酶解法提取山豆根多糖的工藝優(yōu)化

曹永強(qiáng)，孫 蓉，趙 怡，胡庭俊，于美玲

（廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530005）

山豆根為豆科植物越南槐（Sophora tonkinensisGagnep.）的干燥根和根莖，性味苦寒、歸肺、胃經(jīng)，具有清熱解毒、消腫利咽的功效[1-2]。山豆根主要活性成分有多糖、黃酮、生物堿、皂苷等[3-4]。山豆根多糖（Sophora subprostratepolysaccharide，SSP）是從山豆根中提取得到的總多糖。山豆根多糖具有清除自由基、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)的作用[5-8]。目前，山豆根多糖提取工藝有水提醇沉法、微波萃取法和超聲波提取法[9-11]。水提法操作簡單，但提取得率較低。超聲波和微波提取對設(shè)備要求較高，且對人體有一定的危害[12]。酶解法與其他提取法相比，反應(yīng)條件溫和、提取得率高、操作簡單、成本低、對設(shè)備要求不高。木瓜蛋白酶熱穩(wěn)定性高、酶活性高，是極具研究價(jià)值的提取用酶。本試驗(yàn)采用木瓜蛋白酶酶解法提取山豆根多糖，并優(yōu)化其提取工藝條件，為山豆根多糖藥理學(xué)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 藥品及試劑

山豆根（廣西玉林市祥生中藥飲片有限責(zé)任公司）、木瓜蛋白酶（酶活力≥6 000 U/mg，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司）、納氏比色管（天津市天科玻璃儀器制造有限公司）、氫氧化鈉、濃硫酸、堿性酒石酸銅、硫代硫酸鈉、磺基水楊酸、淀粉指示劑、95%乙醇、苯酚試劑等均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器設(shè)備

FW177 中藥粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器公司）、RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、FD-1-50 真空冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器公司）、UV-1800紫外可見光分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器公司）。

1.1.3 試劑配制

堿性酒石酸銅試液配制：稱取硫酸銅結(jié)晶6.93 g，加水使溶解成100 mL；稱取酒石酸鉀鈉結(jié)晶34.6 g與氫氧化鈉10 g，加水使溶解成100 mL。試驗(yàn)時(shí)將兩種溶液等量混合。

硫化鈉試液配制：稱取硫化鈉1 g，加水使溶解成10 mL。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 木瓜蛋白酶法提取山豆根粗多糖

稱取粉碎的山豆根4 g，按1∶15加入蒸餾水60 mL，浸泡30 min。調(diào)節(jié)pH 值，加入木瓜蛋白酶，充分混勻，置于水浴中反應(yīng)。過濾，殘?jiān)屑尤?0 mL 蒸餾水，沸水浴1.5 h。過濾，合并兩次濾液，蒸餾濃縮，加入5 倍量的95%乙醇，充分混勻，低溫靜置過夜（12 h 以上）；取上清液，離心（3 000 r/min、10 min），取沉淀加蒸餾水溶解（1∶5），靜置，離心（3 000 r/min、10 min），取上清液，加入5倍量95%乙醇沉淀，低溫靜置過夜；離心（3 000 r/min，10 min），沉淀部分加入95%乙醇攪拌，離心去乙醇，置于-20 ℃冰箱12 h以上，放入冷凍干燥機(jī)中干燥，得山豆根粗多糖，計(jì)算粗多糖得率。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取20 mg 葡聚糖，置于500 mL 容量瓶中，制成葡聚糖儲(chǔ)備液。分別取標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖儲(chǔ)備液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL 置試管中，每管加水至總體積為2.0 mL，各試管再加1.0 mL 6%苯酚試劑，混勻；加入5.0 mL 濃硫酸，靜置5 min，沸水中加熱15 min，轉(zhuǎn)入冷水冷卻至室溫。另以蒸餾水2.0 mL，如上操作設(shè)為空白對照，在吸收波長620 nm處測定吸光度值，以吸光度為橫坐標(biāo)，葡聚糖質(zhì)量為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。求得線性回歸方程：y=163.43x+3.059 9，其中y為葡聚糖質(zhì)量，x為吸光度，相關(guān)系數(shù)R2=0.992 8。

