(fā)現(xiàn)，背角無齒蚌鰓受高濃度Cu脅迫會出現(xiàn)細(xì)胞空泡化和鰓絲受損嚴(yán)重的現(xiàn)象。相較于外套膜、消化腺和斧足，鰓是本實驗中受損傷最嚴(yán)重的組織。這可能與該器官

的特殊功能有關(guān)，鰓是主要的呼吸和濾水器官且與水體中的重金屬離子接觸最為頻繁。水環(huán)境中的Cu可以通過離子通道主動運輸、被動擴散或者與金屬結(jié)合蛋白結(jié)合等途徑轉(zhuǎn)運到鰓中。Romeo等[27]研究表明Ruditapes decussatus的鰓對Cu的積累顯著大于消化腺等其他器官。井維鑫[28]研究發(fā)現(xiàn)，鰓是背角無齒蚌Cd積累量最高的器官之一。在對花鰍（Cobitis taenia）的研究中發(fā)現(xiàn)，鰓和肝臟的Cu積累量隨Cu濃度的增加而增加，且鰓積累量大于肝臟積累量[29]。綜上所述，鰓可能是背角無齒蚌幼蚌主要的Cu富集器官之一且對Cu毒性靈敏，適宜用作淡水漁業(yè)生態(tài)環(huán)境Cu污染監(jiān)測和毒性評價的靶器官。

3.2 Cu對斧足的組織損傷效應(yīng)

本研究發(fā)現(xiàn)斧足經(jīng)Cu脅迫會出現(xiàn)黏液細(xì)胞變形、細(xì)胞空泡化以及上皮層損傷等現(xiàn)象。黏液分泌增加是背角無齒蚌對多種類型壓力（包括物理刺激、化學(xué)刺激）的主要響應(yīng)方式之一。低濃度Cu脅迫時，黏液細(xì)胞分泌量增加，分泌黏液以隔絕水體，減少水體重金屬對機體影響。高濃度Cu脅迫時，表層的黏液和機體的代謝已經(jīng)難以抵抗Cu的毒性損傷，造成斧足細(xì)胞空泡化以及上皮層損傷。

3.3 Cu對外套膜的組織損傷效應(yīng)

Cu對背角無齒蚌外套膜的毒性效應(yīng)表現(xiàn)為色素細(xì)胞、巨噬細(xì)胞增多以及上皮層損傷等。以Cd脅迫背角無齒蚌也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果[30]。這與其他貝類的研究結(jié)果相一致，例如通過對尖膀胱螺進(jìn)行Cu暴露發(fā)現(xiàn)外套膜先是出現(xiàn)色素細(xì)胞增多，后隨Cu濃度增加和暴露時間的延長而出現(xiàn)細(xì)胞空泡化、上皮層損傷甚至壞死[20]。外套膜在0.01 mg·L-1暴露組，經(jīng)24 h暴露就開始出現(xiàn)色素細(xì)胞增多現(xiàn)象，可能是因為外套膜與外界水體接觸面積較大所引起的。然而，隨著Cu濃度增加和暴露時間延長，組織損傷程度沒有明顯加重，推測可能是因為外套膜表面覆蓋的纖毛起到了一定的屏障作用，大量的色素細(xì)胞和巨噬細(xì)胞也可以抵抗Cu脅迫對組織造成的損傷。

3.4 Cu對消化腺的組織損傷效應(yīng)

消化腺是產(chǎn)生消化酶、吸收養(yǎng)分、產(chǎn)生生物轉(zhuǎn)化酶以及金屬儲存和解毒的關(guān)鍵新陳代謝器官。本研究結(jié)果顯示背角無齒蚌幼蚌的消化腺在所有暴露組的前72 h內(nèi)均未出現(xiàn)明顯組織損傷，直到暴露96 h時在0.1 mg·L-1暴露組才開始出現(xiàn)小管上皮細(xì)胞變形和結(jié)締組織萎縮現(xiàn)象。相較于其他器官，消化腺對Cu脅迫的敏感性較弱，可能是因為消化腺不與水體直接接觸，且消化腺中存在一種黃色顆粒是重金屬的儲存場所，研究認(rèn)為其與各種金屬硫蛋白或脂褐素顆粒螯合使重金屬污染物解毒的機制有關(guān)[31]。因此，Cu對幼蚌消化腺毒性損傷較弱，消化腺組織損傷程度不明顯。

4 結(jié)論

（1）迄今報道的我國有8.7%的江河天然重要漁業(yè)水域，以及14.9%的湖泊、水庫重要漁業(yè)水域中Cu超標(biāo)，這些水域中Cu濃度已高于可導(dǎo)致背角無齒蚌幼蚌發(fā)生組織損傷效應(yīng)的水平。

（2）背角無齒蚌幼蚌對Cu毒性響應(yīng)靈敏，其中鰓相較于其他組織對Cu毒性最為敏感，適宜用作淡水漁業(yè)生態(tài)環(huán)境Cu污染監(jiān)測的靶器官。