乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法研究進(jìn)展

趙 瑞，楊世杰，楊 艷，段玉娟

昆明雪蘭牛奶有限責(zé)任公司，云南昆明 650217

三聚氰胺是一種含氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)66.6%的化工原料，常用于生產(chǎn)三聚氰胺-甲醛樹(shù)脂的表面涂層、塑料、阻燃劑等[1]。由于凱氏定氮法并不能將非蛋白氮與蛋白質(zhì)中的氮進(jìn)行良好的區(qū)分，曾有不法商家利用該蛋白質(zhì)檢測(cè)方法的漏洞，在乳制品中人為添加三聚氰胺以提高乳制品蛋白質(zhì)含量的測(cè)得值。2008年震驚全國(guó)的三聚氰胺事件由此而來(lái)。然而《國(guó)際化學(xué)品安全手冊(cè)》（第三卷）和國(guó)際化學(xué)品安全卡片中均有說(shuō)明：三聚氰胺的大鼠口服半數(shù)致死量大于3g／kg·bw，被認(rèn)為輕微毒性，長(zhǎng)期或反復(fù)大量攝入三聚氰胺可能導(dǎo)致膀胱結(jié)石、腎結(jié)石。三聚氰胺本身毒性較低，但通過(guò)食物攝入體內(nèi)進(jìn)入腎細(xì)胞后，三聚氰胺會(huì)與氰尿酸結(jié)合形成結(jié)晶沉積，從而造成腎結(jié)石并堵塞腎小管，并有可能導(dǎo)致腎衰竭。泌尿系統(tǒng)尚未成熟的嬰幼兒對(duì)三聚氰胺的反應(yīng)則更為敏感，嬰幼兒同時(shí)又是奶粉食用的最大群體。因此，《GB／T22388—2008原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法》中規(guī)定了原料乳及乳制品中三聚氰胺的限量值分別為：嬰兒配方食品限量要求1mg／kg；其他食品限量要求2.5 mg／kg[2]。

現(xiàn)行有效的乳制品中三聚氰胺的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)及方法有：《GB/T22388—2008原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法》，第一法高效液相色譜法（HPLC法），第二法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法（LC-MS/MS法），第三法氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法〔包括氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS），氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法（GC-MS/MS）〕；《GB/T22400—2008原料乳中三聚氰胺快速檢測(cè)液相色譜法》；《SN/T3032—2011出口食品中三聚氰胺和三聚氰酸檢測(cè)方法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》；《SN/T2805—2011出口液態(tài)乳中三聚氰胺快速測(cè)定拉曼光譜法》；《SN/T3627—2013出口液態(tài)原料乳中三聚氰胺的測(cè)定極譜法》；《SN/T4538.1—2016商品化試劑盒檢測(cè)方法三聚氰胺方法一》酶聯(lián)免疫競(jìng)爭(zhēng)法；《SN/T4538.2—2016商品化試劑盒檢測(cè)方法三聚氰胺方法二》，包含酶聯(lián)免疫吸附法和膠體金法；《SN/T4538.3—2016商品化試劑盒檢測(cè)方法三聚氰胺方法三》為膠體金試紙法；《SN/T4538.4—2016商品化試劑盒檢測(cè)方法三聚氰胺方法四》膠體金法；《SN/T4479—2016出口原奶和奶粉中三聚氰胺的檢測(cè)方法酶聯(lián)免疫吸附法和膠體金法》；《DB34/T863—2008生鮮牛奶中三聚氰胺的測(cè)定》，安徽省地方標(biāo)準(zhǔn)，包含液相色譜法以及氣相色譜質(zhì)譜法；《DB34/T1374—2011生鮮乳中三聚氰胺的測(cè)定-酶聯(lián)免疫吸附法》。表1對(duì)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)及檢測(cè)方法進(jìn)行了梳理。

表1 現(xiàn)行有效的三聚氰胺檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)、方法、適用樣品、定量限比較

除上述現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中采用的檢測(cè)方法外，基于紅外光譜、傳感器、免疫熒光、適配體等技術(shù)的檢測(cè)方法在文獻(xiàn)中亦有相關(guān)報(bào)道，本文就上述提及的檢測(cè)方法進(jìn)一步予以討論。

