超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定土壤中30種抗生素

胡 鈺, 朱青青, 胡立剛,3, 廖春陽(yáng),3*

(1. 中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心, 環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100085; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院, 北京 100049; 3. 國(guó)科大杭州高等研究院環(huán)境學(xué)院, 浙江 杭州 310000)

抗生素不僅可以作為藥物治療和預(yù)防感染病,還可以作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑廣泛應(yīng)用于禽畜養(yǎng)殖業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)[1]。然而當(dāng)前抗生素過(guò)量使用嚴(yán)重,據(jù)統(tǒng)計(jì),每年全球范圍內(nèi)抗生素的使用量在100 000至200 000噸之間[2]。研究表明,人類和動(dòng)物攝入的抗生素會(huì)以母體或活性代謝產(chǎn)物的形式隨糞便和尿液排出體外,并在醫(yī)院、污水處理廠和禽畜養(yǎng)殖場(chǎng)的廢水和污泥中富集,最終被排放到水和土壤等環(huán)境介質(zhì)中[1]。源源不斷進(jìn)入環(huán)境中的抗生素可促進(jìn)耐藥性細(xì)菌的增殖,對(duì)人類健康造成潛在風(fēng)險(xiǎn)[3]。因此,歐盟、美國(guó)、澳大利亞和中國(guó)均已采取措施限制抗生素的使用,并限定動(dòng)物肌肉中抗生素的最大殘留限量,如歐盟規(guī)定動(dòng)物肌肉中林可霉素的最大殘留限量為100 μg/kg[4]?！吨腥A人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第194號(hào)》規(guī)定自2020年起,停止生產(chǎn)、進(jìn)口、經(jīng)營(yíng)、使用包括抗生素在內(nèi)的促生長(zhǎng)類藥物飼料添加劑[5]。

建立土壤中多種類多殘留抗生素的分析方法可為土壤中抗生素的監(jiān)測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供方法學(xué)基礎(chǔ)。土壤基質(zhì)復(fù)雜,土壤中抗生素殘留種類繁多,且多在痕量水平,高靈敏度的儀器方法、有效的凈化和富集方法、多種類抗生素的同時(shí)檢測(cè)是土壤中抗生素檢測(cè)的重點(diǎn)和難點(diǎn)。抗生素的儀器分析方法包括毛細(xì)管電泳法、酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜(HPLC)-紫外/熒光法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(MS/MS)等[6-11],其中HPLC-MS/MS因其特異性強(qiáng)和靈敏度高等特點(diǎn),更適合用于土壤中多種類抗生素的痕量分析。土壤中抗生素的凈化富集方法包括串聯(lián)固相萃取、固相萃取(SPE)和QuEChERS(quick, easy, cheap, effective, rugged and safe)等[10-12]。李曉晶等[10]采用SAX-HLB串聯(lián)固相萃取-超高效液相色譜-MS/MS測(cè)定土壤中大環(huán)內(nèi)酯類、氟喹諾酮類和林可酰胺類抗生素,9種目標(biāo)化合物的定量限為0.80～9.67 μg/kg,加標(biāo)回收率為65.2%～106%。李興華等[11]利用SPE-高效毛細(xì)管電泳法測(cè)定土壤中3類(磺胺類、酰胺醇類和β-內(nèi)酰胺類)13種抗生素,定量限為1.33～3.33 μg/kg,加標(biāo)回收率為78.5%～107%。孟明輝等[12]采用QuEChERS-HPLC-MS/MS測(cè)定土壤中磺胺類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,20種目標(biāo)化合物的定量限為2.0～5.0 μg/kg,加標(biāo)回收率為61.4%～119%。上述方法定量限低,加標(biāo)回收率在可接受范圍內(nèi),但只能同時(shí)檢測(cè)少數(shù)幾類抗生素。

