伯氏瘧原蟲PbPH表達(dá)特點和單克隆抗體傳播阻斷效應(yīng)研究

張耀文 ， 劉鵬波， 寇 旭 ， 鄭文琪 ， 劉 飛， 王美蓮*

(1.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110021；2.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110021)

雌性按蚊傳播的瘧疾是一種蟲媒傳染病，其病原體為瘧原蟲。盡管人類在控制瘧疾方面取得了一定的進(jìn)展，但是2019 年WHO世界衛(wèi)生組織報告的數(shù)據(jù)顯示，2018 年全球仍有約2.28 億瘧疾病例，其中死亡約40.54 萬人[1]。因此，世界衛(wèi)生組織提出區(qū)域瘧疾消除計劃，以2030 年實現(xiàn)“最少35個國家完全消除瘧疾”為目標(biāo)。然而，這一目標(biāo)的實現(xiàn)卻面臨著若干技術(shù)的挑戰(zhàn)，包括間日瘧原蟲和惡性瘧原蟲共同流行的許多地區(qū)間日瘧原蟲的發(fā)病率或比例的增加。目前，治療瘧疾依然主要依靠以青蒿素為基礎(chǔ)的復(fù)方藥物或藥浸蚊帳。然而，瘧原蟲和按蚊分別對抗瘧藥物和殺蟲劑耐藥性的日益增加，嚴(yán)重阻礙了對瘧原蟲傳播的有效控制，因此，開發(fā)高效的傳播阻斷疫苗迫在眉睫[2-3]。傳播阻斷疫苗(transmission blocking vaccine,TBV)是通過阻斷蚊中瘧原蟲的發(fā)育阻止瘧疾的傳播?；驹硎峭ㄟ^有性階段或蚊階段寄生蟲的表面抗原免疫人類，從而在人體內(nèi)誘導(dǎo)相應(yīng)抗原的抗體，阻止瘧原蟲在蚊中腸內(nèi)的進(jìn)一步發(fā)育，從而阻斷瘧疾的傳播[4]。然而到目前為止，針對瘧原蟲有性階段傳播阻斷疫苗候選抗原的篩選卻不太理想，目前主要包括候選抗原Pfs25、Pfs48/45 和 Pfs230。針對Pfs25產(chǎn)生的抗體主要抑制合子在蚊子腸道內(nèi)的發(fā)育[5-6]；Pfs48/45是配子體細(xì)胞膜蛋白，其在配子出現(xiàn)后從紅細(xì)胞中釋放出來，其抗體可阻斷瘧原蟲卵囊的形成，從而阻斷惡性瘧原蟲的傳播[7]；Pfs230在惡性瘧原蟲有性期表面形成復(fù)合物參與雄配子和雌配子的受精過程，以補體依賴的方式阻斷惡性瘧原蟲的傳播[8-9]，其產(chǎn)生的抗體也可以阻止惡性瘧原蟲卵囊發(fā)育[10]。根據(jù)中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室之前發(fā)表的數(shù)據(jù)，篩選出受精前后均有表達(dá)的PbPH作為研究對象[11]。因此，本研究制備了抗PbPH單克隆抗體，通過WB和IFA檢測PbPH的表達(dá)階段和抗PbPH單克隆抗體的特異性，并通過體外配子體出絲和動合子形成實驗檢測抗PbPH單克隆抗體的傳播阻斷效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 伯氏瘧原蟲(Plasmodiumberghei)ANKA 株，為中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室保存；6～8周齡的雌性BALB/c小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基 裂殖體培養(yǎng)基：RPMI1640，50 mg/L青霉素，50 mg/L鏈霉素，20%(體積分?jǐn)?shù))熱滅活胎牛血清，50 mL/0.5 mL血液；動合子培養(yǎng)液：RPMI1640，50 mg/L青霉素，50 mg/L鏈霉素，100 mg/L新霉素，20%(體積分?jǐn)?shù))熱滅活FCS，1 mg/L肝素鈉，pH 8.0；HAT培養(yǎng)基；HT培養(yǎng)基。