1 基于色譜分離技術(shù)的儀器方法

基于色譜分離的儀器方法是目前質(zhì)檢部門及大多第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)采用的主要方法。依賴于色譜儀器良好的重復(fù)穩(wěn)定性，成熟的檢測(cè)方案、可獲得穩(wěn)定可靠的檢測(cè)數(shù)據(jù)。

1.1 高效液相色譜法（HPLC）

GB/T22400—2008及GB/T22388—2008第一法、DB34/T863—2008第一法均為高效液相色譜法。其中GB/T22400—2008前處理較為簡(jiǎn)便，僅使用乙腈作為原料乳中的蛋白質(zhì)沉淀劑和三聚氰胺提取劑，通過(guò)強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜柱進(jìn)行分離，使用紫外檢測(cè)器（240nm）或二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法定量。由于前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，并未對(duì)樣品進(jìn)行細(xì)致純化，因此抗干擾性能差，僅適合用作生鮮乳及無(wú)添加液態(tài)乳的樣品檢測(cè)，且所使用的強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜柱比常用的C18、C8色譜柱昂貴。GB/T22388—2008和DB34/T863—2008的HPLC方法前處理原理大致相同，都是通過(guò)三氯乙酸等物質(zhì)沉淀蛋白后，使用陽(yáng)離子交換萃取柱凈化樣品，之后通過(guò)C18/C8色譜柱進(jìn)行分離，240nm/235nm波長(zhǎng)檢測(cè)。

北京市飼料監(jiān)察所魏秀蓮等[3]采用與G B/T22400—2008類似的方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，三聚氰胺在牛奶中的平均回收率在85.9%～98.4%，當(dāng)添加質(zhì)量濃度低時(shí)，回收率也會(huì)相應(yīng)降低，但回收率也在75%～85%（添加量為0.05mg/kg時(shí)，回收率約在78%；添加量過(guò)低時(shí)，回收率的穩(wěn)定性不好）君樂(lè)寶乳業(yè)王玉英等[4]使用三氯乙酸和乙腈提取樣品后經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾，HPLC分析（色譜柱：C18-4.6mm×250mm×5.0μm,流動(dòng)相：離子對(duì)試劑緩沖液-乙腈（80+20，體積比），流速：1mL/min,進(jìn)樣量：20μL；柱溫：40℃；波長(zhǎng)：240nm）在2.0ppm、2.5ppm、4ppm的加標(biāo)測(cè)試中獲得了95.15%～99.12%的加標(biāo)回收率，處理時(shí)間相對(duì)GB/T22388—2008第一法約縮短3h，但該方法的檢出限較高，為0.5ppm。

1.2 液相色譜-質(zhì)譜質(zhì)譜法（LC-MS/MS）

試樣經(jīng)提取后，經(jīng)陽(yáng)離子交換固相萃取柱凈化，用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法進(jìn)行測(cè)定。SN/T3032—2011及GB/T22388—2008第二法二者均為L(zhǎng)C-MS/MS法，二者稍有不同。GB/T22388—2008第二法前處理過(guò)程與其第一法基本一致，采用強(qiáng)陽(yáng)離子交換與反向C18混合填料色譜柱分離，MS/MS外標(biāo)法定量。SN/T3032—2011則是主要使用乙腈和鹽酸作為蛋白沉淀劑和三聚氰胺提取劑，并在提取過(guò)程中加入三聚氰胺同位素內(nèi)標(biāo)，提取液經(jīng)陽(yáng)離子交換固相萃取柱凈化，采用HILIC色譜柱分離，MS/MS內(nèi)標(biāo)法定量。LC-MS/MS中流動(dòng)相不能使用難揮發(fā)性的鹽，所以不能使用離子對(duì)試劑，C18/C8反相色譜柱不能作為L(zhǎng)C-MS/MS的分離柱。離子交換色譜柱能夠滿足液相色譜一質(zhì)譜法對(duì)流動(dòng)相的要求，所以常使用的流動(dòng)相為乙酸銨/甲酸銨緩沖液[5]。