本研究建立了SPE-UHPLC-MS/MS檢測(cè)方法,用于土壤中痕量水平的7類(磺胺類、氟喹諾酮類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、β-內(nèi)酰胺類、酰胺醇類和林可酰胺類)30種抗生素的同時(shí)測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器、試劑與材料

Exion LC AD超高效液相色譜-串聯(lián)Triple QUADTM5500三重四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)AB Sciex公司); Vortex-Genie 2渦旋振蕩器(美國(guó)Scientific Industries公司); HS 501 digital搖床(德國(guó)IKA公司); 5810 R冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司);氮吹儀(美國(guó)Organomation公司); Oasis HLB固相萃取小柱(3 mL,美國(guó)Waters公司);固相萃取儀(美國(guó)Supelco公司);超純水儀(美國(guó)Millipore公司)。

甲醇和乙腈(色譜純,美國(guó)Thermo Fisher公司);甲酸(分析純,美國(guó)Sigma-Aldrich公司);乙二胺四乙酸二鈉(分析純,上海麥克林生化科技有限公司)、檸檬酸酐(分析純,阿法埃莎(中國(guó))化學(xué)有限公司)、十二水合磷酸氫二鈉(分析純,上海滬試化工有限公司)。

將34.7 g十二水合磷酸氫二鈉、18.6 g乙二胺四乙酸二鈉和6.5 g檸檬酸酐溶解于500 mL超純水中,配制得到pH為4.0的Na2EDTA-McIlvaine緩沖液。

抗生素標(biāo)準(zhǔn)品:(1)磺胺類(SAs):磺胺嘧啶(SDZ)、磺胺二甲嘧啶(SMZ)、磺胺甲噁唑(SMX)、磺胺甲噻二唑(SMTZ)、磺胺氯噠嗪(SCP)、磺胺對(duì)甲氧嘧啶(SFM)、磺胺間甲氧嘧啶(SMM)、磺胺喹噁啉(SQX)、甲氧芐啶(TMP); (2)氟喹諾酮類(FQs):諾氟沙星(NOR)、環(huán)丙沙星(CIP)、氧氟沙星(OFL)、洛美沙星(LOM)、恩諾沙星(ENR)、氟羅沙星(FLE)、培氟沙星(PEF)、雙氟沙星(DIF); (3)四環(huán)素類(TCs):土霉素(OTC)、四環(huán)素(TC)、金霉素(CTC)、多西環(huán)素(DC); (4)大環(huán)內(nèi)酯類(MLs):克拉霉素(CTM)、羅紅霉素(RTM)、脫水紅霉素(ETM-H2O)、泰樂(lè)菌素(TYL); (5)β-內(nèi)酰胺類(BLs):阿莫西林(AMX)、青霉素(PCN-G); (6)酰胺醇類(APHs):氟苯尼考(FF)、氯霉素(CAP); (7)林可酰胺類(LAs):林可霉素(LCM)。磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺甲噻二唑、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、甲氧芐啶、諾氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星、克拉霉素、羅紅霉素、青霉素、氟苯尼考和氯霉素購(gòu)自德國(guó)DRE公司;磺胺氯噠嗪、洛美沙星、氟羅沙星、培氟沙星、雙氟沙星、土霉素、四環(huán)素、金霉素、多西環(huán)素、脫水紅霉素、泰樂(lè)菌素、阿莫西林和林可霉素購(gòu)自加拿大TRC公司;環(huán)丙沙星購(gòu)自中國(guó)曼哈格公司;甲氧芐啶-d3購(gòu)自加拿大CDN公司,環(huán)丙沙星-d8購(gòu)自德國(guó)Witega公司,四環(huán)素-d6、羅紅霉素-d7和氯霉素-d5購(gòu)自加拿大TRC公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

以甲醇為溶劑,將30種抗生素標(biāo)準(zhǔn)品配制成1 000 mg/L或100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于-20 ℃條件下儲(chǔ)存。其中磺胺嘧啶、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、氟羅沙星和培氟沙星需溶解于含0.5%(v/v)的1 mol/L的NaOH溶液的甲醇溶液中,NaOH可與微溶于甲醇的弱酸性物質(zhì)發(fā)生中和反應(yīng),促進(jìn)其溶解。