1.1.3 試劑 苯肼、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG、Alexa-488標(biāo)記的羊抗鼠IgG、Hoechst33258 (美國Invitrogen 公司)；Alexa-555標(biāo)記的羊抗兔IgG(英國Abcam)；抗Pbs21 單克隆抗體由日本自治大學(xué)Hiroyuki Matsuoka 教授贈予；RPMI 1640、胎牛血清(美國Thermo 公司)；肝素鈉及其余化學(xué)試劑(鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)。

1.1.4 儀器與設(shè)備 移液器(QZ07508，Thermo公司)；垂直電泳槽(EPM-7552，上海天能科技有限公司)；電轉(zhuǎn)槽(Bio-Pad，美國)；分析天平(L-1660DTP，日本Shimadzu)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(HH-B11-420，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；OLYMPUS顯微鏡及成像系統(tǒng)(BX53，日本OLYMPUS公司)；渦旋振蕩器(VORTEX-5，海門其林貝儀器制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 抗PbPH單克隆抗體的制備 利用已純化的rPbPH重組蛋白對BALB/c雌性小鼠進(jìn)行免疫，免疫過程和方法與文獻(xiàn)[11]基本相同，于末次免疫后3～4 d，分離出小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合培養(yǎng)。經(jīng)過聚乙二醇處理后，將融合培養(yǎng)的細(xì)胞適當(dāng)稀釋，分置于96 孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后加入4×HAT選擇培養(yǎng)基，每隔2～3 d更換一次培養(yǎng)基(1×HAT)，定期觀察其生長狀況。2周左右更換為HT培養(yǎng)基，待雜交瘤細(xì)胞長至孔底面積1/3時，取其培養(yǎng)上清用間接ELISA法檢測抗體含量，經(jīng)2 次檢測陽性的細(xì)胞，按照有限稀釋法進(jìn)行克隆，至陽性率達(dá)到100%，且抗體滴度基本一致時，篩選出克隆株[12-13]。

1.2.2 抗PbPH單克隆抗體的收集 將篩選出的雜交瘤細(xì)胞用含5%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行大量培養(yǎng)，待細(xì)胞生長旺盛時，離心收集上清液，提純備用。預(yù)先給小鼠腹腔注射液體石蠟，1周后將雜交瘤細(xì)胞接種到小鼠腹腔中，10 d后采集腹水離心后，取上清液進(jìn)行純化。

1.2.3P.berghei裂殖體/配子體/動合子的收集及其瘧原蟲抗原的提取 收集裂殖體，雌性BALB/c 小鼠經(jīng)尾靜脈注射1×106個P.berghei感染的紅細(xì)胞，待感染率達(dá)到3%時，乙醚麻醉小鼠，收集肝素化血液置于裂殖體培養(yǎng)基中，然后于37 ℃的10% O2、5% CO2和85% N2溫箱中孵化20 h[11]。培養(yǎng)物經(jīng)58%(體積分?jǐn)?shù))的Nycodenz密度梯度進(jìn)行分級分離，收集中間灰白層的裂殖體，經(jīng)PBS清洗2次，取1 μL進(jìn)行Giemsa染色，光學(xué)顯微鏡下檢測裂殖體含量與純度。收集配子體，苯肼處理過的雌性BALB/c小鼠尾靜脈注射1×107個P.berghei感染的紅細(xì)胞，于感染第4天，給小鼠飲用磺胺嘧啶(20 mg/L飲水)2 d。乙醚麻醉小鼠，心臟采血并將血液保存在冰上以避免過早活化配子體，經(jīng)48%(體積分?jǐn)?shù))的Nycodenz分離，收集中間灰白層配子體，PBS洗滌2次，取1 μL進(jìn)行Giemsa染色，光學(xué)顯微鏡下檢測配子體含量與純度[11]。收集動合子，用1×107個P.berghei感染的紅細(xì)胞感染苯肼處理過的雌性BALB/c小鼠，于感染第3天，乙醚麻醉小鼠，心臟采血，1 mL血液置于9 mL動合子培養(yǎng)液中。19 ℃培養(yǎng)24 h，然后用62%(體積分?jǐn)?shù))Nycodenz密度梯度離心，收集中間灰白層動合子，PBS清洗2次，取1 μL進(jìn)行Giemsa染色，光學(xué)顯微鏡下檢測動合子含量與純度。收集純化的伯氏瘧原蟲，用0.2%的皂角苷裂解去除紅細(xì)胞。伯氏瘧原蟲抗原經(jīng)裂解液(1% TritonX-100、2% SDS、PBS溶解，含有蛋白酶抑制劑)裂解30 min。10 000 r/min離心10 min，取上清BCA定量，-80 ℃保存。