國(guó)家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心王浩等[6]將嬰幼兒配方乳粉樣品經(jīng)堿性乙腈提取，以MGⅢ-C18色譜柱分離，流動(dòng)相為60mmol/L乙酸銨溶液（含0.4‰甲酸）和甲醇，梯度洗脫，流速為0.25mL/min。采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)正離子或負(fù)離子模式，可以同時(shí)對(duì)嬰幼兒配方乳粉中的三聚氰胺、氯霉素、甲硝唑和洛硝達(dá)唑進(jìn)行快速定性和定量測(cè)定。三聚氰胺檢出限可達(dá)50ppb，回收率在50～2500ppb加標(biāo)條件下為60.1%～68.1%。

1.3 氣相色譜質(zhì)譜法（GC-MS）及氣相色譜質(zhì)譜質(zhì)譜法（GC-MS/MS）

GB/T22388—2008第三法為GC-MS及GC-MS/MS方法，DB34/T863—2008第二法亦為GC-MS方法。試樣經(jīng)超聲提取、固相萃取凈化后，進(jìn)行硅烷化衍生，衍生產(chǎn)物采用選擇例子監(jiān)測(cè)質(zhì)譜掃描模式（SIM）或多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜掃描模式（MRM）,用化合物的保留時(shí)間和質(zhì)譜碎片化的豐度比定性，外標(biāo)法定量。GB/T22388—2008中GC-MS方法定量限可達(dá)0.05 mg/kg，GC-MS/MS方法可達(dá)0.005 mg/kg。DB34/T863—2008中GC-MS方法檢出限為0.05 mg/kg.

浙江省飼料監(jiān)察所朱聰英等[7]采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）法，建立了生鮮乳中三聚氰胺及其類似物的定性定量測(cè)定方法。試樣中的三聚氰胺及其類似物經(jīng)（乙腈∶水∶二乙胺=5∶4∶1，V/V）提取，飽和乙酸鉛溶液沉淀蛋白后，氮?dú)獯蹈?，用BSTFA進(jìn)行衍生化，氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定。采用色譜保留時(shí)間和質(zhì)譜碎片離子豐度比定性，內(nèi)標(biāo)法定量。采用SCAN全掃描的方式進(jìn)行儀器方法學(xué)研究，每種化合物確定4 個(gè)碎片離子作為監(jiān)測(cè)離子，進(jìn)行SIM模式定性定量分析。該方法三聚氰胺檢出限為0.1 mg/kg，0.5～50.0 mg/kg的加標(biāo)回收率為79.2%～110.0%。廣州市質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院冼燕萍等[8]建立了奶粉中三聚氰胺及其同系物（三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸二酰胺）含量的氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定方法。樣品經(jīng)溶劑提取后，取少量提取液氮吹干，硅烷化衍生后，用氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定。三聚氰胺及其同系物在0.01～0.5 mg/kg呈線性，方法檢出低限為0.15 mg/kg。在添加水平為0.5～2.0 mg/k g時(shí)，回收率為9 1.1%～1 0 1.3%，變異系數(shù)為2.5%～5.7%。