用甲醇將以上標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋配制成4 mg/L的30種抗生素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆?。使用?以10%甲醇水溶液為溶劑,將4 mg/L的30種抗生素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋成200、100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02和0.01 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 樣品前處理

1.3.1樣品采集

采集表層土壤樣品,挑除石子等異物,并進(jìn)行風(fēng)干處理,風(fēng)干后充分研磨和過(guò)篩(20目),于-20 ℃條件下保存。

1.3.2提取和凈化

準(zhǔn)確稱取2.50 g土壤樣品,置于15 mL聚丙烯離心管中,加入25 ng抗生素內(nèi)標(biāo)混合物(甲氧芐啶-d3、環(huán)丙沙星-d8、四環(huán)素-d6、羅紅霉素-d7和氯霉素-d5),渦旋混勻。萃取劑為10 mL乙腈和Na2EDTA-McIlvaine緩沖液的混合溶液(1∶1, v/v),振蕩30 min,超聲15 min,提取3次,4 ℃下離心10 min,轉(zhuǎn)速為4 000 r/min,移取合并上清液,氮吹濃縮至9 mL,加水稀釋至15 mL,調(diào)節(jié)溶液pH為8.0。

先用6 mL甲醇和6 mL超純水活化HLB小柱,然后將樣品溶液滴加入小柱中。上樣后,用10 mL超純水淋洗,棄去淋洗液,負(fù)壓抽干20 min,再用10 mL甲醇-乙腈(1∶1, v/v)溶液洗脫。洗脫液氮吹濃縮至干,再用10%(v/v)甲醇水溶液復(fù)溶至1 mL,待UHPLC-MS/MS分析。

1.4 分析條件

色譜柱:ACQUITY BEH-C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm;美國(guó)Waters公司),配有預(yù)柱ACQUITY BEH-C18色譜柱(5 mm×2.1 mm, 1.7 μm;美國(guó)Waters公司);柱溫:40 ℃;流動(dòng)相:A相為0.1%(v/v)甲酸水溶液,B相為0.1%(v/v)甲酸甲醇溶液;流速:0.4 mL/min。正離子模式下流動(dòng)相洗脫梯度:0～2.5 min, 10%B～15%B; 2.5～5.5 min, 15%B～60%B; 5.5～6.0 min, 60%B～95%B; 6.0～8.0 min, 95%B; 8.0～8.1 min, 95%B～10%B; 8.1～9.0 min, 10%B。負(fù)離子模式下流動(dòng)相洗脫梯度:0～1.0 min, 10%B～15%B; 1.0～3.0 min, 15%B～60%B; 3.0～4.0 min, 60%B; 4.0～4.5 min, 60%B～95%B; 4.5～6.0 min, 95%B; 6.0～6.1 min, 95%B～10%B; 6.1～7.0 min, 10%B。

離子源:電噴霧電離源(ESI);多反應(yīng)離子檢測(cè)模式(MRM)。正離子模式下,離子源溫度500 ℃,離子噴霧電壓5 500 V,氣簾氣壓力35.0 kPa,碰撞氣壓力7 kPa,噴霧氣壓力40.0 kPa,輔助加熱氣壓力60.0 kPa。負(fù)離子模式下,離子源溫度550 ℃,離子噴霧電壓-4 500 V,氣簾氣壓力40.0 kPa,碰撞氣壓力9 kPa,噴霧氣壓力50.0 kPa,輔助加熱氣壓力50.0 kPa。30種抗生素的其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 分析條件的優(yōu)化

2.1.1質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)7類抗生素的分子結(jié)構(gòu)特征,并參考相關(guān)文獻(xiàn)[13,14],酰胺醇類的氟苯尼考和氯霉素在ESI-模式下進(jìn)行質(zhì)譜分析,其他28種抗生素均在ESI+模式下進(jìn)行質(zhì)譜分析。采用針泵注射器,將30種100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別注入離子源,流速為7 μL/min。