1.2.4 Western Blot檢測抗PbPH單克隆抗體的特異性 將等量的伯氏瘧原蟲抗原(30 μg/泳道)于10% SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行分離，電泳結(jié)束后，4 ℃ 45 V恒壓轉(zhuǎn)膜3 h后，先用5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))TBST溶解的脫脂奶粉4 ℃封閉2 h，然后TBST清洗3次。清洗后的膜分別與TBST稀釋的抗PbPH單克隆抗體(1∶500)和抗rHSP70鼠血清(1∶500)于4 ℃結(jié)合過夜。再次用TBST將膜清洗3次，每次5 min，再用TBST(1∶5 000)稀釋的辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體在37 ℃孵育2 h，用TBST將膜清洗3次。最后進(jìn)行ECL發(fā)光，在熒光圖像分析系統(tǒng)中對其進(jìn)行檢測。

1.2.5 間接免疫熒光實驗檢測PbPH的表達(dá)階段 為確定抗PbPH單克隆抗體是否能檢測到PbPH天然構(gòu)象蛋白，將苯肼處理過的雌性BALB/c小鼠經(jīng)尾靜脈注射1×107個P.berghei感染的紅細(xì)胞，感染后第3天，取10 μL感染小鼠尾血制備雌雄配子體、雄配子出絲(25 ℃孵育15 min)、雌配子/合子(25 ℃孵育2 h)、動合子(19 ℃孵育24 h)樣品，用4%多聚甲醛和0.007 5%戊二醛室溫條件下固定30 min，經(jīng)PBS洗1次后，透膜組用0.1% Triton X-100透膜10 min，透膜組和不透膜組均加入5%脫脂奶粉/PBS封閉1 h。經(jīng)PBS洗1次后，透膜組加入1∶500倍稀釋的抗rPbPH單克隆抗體和Marker(雌配子體：兔源抗-Pbg377多抗；雄配子體：兔源抗-α-tubilin多抗；合子及動合子：兔源抗-Pbs21多抗)孵育1 h。不透膜組加入1∶500倍稀釋的抗rPbPH單克隆抗體孵育1 h后，PBS洗滌3 次，0.1%Triton X-100透膜10 min，5%脫脂奶粉/PBS 封閉1 h后，再加入1∶500倍稀釋的Marker混合液孵育1 h。PBS漂洗后，加入1∶500倍稀釋的Alexa-488標(biāo)記的羊抗鼠IgG和Alexa-555標(biāo)記的羊抗兔IgG孵育1 h。PBS漂洗后，加入1∶1 000倍稀釋的Hoechst33258進(jìn)行細(xì)胞核染色15 min后，熒光顯微鏡觀察結(jié)果[14]。

1.2.6 體外配子體出絲數(shù)的檢測 為確定抗PbPH單克隆抗體是否影響配子體出絲，將苯肼處理過的雌性BALB/c 小鼠經(jīng)尾靜脈注射1×106個P.berghei感染的紅細(xì)胞，感染后第3天，取10 μL感染小鼠的尾血與40 μL動合子培養(yǎng)基稀釋的抗PbPH單克隆抗體/PBS(1∶5、1∶10、1∶50)混合，25 ℃培養(yǎng)15 min，光學(xué)顯微鏡計數(shù)配子體出絲數(shù)。