1.4 其他色譜方法

除國(guó)標(biāo)中使用的色譜方法，亦有其他基于色譜分離技術(shù)的方法用于三聚氰胺的檢測(cè)。毛細(xì)管電色譜是將毛細(xì)管柱內(nèi)填充或鍵合固定相，以電滲流為驅(qū)動(dòng)力，結(jié)合了微徑高效液相色譜與毛細(xì)管電泳兩者的特點(diǎn)，具有高柱效、快速分離、高選擇性、高精度以及試劑和樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)，但單純的CEC模式易產(chǎn)生氣泡、干柱等問(wèn)題。而加壓毛細(xì)管電色譜（pCEC）通過(guò)微型液相色譜泵在毛細(xì)管電色譜柱一端施加壓力，壓力的引入使CEC分離過(guò)程受pH和緩沖液的限制相對(duì)減少，可有效地解決CEC的氣泡問(wèn)題，且能實(shí)現(xiàn)梯度洗脫；用電滲流和泵壓同時(shí)驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相，溶質(zhì)依據(jù)它們?cè)诹鲃?dòng)相與固定相中分配系數(shù)的不同和自身電泳淌度的差異得到分離，對(duì)復(fù)雜樣品顯示出極大的分離能力。上海交通大學(xué)藥學(xué)院李新燕等[9]以加壓毛細(xì)管電色譜（pCEC）技術(shù)為平臺(tái)，優(yōu)化了整體柱基于親水作用分離分析奶制品中三聚氰胺的色譜條件。當(dāng)流動(dòng)相中乙腈與10 mmol/L磷酸鹽緩沖液的體積比為80∶20，pH值為3.0，電壓為3 kV，檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm時(shí)，三聚氰胺能獲得很好的分離。方法學(xué)考察結(jié)果表明，合成的親水整體柱具有良好的重現(xiàn)性和滲透性，建立的pCEC分析方法的檢出限為0.05 mg/L、10 mg/L和40 mg/L的加標(biāo)回收率分別為86%和105.5%。國(guó)家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心郭啟雷等[10]建立的p C E C方法在1.0～100 mg/kg質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2=0.999），在牛奶和酸奶中的定量限為2.5 mg/kg，在奶粉中的定量限為10 mg/kg，加標(biāo)回收率為78.9%～93.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%。上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所饒欽雄等[11]建立了牛奶和奶粉中三聚氰胺的高效毛細(xì)管電泳-二極管陣列檢測(cè)器（HPCEDAD）檢測(cè)方法。分析物在1～100mg/L范圍內(nèi)線性良好，牛奶和奶粉的定量限分別為0.5 mg/kg和1.0 mg/kg。在添加水平為定量限濃度至50 mg/kg時(shí)的回收率為72.2%～97.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%～3.9%。

2 基于免疫學(xué)原理的快速檢測(cè)方法

利用抗原抗體反應(yīng)特異性，可以在無(wú)需樣品提取的情況下快速的對(duì)樣品中的三聚氰胺進(jìn)行檢測(cè)?；诿庖邔W(xué)原理的快速檢測(cè)產(chǎn)品，在檢測(cè)便利性、靈敏度、檢測(cè)通量上具有極大的優(yōu)勢(shì)。

2.1 酶聯(lián)免疫吸附法

SN/T4538.1—2016、SN/T4538.2—2016、DB34/T1374—2011中均提到了酶聯(lián)免疫吸附法，液態(tài)奶樣品可直接或經(jīng)簡(jiǎn)單稀釋后用于檢測(cè)，具有較大的便利性。目前市售的商品化三聚氰胺ELISA試劑盒，大多基于直接競(jìng)爭(zhēng)法原理，即孔板中預(yù)先包被特異性的三聚氰胺抗體，在孵育時(shí)，樣品中的三聚氰胺與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的三聚氰胺競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合孔板中的抗體，結(jié)合到孔板中的辣根過(guò)氧化物酶與樣品中的三聚氰胺濃度呈負(fù)相關(guān)，樣品中三聚氰胺含量越高，則最后顯色越淺，根據(jù)樣品及標(biāo)品的OD值可計(jì)算出樣品中的三聚氰胺含量。

商品化試劑盒作為多種試驗(yàn)要素的集合，因其使用方便、檢測(cè)快速，已廣泛應(yīng)用于日常檢測(cè)與科研試驗(yàn)中，然而試劑盒卻存在著諸多問(wèn)題，試劑盒本身質(zhì)量問(wèn)題、試劑盒在操作過(guò)程中使用不當(dāng)、尚沒(méi)有完善的標(biāo)準(zhǔn)或質(zhì)量評(píng)價(jià)體系。沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院李霜等[12]對(duì)三聚氰胺ELISA試劑盒進(jìn)行評(píng)價(jià)研究，從基體的選擇（樣品）、線性試驗(yàn)、選擇性試驗(yàn)、回收率試驗(yàn)、檢測(cè)限與定量限試驗(yàn)、耐變性試驗(yàn)、批間差試驗(yàn)、試驗(yàn)環(huán)境等諸多方面進(jìn)行了探討。

