基于小麥外引種質(zhì)資源的抗旱性分子標(biāo)記檢測及實(shí)用性評價

吳曉軍，胡喜貴，陳向東，姜小苓，張雪寧，王玉泉，董 娜，胡鐵柱，李笑慧，茹振鋼

(河南科技學(xué)院 小麥中心，河南省雜交小麥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 新鄉(xiāng) 453003)

小麥?zhǔn)鞘澜缰饕Z食作物之一，不斷提高產(chǎn)量、品質(zhì)和抗逆性是小麥育種的主要目標(biāo)[1]。近幾十年來，干旱已經(jīng)成為影響小麥生產(chǎn)的主要非生物因素之一，隨著全球氣候變暖，預(yù)計干旱的嚴(yán)重程度和發(fā)生頻率會進(jìn)一步增加[2-3]。因此，選育小麥強(qiáng)抗旱性品種將是促進(jìn)小麥生產(chǎn)持續(xù)高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的有效途徑[4-5]。隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)的深入研究，小麥抗旱性分子機(jī)制得以逐漸解析，并發(fā)現(xiàn)了一些與抗旱性相關(guān)的功能基因和緊密連鎖的分子標(biāo)記，分子標(biāo)記與常規(guī)育種相結(jié)合有利于提升小麥抗旱性育種效率。

植物在干旱等非生物因素脅迫下會產(chǎn)生滲透脅迫、離子脅迫和由于活性氧積累而產(chǎn)生的次級氧化脅迫[6]。鐵結(jié)合蛋白(Ferritin，F(xiàn)er)是一種存在于植物體內(nèi)的鐵儲藏蛋白，具有調(diào)節(jié)植物體內(nèi)鐵吸收與釋放以及提高植物抗氧化脅迫能力的功能[7]。鞠麗萍等[8]利用強(qiáng)抗旱和弱抗旱小麥品種中TaFer基因在染色體A1上的序列差異，設(shè)計出共顯性標(biāo)記FerA1-intrl，在150份小麥材料中檢測出2種變異類型，分別是TaFer-A1a(167 bp條帶)和TaFer-A1b(170 bp條帶)，單倍型TaFer-A1a材料的萌發(fā)期抗旱性極顯著高于單倍型TaFer-A1b。硫氧還蛋白(Thioredoxin，Trx)是一類在生物體內(nèi)廣泛分布的高度保守低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)，具有多種生物學(xué)功能，參與調(diào)節(jié)體內(nèi)氧化還原反應(yīng)平衡，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長，抑制凋亡，調(diào)節(jié)抗逆基因表達(dá)和抗氧化脅迫過程[9-11]。張帆等[12]在普通小麥5B染色體短臂上克隆了1個硫氧還蛋白超家族新基因TaNRX-B1，開發(fā)了2對顯性互補(bǔ)STS標(biāo)記，在150份小麥品種(系)中檢測到2種與抗旱性相關(guān)的變異類型，分別為抗旱型TaNRX-B1a(841 bp條帶)和敏感型TaNRX-B1b(870 bp條帶)。劉芳軍等[13]對117份寧夏小麥品種(系)以及孫曉燕等[14]對137份內(nèi)蒙古春小麥品種(系)育種材料進(jìn)行了FerA1-intrl標(biāo)記和TaNRX-B1標(biāo)記檢測分析，結(jié)果表明，2個分子標(biāo)記對小麥抗旱性進(jìn)行選擇是有效的。

小麥花前可溶性碳水化合物(Water soluble carbohydrate，WSC)占莖鞘總干質(zhì)量的40%以上[15]，是籽粒灌漿的重要碳源，對籽粒產(chǎn)量的貢獻(xiàn)率在20%左右，在干旱脅迫條件下貢獻(xiàn)率可高達(dá)50%以上[16]。果聚糖是小麥莖鞘中WSC的主要存在形式，最高可達(dá)莖鞘WSC的85%，當(dāng)莖鞘 WSC 轉(zhuǎn)運(yùn)時，果聚糖外切水解酶(Fructan exohydrolase，F(xiàn)EH)將果聚糖催化降解為蔗糖，再運(yùn)輸?shù)阶蚜Ｖ?，對小麥高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)具有重要作用[17-18]。Zhang等[19-20]利用2個普通小麥材料Westonia和Kauz克隆了3個1-FEH相關(guān)基因，其中位于6B染色體的1-FEHw3基因是催化果聚糖降解的主要基因，序列分析表明，在其啟動子上游279 bp的位置存在1個SNP位點(diǎn)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)與小麥品種Westonia在干旱條件下的高千粒質(zhì)量相關(guān)，小麥品種Kauz雖然也是耐旱品種，但是在干旱條件下的千粒質(zhì)量低于Westonia。據(jù)此設(shè)計出1對CAPS標(biāo)記，用以區(qū)分高千粒質(zhì)量抗旱型Westonia type(102 bp條帶)和低千粒質(zhì)量抗旱型Kauz type(116 bp條帶)。