1.2.7 體外動合子形成的檢測 為確定抗PbPH單克隆抗體是否影響動合子形成，將苯肼處理過的雌性BALB/c 小鼠經(jīng)尾靜脈注射1×106個P.berghei感染的紅細(xì)胞，感染后第3天，取10 μL感染小鼠的尾血與90 μL動合子培養(yǎng)基稀釋的抗PbPH單克隆抗體/PBS(以1∶5、1∶10、1∶50)混合，19 ℃培養(yǎng)24 h，固定培養(yǎng)物，以抗-Pbs21單克隆抗體(1∶500)標(biāo)記，染色方法同文獻(xiàn)[11],熒光顯微鏡下計數(shù)動合子形成數(shù)。

1.2.8 統(tǒng)計方法 采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行t檢驗的統(tǒng)計學(xué)分析，P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗PbPH單克隆抗體的獲取

利用細(xì)胞融合技術(shù)、有限稀釋法、間接ELISA等實驗方法，從30株單克隆雜交瘤細(xì)胞株中篩選出1株能夠穩(wěn)定分泌抗PbPH單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，并在擴(kuò)大培養(yǎng)后，通過相應(yīng)的實驗技術(shù)獲取了抗PbPH單克隆抗體。

2.2 Western blot檢測抗PbPH單克隆抗體的特異性

為了確定抗PbPH單克隆抗體是否識別伯氏瘧原蟲蛋白，對純化后的裂殖體、配子體和動合子的裂解物進(jìn)行Western blot(WB)分析。抗PbPH單克隆抗體主要識別配子體和動合子，條帶大小約33 kDa，與預(yù)測的蛋白大小一致，在裂殖體抗原中未檢測到相應(yīng)條帶(圖1)。這與本教研室之前的研究結(jié)果相符合[11]，證實了抗PbPH單克隆抗體可以識別瘧原蟲配子體和動合子。

圖1 WB檢測抗PbPH單克隆抗體的特異性Fig.1 The specifically of anti-PbPH mAb by WBRBC:紅細(xì)胞裂解液(陰性對照)；Sch:裂殖體；Gam:配子體；Ook:動合子。用抗PbPH單克隆抗體(1∶500)孵育純化后的裂殖體、配子體和動合子的裂解物(30 μg/泳道)，HSP70為陽性對照，33 kDa為pbDH抗原的分子量RBC: red blood cell lysate (negative control); Sch: schizonts; Gam: gametocytes; Ook: ookinetes. The purified lysates of schizonts, gametocytes and ookinetes (30 μg/lane) were incubated with anti-PbPH monoclonal antibody (1∶500)， HSP70 was used as a positive control，PbPH antigen had a molecular weight of approximately 33 kDa

2.3 IFA檢測PbPH的表達(dá)階段

利用IFA對WB的結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步驗證?？筆bPH單克隆抗體可以識別雌雄配子體及雄配子、雌配子/合子、retort、動合子的表面抗原。透膜時，在配子體及其以后的階段均檢測到熒光信號；不透膜時，只在配子及其以后的階段能檢測到熒光信號；PBS對照組在這些階段均未檢測到熒光信號(圖2)。與之前的研究相一致，表明PbPH可分泌到瘧原蟲有性階段的膜表面，同時抗PbPH單克隆抗體可以有效識別分泌到瘧原蟲膜表面的蛋白。

圖2 IFA檢測PbPH的表達(dá)階段Fig.2 Location of PbPH in the parasites by IFABF:明視野；PbPH:抗PbPH單克隆抗體與Alexa-488標(biāo)記的羊抗鼠IgG結(jié)合(綠色)；Marker：雌配子體：兔源抗-Pbg377多抗，雄配子體：兔源抗-α-tubulin多抗，合子、retort及動合子：兔源抗-Pbs21多抗(紅色)；DAPI：Hoechst33258，瘧原蟲核染料(藍(lán)色)；Merge：第二、三、四列合成圖。PBS為陰性對照BF: bright field; PbPH: anti-PbPH monoclonal antibody binds to Alexa-488-labeled anti-mouse IgG antibody(green); Marker: female gametocytes: rabbit anti-Pbg377 polyantibody,male gametocytes:rabbit anti-α-tubulin polyantibody, zygote、retort and ookinetes: rabbit anti-Pbs21 polyantibody (red); DAPI: Hoechst33258, Plasmodium nuclear dye (blue); Merge: PbPH+Marker+Hoechst33258. PBS was negative control