2.2 膠體金試紙條法

膠體金免疫技術(shù)因其具有簡(jiǎn)單快速、價(jià)格低廉、可單份測(cè)定，對(duì)儀器設(shè)備無(wú)依賴、適合基層單位以及個(gè)人使用等特點(diǎn)而得到廣泛的應(yīng)用。采用膠體金技術(shù)制備的三聚氰胺試紙條產(chǎn)品也因此在奶戶及原奶驗(yàn)收環(huán)節(jié)中較為普及。目前市售的三聚氰胺膠體金試紙條產(chǎn)品，均基于競(jìng)爭(zhēng)法開(kāi)發(fā)，即三聚氰胺偶聯(lián)抗原包被于T線，用于測(cè)試樣品中三聚氰胺的含量。在樣品檢測(cè)時(shí)，樣品中的三聚氰胺與T線抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合被納米金顆粒標(biāo)記的三聚氰胺抗體。在樣品中有高于檢出限的三聚氰胺存在時(shí)，T線顏色減淡或消失。SN/T4538.3—2016、SN/T4538.4—2016、SN/T4479—2016中均提到了使用膠體金試紙條作為檢測(cè)樣品中三聚氰胺的工具。中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院何田田等[13]對(duì)三聚氰胺快速檢測(cè)試紙條從靈敏度、選擇性、適用性、耐變性、批件差異等方面進(jìn)行試驗(yàn)，并進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

2.3 熒光/量子點(diǎn)/上轉(zhuǎn)發(fā)光材料標(biāo)記的側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l

在膠體金技術(shù)的基礎(chǔ)上，使用熒光納米顆粒、量子點(diǎn)、上轉(zhuǎn)發(fā)光材料替代納米金顆粒作為標(biāo)記物，可在保留膠體金試紙條易用性的同時(shí)，增加試紙條產(chǎn)品的靈敏度和穩(wěn)定性，使得用試紙條對(duì)樣品中的三聚氰胺定量檢測(cè)成為可能。

當(dāng)前較常用于食品安全分析的熒光標(biāo)記物多為時(shí)間分辨熒光。稀土離子螯合物的熒光壽命較長(zhǎng)（100～1000μs），其發(fā)出的熒光稱為時(shí)間分辨熒光，如果延遲一定時(shí)間（如200μs）后再進(jìn)行測(cè)量，可有效消除本底熒光（1～10ns）的干擾。時(shí)間分辨熒光Stokes位移寬，螯合物的熒光發(fā)射峰狹窄，可通過(guò)波長(zhǎng)分辨的方式進(jìn)一步區(qū)別于背景熒光。以稀土離子螯合物作為抗原或抗體的標(biāo)記物，將時(shí)間分辨熒光與免疫分析技術(shù)相結(jié)合的方法與通常的熒光免疫分析法相比，可有效避免本底熒光的干擾，大大提高檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性[14]。

量子點(diǎn)是一種半導(dǎo)體納米材料，通常是由鋅、鎘、硒、硫等元素化合而成的，三維尺寸均處于納米范圍內(nèi)的零維半導(dǎo)體材料，它的半徑小于或接近于激子玻爾半徑。當(dāng)其受到光或電的刺激時(shí)，處于基態(tài)的載流子會(huì)被激發(fā)跳躍到更高的能級(jí)，等到這些載流子再回到原激發(fā)態(tài)時(shí)就會(huì)發(fā)出固定波長(zhǎng)的可見(jiàn)光，故也稱量子點(diǎn)為半導(dǎo)體熒光納米晶粒。量子點(diǎn)激發(fā)波長(zhǎng)寬，發(fā)射波長(zhǎng)窄、對(duì)稱，發(fā)光穩(wěn)定。合肥工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院趙弟萍建立了一種基于熒光量子點(diǎn)的側(cè)向?qū)游鲈嚰垯z測(cè)新方法，并將該方法用于食品中非法添加劑三聚氰胺的檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果表明，該熒光試紙條對(duì)三聚氰胺檢測(cè)的肉眼檢測(cè)限能達(dá)到10ppb，檢測(cè)時(shí)間為10min[15]。