對(duì)單個(gè)抗生素進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化,首先進(jìn)行全掃描和子離子掃描,參考化合物信息,選取合適的母離子和子離子作為目標(biāo)化合物的定量、定性離子對(duì),然后在MRM模式下,對(duì)目標(biāo)化合物的定量、定性離子對(duì)進(jìn)行CE、DP等質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化。最終30種抗生素的質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)見(jiàn)表1。

表 1 30種抗生素的質(zhì)譜分析參數(shù)

2.1.2色譜條件的優(yōu)化

由于7類抗生素的分子結(jié)構(gòu)差異較大,本實(shí)驗(yàn)選擇了具有廣譜性和化學(xué)穩(wěn)定性的BEH-C18色譜柱。比較了分別以甲醇-水、甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液、甲醇-0.2%(v/v)甲酸水溶液、甲醇-含2 mmol/L醋酸銨的0.2%(v/v)甲酸水溶液、0.1%(v/v)甲酸甲醇溶液-0.1%(v/v)甲酸水溶液和0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液-0.1%(v/v)甲酸水溶液作為流動(dòng)相時(shí)的色譜分離效果。結(jié)果表明,以甲醇-水為流動(dòng)相時(shí),大環(huán)內(nèi)酯類抗生素未出峰,在其他的流動(dòng)相條件下,各類抗生素均有出峰。此外,四環(huán)素類抗生素的響應(yīng)在含醋酸銨的流動(dòng)相條件下有所降低,青霉素的響應(yīng)在0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液作為有機(jī)相的條件下較0.1%(v/v)甲酸甲醇溶液低了2個(gè)數(shù)量級(jí)。綜合考慮,選取0.1%(v/v)甲酸甲醇溶液-0.1%(v/v)甲酸水溶液作為流動(dòng)相。

此外,純甲醇作為進(jìn)樣溶劑時(shí),溶劑效應(yīng)顯著,阿莫西林未出峰。當(dāng)有機(jī)溶劑的比例降低時(shí),各類抗生素的峰形及響應(yīng)均有所改善,各類抗生素的響應(yīng)在以10%(v/v)甲醇水溶液作為進(jìn)樣溶劑時(shí)較50%(v/v)甲醇水溶液高2～10倍。因此選取10%甲醇水溶液作為進(jìn)樣溶劑。30種抗生素(100 μg/L)的總離子流色譜圖見(jiàn)圖1。

圖 1 30種抗生素(100 μg/L)的提取離子流色譜圖Fig. 1 Extracted ion chromatograms of the 30 antibiotics (100 μg/L)SAs: sulfonamides; FQs: fluoroquinolones; MLs: macrolides; TCs: tetracyclines; BLs: β-lactams; APHs: amphenicols.

2.2 提取條件的優(yōu)化

采用振蕩加超聲的方式對(duì)土壤樣品中的抗生素進(jìn)行提取,考察不同種類(甲醇-Na2EDTA-McIlvaine緩沖液(1∶1, v/v)和乙腈-Na2EDTA-McIlvaine緩沖液(1∶1, v/v))和不同體積(5、7.5和10 mL)的萃取劑對(duì)目標(biāo)化合物提取效果的影響。結(jié)果表明,與甲醇-Na2EDTA-McIlvaine緩沖液相比,乙腈-Na2EDTA-McIlvaine緩沖液對(duì)氟喹諾酮類抗生素有更好的提取效果,這可能是因?yàn)榉Z酮類抗生素極性較大(logKow: -1.03～0.89)。以乙腈-Na2EDTA-McIlvaine緩沖液作為萃取劑,萃取劑的體積由5 mL提升至10 mL時(shí),氟喹諾酮類抗生素的回收率由15.0%～44.0%提升至48.0%～84.0%,部分磺胺類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的回收率也有10.0%～20.0%的提升。每次使用10 mL萃取劑對(duì)土壤樣品進(jìn)行提取,經(jīng)3次提取后,第4次的提取液中未檢測(cè)到目標(biāo)化合物。因此,最終選擇采用乙腈-Na2EDTA-McIlvaine緩沖液(1∶1, v/v)對(duì)土壤樣品提取3次,每次10 mL。