2.4 抗PbPH單克隆抗體對配子體出絲的影響

與PBS對照組相比，在加入不同釋放倍數(shù)(1∶5、1∶10、1∶50)的抗PbPH單克隆抗體共同培養(yǎng)15 min后，配子體出絲數(shù)分別減少了41.7%、32.7%和8.3%。在抗PbPH單克隆抗體濃度為1∶5和1∶10時，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.14，P=0.038；t=3.05，P=0.003 9)，表明1∶5和1∶10稀釋情況下的抗PbPH單克隆抗體可以有效抑制配子體出絲(圖3)。

圖3 體外培養(yǎng)檢測抗PbPH單克隆抗體對配子體出絲的影響Fig.3 Effect of anti-PbPH mAb on exflagellation of male gametocytes*P<0.05;**P<0.01，下圖同*P<0.05;**P<0.01，the same below

2.5 抗PbPH單克隆抗體對動合子形成的影響

與PBS對照組相比，在加入不同稀釋倍數(shù)(1∶5、1∶10、1∶50)的抗PbPH單克隆抗體共同培養(yǎng)24 h后，動合子形成數(shù)分別減少了45.1%、14.8%和7.8%。在抗PbPH單克隆抗體稀釋倍數(shù)為1∶5和1∶10時，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.73，P=0.013；t=7.62，P<0.000 1)，表明1∶5和1∶10稀釋情況下的抗PbPH單克隆抗體可以有效抑制動合子的形成(圖4)。

圖4 體外培養(yǎng)檢測抗PbPH單克隆抗體對動合子形成的影響Fig.4 Effect of anti-PbPH mAb on ookinete conversion in vitro

3 討 論

高效的TBV候選疫苗可能需要結(jié)合受精前后表達(dá)的抗原，以達(dá)到完全阻斷傳播的目的[15-16]。PbPH為受精前和受精后抗原，針對這種蛋白的抗體可能會在多個時期阻斷瘧原蟲的傳播。首先，本研究制備了抗PbPH單克隆抗體；然后通過WB和IFA驗證了抗PbPH單克隆抗體的特異性，即抗PbPH單克隆抗體能有效地識別雌雄配子體、雄配子、雌配子/合子、retort和動合子。最后利用抗PbPH單克隆抗體進(jìn)行了體外實驗，結(jié)果表明，其單克隆抗體(1∶5、1∶10)對配子體出絲中心以及動合子的形成有明顯地抑制作用，表明抗PbPH單克隆抗體具有一定的傳播阻斷能力。

針對候選抗原，利用不同的實驗方法可以制備相應(yīng)的多克隆抗體與單克隆抗體。多克隆抗體可以識別一個抗原上的多個抗原表位，利于放大抗原抗體反應(yīng)，且其制備方法相較單克隆抗體簡單。但是單克隆抗體只識別一個抗原上一個抗原表位的特性，使其具有極高的特異性，能在混合物中高效的結(jié)合靶標(biāo)抗原，降低交叉反應(yīng)的出現(xiàn)，產(chǎn)生的背景信號也明顯低于多克隆抗體，并且制備的雜交瘤細(xì)胞可作為單克隆抗體持續(xù)的再生源。近年來，單克隆抗體在抗感染疾病作用上也取得了較大的進(jìn)步[17]。并且在標(biāo)準(zhǔn)膜飼實驗中單克隆抗體對瘧原蟲傳播的有效阻斷也清楚地證明了單克隆抗體在傳播阻斷免疫中的重要性[18-19]。因此，本研究利用教研室已經(jīng)完成表達(dá)純化的rPbPH蛋白[11]，制備了針對該蛋白的特異性單克隆抗體。

在教研室之前的研究基礎(chǔ)上，本研究的實驗結(jié)果進(jìn)一步證明了PbPH有成為TBV候選疫苗的潛能。