上轉(zhuǎn)發(fā)光材料（UCP）是一種獨(dú)特納米級(jí)顆粒，由稀土金屬元素?fù)诫s于晶體的晶格中構(gòu)成，由主基質(zhì)、吸收子、發(fā)射子三種成分組成。上轉(zhuǎn)化發(fā)光的產(chǎn)生是涉及兩個(gè)及多個(gè)光子的光學(xué)過(guò)程，吸收子吸收兩個(gè)及以上低能量光子（紅外區(qū)），經(jīng)過(guò)一系列內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換，以非輻射形式將兩個(gè)光子的能量連續(xù)傳遞給發(fā)射子，使其處于激發(fā)態(tài)，然后接著發(fā)生一個(gè)返回基態(tài)能級(jí)的躍遷，釋放一個(gè)高能量光子（可見(jiàn)光），完成能量上轉(zhuǎn)換。上轉(zhuǎn)發(fā)光層析技術(shù)即將UCP納米顆粒與DNA、RNA、抗原或抗體等利用分子間相互作用共軛連接，進(jìn)而應(yīng)用于生物樣品檢測(cè)。具有較高的敏感性、靈活性、安全性、穩(wěn)定性[16]。

2.4 免疫傳感器

南京師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院邵科峰等構(gòu)建了基于石墨烯-殼聚糖復(fù)合物修飾電極的免疫傳感器。將石墨烯-殼聚糖復(fù)合物與三聚氰胺一起修飾在電極上，利用三聚氰胺抗體和三聚氰胺之間特定反應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)模式，以K3Fe（CN）6為探針，通過(guò)循環(huán)伏安法和差分脈沖伏安法監(jiān)測(cè)免疫反應(yīng)，對(duì)體系中的三聚氰胺進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)溶液中三聚氰胺的檢測(cè)是基于抗體和三聚氰胺之間特定反應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)模式實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)電極浸入含有三聚氰胺抗體和游離三聚氰胺的溶液中時(shí)，固定在電極上的三聚氰胺分子和溶液中游離的三聚氰胺與三聚氰胺抗體發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，形成三聚氰胺-抗體復(fù)合物，三聚氰胺抗體被吸附在電極上。三聚氰胺-抗體復(fù)合物在電極表面的形成導(dǎo)致電極產(chǎn)生位阻，減少了電極活動(dòng)區(qū)域，阻礙了K3Fe（CN）6探針離子到達(dá)電極，峰值電流下降。根據(jù)免疫傳感器在含有不同質(zhì)量濃度三聚氰胺溶液中的電化學(xué)信號(hào)的差異對(duì)溶液中游離的三聚氰胺進(jìn)行檢測(cè)。該免疫傳感器檢測(cè)線性范圍為0.005～1.5mg/kg，檢測(cè)限為0.0002mg/kg，在牛奶中加入0.02～1.2mg/kg的三聚氰胺可獲得104.0%～106.2%的檢測(cè)回收率[17]。

2.5 核酸適配體

與三聚氰胺特異識(shí)別的適配體可代替特異性三聚氰胺抗體作為檢測(cè)方案中的識(shí)別單元。

核酸適配體是通過(guò)鏈內(nèi)堿基間的氫鍵作用折疊形成穩(wěn)定的發(fā)卡、莖環(huán)、假結(jié)、口袋、凸環(huán)和G－四鏈體等二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)，并與靶標(biāo)產(chǎn)生空間結(jié)構(gòu)匹配的高親和力和特異性結(jié)合的核糖核酸（RNA）和單鏈脫氧核糖核酸（ssNDA）。核酸適配體一般由幾十個(gè)核苷酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量小、易穿透細(xì)胞膜、性質(zhì)穩(wěn)定、容易制備和修飾，其結(jié)合的靶標(biāo)范圍廣，包括離子、小分子、蛋白質(zhì)、細(xì)胞和微生物等[18]。

按照與三聚氰胺的識(shí)別機(jī)制不同，新型核酸適配體生物傳感器大致可以分為四大類分別為:基于胸腺嘧啶（T）－三聚氰胺－胸腺嘧啶（T）錯(cuò)配和多聚胸腺嘧啶（polyT）核酸適配體的生物傳感器；基于三聚氰胺代替無(wú)嘌呤位點(diǎn)（AP位點(diǎn)）處堿基，通過(guò)T－三聚氰胺-T錯(cuò)配形成三鏈DNA結(jié)構(gòu)的生物傳感器；基于指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX技術(shù)）篩選出的核酸適配體，設(shè)計(jì)的生物傳感器；基于核酸DNA、汞/銅等離子和三聚氰胺的配位作用的生物傳感器[19]。