2.3 凈化條件的優(yōu)化

2.3.1萃取液pH值的選擇

未經(jīng)調(diào)節(jié)的萃取液(乙腈-Na2EDTA-McIlvaine緩沖液(1∶1, v/v))pH約為4.0,在此條件下進(jìn)行固相萃取,β-內(nèi)酰胺類抗生素中的阿莫西林回收率僅為10.3%,可能是酸性條件下阿莫西林易降解[15]。探究中性到堿性的3個(gè)pH條件(pH 7.0、8.0、9.0)對(duì)各類抗生素回收率的影響。結(jié)果表明,萃取液pH的變化對(duì)林可霉素、氟喹諾酮類和酰胺醇類抗生素的回收率影響不大,而pH 8.0為磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類及β-內(nèi)酰胺類抗生素的最佳萃取液pH值,該條件下4類抗生素的回收率范圍在30.0%～132%(見(jiàn)圖2)。最終確定萃取液pH調(diào)節(jié)為8.0。

2.3.2淋洗液有機(jī)溶劑比例的選擇

為了保留目標(biāo)化合物并最大化地去除雜質(zhì),選取10 mL超純水、5 mL超純水+5 mL 5%(v/v)甲醇水溶液和5 mL超純水+5 mL 10%(v/v)甲醇水溶液作為淋洗液,以確定最佳的淋洗液有機(jī)溶劑的比例。結(jié)果表明,隨著淋洗液中有機(jī)溶劑比例的增加,大多數(shù)抗生素回收率無(wú)明顯變化,但是磺胺嘧啶和阿莫西林的回收率分別由76.6%和47.0%降低至19.5%和4.10%。甲醇是磺胺嘧啶和阿莫西林最常用的洗脫溶劑[6,14],磺胺嘧啶具有一定的親水性(logKow: -0.09),阿莫西林是一種強(qiáng)極性化合物,這可能導(dǎo)致它們?nèi)跷接诜聪喙滔噍腿⌒≈盍?并且在含有少量甲醇的淋洗液中即可被洗脫。此結(jié)果與目標(biāo)化合物在反相BEH-C18色譜柱上的洗脫情況一致,磺胺嘧啶和阿莫西林的保留時(shí)間分別為2.16 min和1.86 min,是所有目標(biāo)化合物中出峰時(shí)間最早的兩種抗生素。因此,確定將10 mL超純水作為固相萃取的淋洗液。這與Zhou等[14]的研究結(jié)果一致。

2.3.3洗脫液種類及體積的選擇

甲醇是最常被報(bào)道的抗生素的洗脫溶劑[14,16],由于目標(biāo)抗生素的極性普遍較大(logKow: -4.10～4.34),分別選取甲醇、乙腈和甲醇-乙腈(1∶1, v/v)混合溶液作為洗脫液,以考察不同洗脫液對(duì)抗生素洗脫效果的影響。結(jié)果顯示,甲醇-乙腈(1∶1, v/v)混合溶液作為洗脫液時(shí),各類抗生素的洗脫效果最佳,回收率范圍為34.5%～177%。

考察不同體積的洗脫液(6、10、12 mL)對(duì)抗生素洗脫效果的影響。結(jié)果顯示,對(duì)于酰胺醇類和部分磺胺類、氟喹諾酮類抗生素,6 mL洗脫液達(dá)不到理想的洗脫效果,而各類抗生素的回收率在用12 mL洗脫液洗脫的情況下較10 mL并沒(méi)有得到明顯提高。由此可見(jiàn),10 mL洗脫液足以將固相萃取柱上的抗生素洗脫完全。更大的體積不僅浪費(fèi)試劑,增加前處理時(shí)間,還可能帶來(lái)基質(zhì)效應(yīng)。因此,最終確定洗脫液體積為10 mL。