1.2.3 山豆根多糖總糖含量測定

稱取5 mg山豆根粗多糖，置于100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容到刻度線。吸取1.0 mL，加苯酚硫酸試劑6.0 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的操作，測定吸光度，得山豆根多糖的吸光度為0.252，代入1.2.2線性回歸方程，計(jì)算山豆根多糖總糖含量。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

1.2.4.1 酶解濃度對山豆根多糖得率的影響

酶解條件設(shè)定為酶解溫度50 ℃、pH 值5、酶解時(shí)間2 h，分別采用0.1%、0.5%、1.0%、2.0%和4.0%酶解濃度進(jìn)行提取。每組酶濃度做3個(gè)平行，取平均值。計(jì)算山豆根多糖得率。

1.2.4.2 酶解溫度對山豆根多糖得率的影響

酶解條件設(shè)定為酶解濃度2.0%、pH 值5.0、酶解時(shí)間2.0 h，分別采用40、45、50、55、60 ℃酶解溫度進(jìn)行提取，每組酶解溫度做3個(gè)平行，取平均值。計(jì)算山豆根多糖得率。

1.2.4.3 酶解pH值對山豆根多糖得率的影響

酶解條件設(shè)定為酶解濃度2.0%、酶解溫度55 ℃、酶解時(shí)間2.0 h、分別采用pH值為5、6、7、8、9的條件進(jìn)行提取，每組pH值做3個(gè)平行，取平均值。計(jì)算山豆根多糖得率。

1.2.4.4 酶解時(shí)間對山豆根多糖得率的影響

酶解條件設(shè)定為酶解濃度2.0%、酶解溫度55 ℃、pH值5，分別采用1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h酶解時(shí)間進(jìn)行提取，每組酶解時(shí)間做3個(gè)平行，取平均值。計(jì)算山豆根多糖得率。

1.2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，按照4因素3水平進(jìn)行L9（34）試驗(yàn)，確定提取山豆根多糖的最佳參數(shù)。正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Tab.1 L9（34）orthogonal test factors and level design

1.2.6 山豆根多糖酶法提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

在正交試驗(yàn)得出的最佳條件下重復(fù)多糖提取和測定多糖含量（1.2.1、1.2.2和1.2.3）。同時(shí)采用水提醇沉法提取山豆根多糖。具體操作如下：稱取山豆根300 g，加入15倍蒸餾水于沸水中提取3 次，每次1.5 h，3 次提取液合并，并濃縮至300 mL，剩余步驟同上述酶解法。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對山豆根多糖提取率的影響

2.1.1 木瓜蛋白酶濃度對山豆根多糖得率的影響（見圖1）

由圖1 可知，當(dāng)木瓜蛋白酶的濃度小于2%時(shí)，隨著酶濃度的上升，多糖得率升高；當(dāng)濃度超過2%時(shí)，多糖得率逐漸下降。因此，木瓜蛋白酶的最適提取濃度是2%。

圖1 木瓜蛋白酶濃度對山豆根多糖得率的影響Fig.1 The effect of papain concentration on the yield of SSP

2.1.2 酶解溫度對山豆根多糖得率的影響（見圖2）

由圖2可知，隨著溫度升高，多糖得率稍有降低，繼而升高。當(dāng)達(dá)到55 ℃時(shí)，多糖得率達(dá)到最大。溫度繼續(xù)升高，多糖得率下降。因此，木瓜蛋白酶酶解最適溫度為55 ℃。

圖2 酶解溫度對山豆根多糖得率的影響Fig.2 The effect of enzymatic hydrolysis temperature on the yield of SSP

2.1.3 pH值對山豆根多糖得率的影響（見圖3）

由圖3 可知，當(dāng)pH 值為5 時(shí)，多糖得率達(dá)到最高。因此，木瓜蛋白酶酶解的最適pH值為5。

圖3 pH值對山豆根多糖得率的影響Fig.3 The effect of pH value on the yield of SSP

2.1.4 酶解時(shí)間對山豆根多糖得率的影響（見圖4）

由圖4可知，隨著酶解時(shí)間的增加，多糖得率先升高后降低再升高，當(dāng)酶解時(shí)間為3 h時(shí)，多糖得率達(dá)到最高。因此，木瓜蛋白酶酶解的最適時(shí)間為3 h。