上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院邢海波等[20]設(shè)計(jì)合成了能與三聚氰胺特異性結(jié)合的適配體，將納米金比色法與適配體的分子識(shí)別相結(jié)合，確立了一種簡(jiǎn)單、高效、快速檢測(cè)三聚氰胺的新方法，檢測(cè)下限為0.0043mg/L，在牛奶樣品的檢測(cè)中，三聚氰胺的加標(biāo)回收率為90%～120%。

3 其他檢測(cè)方法

3.1 拉曼光譜法

不同物質(zhì)具有與其分子結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)的特征拉曼光譜，原料乳、純牛奶和酸奶等樣品經(jīng)過(guò)稀釋、離心、用基于表面增強(qiáng)原理的拉曼光譜技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)樣品三聚氰胺含量與歸一后拉曼光譜相對(duì)強(qiáng)度的對(duì)應(yīng)關(guān)系，采用外標(biāo)法對(duì)樣品中三聚氰胺進(jìn)行測(cè)定。SNT2805—2011采用的拉曼光譜法，可對(duì)含量高于0.5mg/kg的液態(tài)奶樣品進(jìn)行定量檢測(cè)，回收率在80%～100%之間。

武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院曲干等[21]利用納米金的表面增強(qiáng)拉曼效應(yīng)，建立了一種快速、靈敏、無(wú)標(biāo)記、無(wú)分離的檢測(cè)三聚氰胺的定性及定量分析方法，線性檢測(cè)范圍為0.012～0.174mg/L，檢出限（LOD）為0.0023mg/L。

3.2 近紅外光譜技術(shù)

在計(jì)算機(jī)技術(shù)的飛速發(fā)展、光學(xué)技術(shù)和化學(xué)計(jì)量學(xué)方法的不斷進(jìn)步下，近紅外光譜分析技術(shù)在多個(gè)領(lǐng)域顯示了其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，其中無(wú)損、高效、快速、成本低、無(wú)污染的優(yōu)點(diǎn)，使其明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的分析檢測(cè)技術(shù)，而且樣品無(wú)需預(yù)處理，更加便于實(shí)現(xiàn)在線分析。上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院程文宇等通過(guò)近紅外光譜結(jié)合適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)計(jì)量學(xué)方法，可實(shí)現(xiàn)對(duì)液態(tài)奶樣中三聚氰胺的定性判斷[22]。

3.3 電化學(xué)方法

SN/T3627—2013采用極譜法對(duì)液態(tài)乳中三聚氰胺進(jìn)行檢測(cè)。其原理為首先利用膜分離技術(shù)，利用滲透膜對(duì)三聚氰胺分子的選擇性透過(guò)功能從液態(tài)乳制品中提取三聚氰胺。三聚氰胺分子中3個(gè)氨基基團(tuán)均具有電化學(xué)活性，當(dāng)電極所加載的電位向陽(yáng)極掃描時(shí)，在堿性溶液介質(zhì)中能產(chǎn)生特征的氧化還原電位，以特征的氧化還原電位來(lái)定性，以特征電位嘗試的的峰電流值定量。該法定量限為2mg/kg。

長(zhǎng)沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院羅永豐等[23]報(bào)道了一種基于金銀核殼納米粒子（Au@AgCSNPs）檢測(cè)乳制品中三聚氰胺的電化學(xué)方法。通過(guò)層層自組裝技術(shù)將二硫蘇糖醇（DTT）、金銀核殼納米粒子（Au@AgCSNPs）、L-半胱氨酸（L-Cys）鍵合在金表面，形成Au/DTT/Au@AgCSNPs/L-Cys修飾傳感膜，檢測(cè)限為0.0076mg/L，該修飾電極選擇性和重現(xiàn)性好，用于牛奶樣品中三聚氰胺的檢測(cè)，回收率為98.2%～106.0%。

大連理工大學(xué)化學(xué)學(xué)院劉鳳玉等[24]利用三聯(lián)吡啶釕電化學(xué)發(fā)光法在玻璃碳（G C）電極和金（Au）電極上檢測(cè)三聚氰胺，檢測(cè)限可達(dá)0.1nmol/L，檢測(cè)奶粉中添加的三聚氰胺樣品,回收率在93%～107%。

4 總結(jié)