2.4 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.4.1線性范圍與方法檢出限

經(jīng)UHPLC-MS/MS檢測(cè)系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液后,以抗生素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x, μg/L),峰面積為縱坐標(biāo)(y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,所有抗生素的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.99(見(jiàn)表2)。分別以3倍和10倍信噪比計(jì)算方法檢出限和定量限,30種抗生素的方法檢出限和定量限分別為0.013～1.21和0.043～4.04 μg/kg。在低(2 μg/L)、中(20 μg/L)和高濃度(100 μg/L)條件下測(cè)定日內(nèi)和日間精密度,30種抗生素的日內(nèi)和日間精密度分別為0.238%～14.1%和0.507%～14.5%,均小于15%,證實(shí)了方法的重復(fù)性。

表 2 30種抗生素的方法檢出限、定量限、線性范圍及在3個(gè)濃度水平下的日內(nèi)和日間精密度

2.4.2回收率與基質(zhì)效應(yīng)

稱量0.25 g土壤樣品,添加抗生素標(biāo)準(zhǔn)品,使得加標(biāo)水平分別為20、100和200 μg/kg,每個(gè)濃度水平設(shè)4組平行。結(jié)果見(jiàn)表3,可以看出,僅有個(gè)別目標(biāo)化合物(磺胺喹噁啉、阿莫西林和青霉素)的回收率為27.1%～31.5%,其他27種抗生素的加標(biāo)回收率均在44.8%～164%之間,并且30種抗生素的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.700%～14.8%,均<15%,說(shuō)明該分析方法性能良好。

表 3 30種抗生素在土壤樣品中的加標(biāo)回收率和基質(zhì)效應(yīng)

磺胺喹噁啉、阿莫西林和青霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)與其他27種抗生素相比有一定差異。磺胺喹噁啉的logKow為1.68,親水性遠(yuǎn)小于其他7種磺胺類抗生素(logKow: -0.09～0.91)。阿莫西林和青霉素屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素,在β-內(nèi)酰胺環(huán)的環(huán)張力和羰基碳的親核能力作用下,這類抗生素具有高度的化學(xué)反應(yīng)活性[17]。由于理化性質(zhì)的差異,在30種抗生素同時(shí)分析測(cè)定的過(guò)程中,這3種抗生素可能存在一定的過(guò)程損失或較強(qiáng)的基質(zhì)抑制作用,從而導(dǎo)致回收率偏低。

在20、100和200 μg/kg的添加濃度下,比較基質(zhì)提取液和純?nèi)軇┲?0種抗生素的響應(yīng)值,以評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)(ME),結(jié)果見(jiàn)表3。ME<100%為基質(zhì)抑制作用,ME>100%為基質(zhì)增強(qiáng)作用。ME<50%或>150%為強(qiáng)基質(zhì)作用,50%≤ME≤80%或120%≤ME≤150%為中等基質(zhì)作用,80%

不同地區(qū)的土壤性質(zhì)各異,針對(duì)每個(gè)地區(qū)的土壤樣品制備基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的工作量巨大,不能滿足簡(jiǎn)單快速進(jìn)行定量分析的要求;此外,多種抗生素在土壤中的檢出率基本為100%,難以獲得空白基質(zhì)制備基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。因此,本工作使用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