圖4 酶解時(shí)間對山豆根多糖得率的影響Fig.4 The effect of enzymatic hydrolysis time on the yield of SSP

2.2 木瓜蛋白酶提取山豆根多糖正交試驗(yàn)結(jié)果（見表2）

通過單因素試驗(yàn)，初步優(yōu)化條件為酶濃度2%、酶解溫度55 ℃、pH 值5、酶解時(shí)間3 h。在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。

由表2 可知，不同因素對山豆根多糖含量影響的順序?yàn)椋好笣舛龋久附鉁囟龋久附鈺r(shí)間＞酶解pH值，最佳工藝條件為A3B3C1D1，即酶濃度2%、酶解溫度55 ℃、酶解時(shí)間3 h、酶解pH值5。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Orthogonal test results

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

酶解工藝最優(yōu)條件下，木瓜蛋白酶提取山豆根粗多糖得率為5.11%，總糖含量達(dá)88.48%，水提法得率為3.54%，木瓜蛋白酶提取法得率是水提法得率的1.4倍。

3 討論

山豆根多糖具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒和清除自由基等作用，是極具研究價(jià)值的中草藥活性成分。酶解法是多糖提取的主要方法之一，具有提取得率高、安全可靠等特性。但是，目前對山豆根多糖的研究較少。木瓜蛋白酶具有熱穩(wěn)定性高、酶活性高、安全可靠等優(yōu)點(diǎn)[12]，在荸薺皮多糖、枸杞多糖、五味子多糖、辣木多糖、靈芝多糖等中藥多糖提取中廣泛應(yīng)用[13-17]，提取效果較好。本試驗(yàn)以山豆根為原料，采用木瓜蛋白酶酶解法提取多糖，在最佳工藝下山豆根粗多糖得率為5.11%，總糖含量達(dá)88.48%。許海棠等[18]研究發(fā)現(xiàn)，水提法得率為3.98%。帥學(xué)宏[19]研究發(fā)現(xiàn)，水提法得率為3.26%，總糖含量為56.74%，與酶解法相比水提醇沉法得率明顯偏低且提取時(shí)間較長。徐建平等[9]研究發(fā)現(xiàn)，微波提取法得率為3.27%。彭湘君等[20]研究發(fā)現(xiàn)，微波提取法得率為3.62%，與酶解法相比微波提取法得率偏低，設(shè)備要求高。賴紅芳等[10]研究發(fā)現(xiàn)，超聲波提取得率為6.08%。超聲波提取法雖然得率有所提高，但對設(shè)備要求高、經(jīng)濟(jì)成本高、對人體有一定的傷害。

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，過高的溫度并不能提高多糖得率，隨著溫度升高，反應(yīng)物能量增加，使反應(yīng)速度加快；但當(dāng)超過其最適溫度后，酶蛋白質(zhì)變性，使得酶活力減弱，反應(yīng)速度也隨著溫度的升高迅速下降。酶解pH值為9多糖得率較高，略低于pH值為5的得率，因?yàn)閴A性環(huán)境有利于多糖的浸出。但pH值過高導(dǎo)致酶的活性降低。酶只有在一定的pH值時(shí)，其活性才會(huì)達(dá)到最高。偏離該值，無論pH值是增加或減少，酶的活性均會(huì)下降，進(jìn)而導(dǎo)致多糖得率下降。汪建紅等[13]、薛俊禮等[15]和丁霄霄等[17]研究表明，木瓜蛋白酶提取多糖或者含有木管蛋白酶的復(fù)合酶提取多糖pH值均在5左右，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。通過與水提法的比較可知木瓜蛋白酶能提高山豆根多糖提取得率，縮短提取時(shí)間，為山豆根多糖進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。目前，多糖提取已有微波輔助酶解法[15]和復(fù)合酶提取法[17]。木瓜蛋白酶酶解法可以和其他酶復(fù)合使用或者與微波法聯(lián)合提取山豆根多糖，進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝，獲得更高得率的山豆根多糖提取方法。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，得出影響山豆根多糖得率指標(biāo)的因素大小順序?yàn)槊笣舛?酶解溫度>酶解時(shí)間>酶解pH 值，最佳工藝條件為酶濃度2%、酶解溫度55 ℃、酶解時(shí)間3 h、酶解pH值5。