色譜方法、免疫學(xué)方法、光譜法、電化學(xué)方法等方法均可用于三聚氰胺的定性或定量檢測(cè)。當(dāng)前，以色譜方法和免疫學(xué)方法較為常用。

高效液相色譜，是大多數(shù)食品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)配置的檢測(cè)儀器，HPLC法亦大量被用于日常三聚氰胺的檢測(cè)工作，現(xiàn)有的HPLC方法相對(duì)于LC-MS/MS或者GC-MS（GC-MS/MS）方法而言，靈敏度偏低，在無(wú)人為添加三聚氰胺的情況下，僅測(cè)試代謝產(chǎn)生的三聚氰胺時(shí)，其靈敏度已經(jīng)不能滿足檢測(cè)需求。在日常測(cè)試工作中也時(shí)常遇到三聚氰胺峰與雜峰分離不佳的情況，造成定量的困難。LC-MS/MS或者GC-MS（GC-MS/MS）的靈敏度較高，但儀器昂貴，檢測(cè)通量低，GC-MS（GC-MS/MS）的前處理因?yàn)樾枰柰榛苌?，從而更為耗時(shí)。因此，仍有必要開(kāi)發(fā)基于HPLC的更高靈敏度的檢測(cè)方案。

免疫學(xué)的檢測(cè)方法是基于抗原抗體反應(yīng)的，這種特異性的識(shí)別，受限于抗體本身的特異性，以及樣品中的干擾成分。當(dāng)抗體自身特異性不強(qiáng)，樣品中又存在比較多的干擾成分時(shí)，其檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際情況可能想去甚遠(yuǎn)。這也是免疫學(xué)檢測(cè)產(chǎn)品檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定，產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊的主要原因之一。因此，用于檢測(cè)的免疫學(xué)產(chǎn)品，需要經(jīng)過(guò)仔細(xì)的評(píng)價(jià)，確認(rèn)各個(gè)指標(biāo)均滿足檢測(cè)需求方可使用。

膠體金試紙條由于其使用簡(jiǎn)便，在基層廣泛使用。但經(jīng)常會(huì)遇到有假陰性、假陽(yáng)性的情況發(fā)生，或者會(huì)因?yàn)橹饔^判斷的差異導(dǎo)致不同的判斷結(jié)果。相對(duì)而言，基于酶聯(lián)免疫的試劑盒產(chǎn)品，定量結(jié)果通常比膠體金產(chǎn)品更為可靠，是日常檢測(cè)工作的必要補(bǔ)充。

就三聚氰胺而言，其免疫學(xué)檢測(cè)產(chǎn)品的靈敏度通?？梢赃_(dá)到甚至超過(guò)LC-MS/MS或者GC-MS（GC-MS/MS）方法，而僅僅需要非常簡(jiǎn)便的前處理，或者無(wú)需前處理，直接檢測(cè)。并且試紙條和試劑盒可高通量的對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。但受其原理的限制，并不能排除假陽(yáng)性的可能。因此，在應(yīng)用免疫學(xué)檢測(cè)產(chǎn)品檢出陽(yáng)性樣品時(shí)，仍需要通過(guò)C-MS/MS或者GC-MS（GC-MS/MS）方法予以確認(rèn)。

SNT2805—2011中描述的拉曼光譜法，前處理過(guò)程較為簡(jiǎn)單，離心獲得上清液，搭配專用的檢測(cè)試劑與提上清混合后，使用拉曼光譜儀進(jìn)行檢測(cè)。相對(duì)色譜法而言，該法具有前處理簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)。便捷程度及檢測(cè)通量、檢測(cè)靈敏度不及免疫學(xué)產(chǎn)品。且拉曼光譜儀通常價(jià)格不菲，該方法應(yīng)用場(chǎng)景十分有限。

SN/T3627—2013中描述的極譜法，前處理較為繁瑣，檢測(cè)靈敏度欠佳，實(shí)際工作中極為少見(jiàn)。相比之下，文中提及的其他電化學(xué)方法，更為靈敏。但未見(jiàn)成熟的商品化產(chǎn)品面世。

基于免疫傳感器、核酸適配體、紅外光譜法等原理的三聚氰胺檢測(cè)技術(shù)，大多還停留在實(shí)驗(yàn)室階段，離商業(yè)化的產(chǎn)品尚有距離。