2.4.3方法學(xué)比較

與其他已有文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比較(見(jiàn)表4),該方法的萃取溶劑用量少,且涉及的抗生素種類廣、數(shù)量多,能用于土壤樣品中痕量水平7類30種抗生素的同時(shí)分析檢測(cè)。其中磺胺類、氟喹諾酮類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類和酰胺醇類共27種抗生素的加標(biāo)回收率范圍為44.8%～164%。本研究中磺胺喹噁啉(27.1%～45.2%)、阿莫西林(29.6%～45.1%)和青霉素(29.1%～78.5%)的回收率較低,與其他研究[6,19,20]報(bào)道一致。如Guo等[20]采用QuEChERS-HPLC-MS/MS測(cè)定糞便中25種抗生素,其中磺胺喹噁啉的回收率最低(55.7%～56.8%); Cha等[19]利用固相萃取-HPLC-MS/MS檢測(cè)糞便中β-內(nèi)酰胺類抗生素,阿莫西林的回收率只有15%左右。

表 4 本文方法與其他文獻(xiàn)方法的比較

2.4.4實(shí)際土壤樣品的測(cè)定

分別采集來(lái)自鄭州、河池、聊城、衡陽(yáng)、萊州和白銀6個(gè)地區(qū)的6個(gè)農(nóng)田表層土壤樣品,使用建立的方法對(duì)土壤樣品中30種抗生素殘留進(jìn)行分析,統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表5,具體的濃度信息見(jiàn)圖3。共檢出30種抗生素中的17種,在每個(gè)樣品中的總含量為73.4～184 μg/kg,其余抗生素均未檢出。羅紅霉素、克拉霉素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星、氟羅沙星、洛美沙星、土霉素、多西環(huán)素、四環(huán)素和青霉素的檢出率均為100%,其中環(huán)丙沙星和諾氟沙星是每個(gè)土壤樣品中含量最高的兩種抗生素(見(jiàn)圖3),它們的含量分別是13.7～32.1和15.6～43.6 μg/kg,羅紅霉素、克拉霉素、氧氟沙星、恩諾沙星、氟羅沙星、洛美沙星、土霉素、多西環(huán)素、四環(huán)素和青霉素的含量分別是0.824～1.41、0.255～0.496、5.83～16.1、4.37～11.1、0.503～3.49、2.27～9.80、3.14～14.0、3.63～14.3、3.45～14.4和2.74～11.1 μg/kg?；前粪瓏f啉、甲氧芐啶、泰樂(lè)菌素、雙氟沙星和培氟沙星分別在1、3、4、4和2個(gè)土樣中被檢出,它們的含量分別為nd～0.238、nd～0.235、nd～1.23、nd～7.75和nd～8.51 μg/kg。主要抗生素的檢出率和濃度水平情況與之前研究報(bào)道的結(jié)果[21-29]基本一致。如Sun等[27]對(duì)中國(guó)長(zhǎng)三角地區(qū)農(nóng)田土壤中13 種抗生素殘留水平(磺胺類、四環(huán)素類和氟喹諾酮類)進(jìn)行了分析,其中環(huán)丙沙星含量為未檢出～1 030 μg/kg,其均值在所有抗生素中最高,為27.7 μg/kg; Gao等[22]測(cè)定了北京和上海城市土壤中的22種抗生素(磺胺類、氟喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類),其中諾氟沙星在所有樣本中檢出率最高(98%),含量為未檢出～2 160 μg/kg,均值為94.6 μg/kg。這說(shuō)明環(huán)丙沙星和諾氟沙星廣泛而大量存在于我國(guó)土壤環(huán)境中。

表 5 6個(gè)實(shí)際土壤樣品中30種抗生素的含量統(tǒng)計(jì)

圖 3 6個(gè)實(shí)際土壤樣品中30種抗生素的含量及分布情況Fig. 3 Contents and distributions of the 30 antibiotics in six real soil samples

3 結(jié)論

本研究建立了固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定土壤中痕量水平的7類30種抗生素的方法。該方法的線性范圍、檢出限、回收率及精密度等方法學(xué)指標(biāo)均可滿足土壤中抗生素的定性定量分析要求,且方法簡(jiǎn)單快速、溶劑用量少、抗生素檢測(cè)的種類廣、數(shù)量多,可望為土壤中抗生素的監(jiān)測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供方法學(xué)基礎(chǔ)。