脫水反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(DREB)屬于AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員，能夠調(diào)控一些干旱、高鹽和低溫等相關(guān)基因的表達(dá)，在植物抗逆境脅迫過程中發(fā)揮著重要作用[21]。雷夢林等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在PEG、NaCl、ABA和低溫脅迫下，Dreb-A1、Dreb-B1基因在葉片和幼根中均上調(diào)表達(dá)。王計平等[23]對43份小麥材料進(jìn)行苗期抗旱性鑒定，其中人工合成六倍體小麥W7984的抗旱性等級為中等抗旱性，普通小麥Opata 85為干旱敏感。Wei等[24]利用2個小麥材料Opata85和W7984克隆TaDreb基因，序列分析發(fā)現(xiàn)，位于TaDreb-B1基因片段上的內(nèi)含子具有2個SNP (646 bp和770 bp位置)差異，根據(jù)基因770 bp處的 SNP(A/C)設(shè)計等位基因特異性PCR(Allele specific PCR，AS-PCR )引物，將TaDreb-B1基因定位于3B染色體長臂上，開發(fā)的多態(tài)性分子標(biāo)記TaDreb-B1在人工合成六倍體小麥W7984中擴(kuò)增出2條帶(616 bp條帶和低于600 bp的條帶)，為抗旱型TaDreb-B1a，而在普通小麥Opata85中只擴(kuò)增出1條616 bp條帶，為干旱敏感型TaDreb-B1b。

黃淮麥區(qū)是我國小麥主產(chǎn)區(qū)，生長期內(nèi)降水量少，干旱天氣對小麥生產(chǎn)影響較大，近年來受全球變暖影響，干旱天氣更是頻發(fā)[25-26]。因此，在小麥育種中應(yīng)特別注重親本材料抗旱性的鑒定及改良。為此，對48份國外引進(jìn)的小麥種質(zhì)進(jìn)行相對發(fā)芽率表型鑒定，并利用4個小麥抗旱性相關(guān)基因1-feh-w3、Dreb-B1、NRX-B1和FerA1的分子標(biāo)記進(jìn)行抗旱性檢測，以評價這些抗旱性相關(guān)分子標(biāo)記的有效性，篩選抗旱能力突出的抗旱基因組合及相關(guān)小麥種質(zhì)，為小麥育種中的親本選擇和抗旱性分子標(biāo)記利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

48份國外小麥種質(zhì)分別引自澳大利亞、墨西哥、法國、智利等10多個國家，其中Madsen、Attila、Pavon、Pastor、Norin61、Salmone、Kanto107、Manital、Opata、Glenlea、RL6077共11份材料，由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所資源庫提供，其余材料由河南科技學(xué)院小麥中心保存并提供。

1.2 萌發(fā)期抗旱性鑒定

按照小麥抗旱性鑒定評價技術(shù)規(guī)范(GB/T 21127—2007)測定小麥種子的相對發(fā)芽率(20% PEG-6000溶液培養(yǎng)7 d的小麥種子發(fā)芽率與蒸餾水培養(yǎng)7 d的小麥種子發(fā)芽率的比值)。根據(jù)相對發(fā)芽率數(shù)值劃分抗旱等級，分為極強(qiáng)(相對發(fā)芽率≥90.0%)、強(qiáng)(70.0%～89.9%)、中等(50.0%～69.9%)、弱(30.0%～49.9%)、極弱(相對發(fā)芽率≤29.9%)5個等級[27]。

1.3 DNA提取和分子標(biāo)記檢測

小麥基因組總DNA采用CTAB法提取，將DNA原液稀釋至100 ng/μL質(zhì)量濃度，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4個抗旱性相關(guān)基因1-feh-w3(CAPs分子標(biāo)記)、Dreb-B1(AS-PCR)、FerA1(SSR分子標(biāo)記)和NRX-B1(STS分子標(biāo)記)的分子標(biāo)記引物均由上海賽默飛世爾科技有限公司合成，引物信息見表1。PCR擴(kuò)增體系為20 μL，包含2×TaqMaster Mix 10 μL(北京康為世紀(jì)生物有限公司)、10 μmol/L正反向引物各0.6 μL、100 ng/μL DNA模板1 μL、ddH2O 7.8 μL。PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，52～58 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，32～35個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。

表1 4個分子標(biāo)記的引物信息Tab.1 Primer information of 4 molecular markers

1-feh-w3基因的CAPs分子標(biāo)記 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度為241 bp，使用限制性內(nèi)切酶BsoBⅠ對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，15 μL酶切體系包括限制性內(nèi)切酶BsoBⅠ 0.3 μL、DNA 10 μL、10×NEBuffer 1.5 μL、ddH2O 3.2 μL，然后將酶切產(chǎn)物使用12%非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳檢測。Dreb-B1基因的分子標(biāo)記根據(jù)基因770 bp處的 SNP設(shè)計等位基因特異性PCR(AS-PCR)引物，NRX-B1基因的分子標(biāo)記為顯性互補(bǔ)STS標(biāo)記，它們的擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，然后用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。FerA1基因的分子標(biāo)記為 SSR分子標(biāo)記，擴(kuò)增產(chǎn)物用12%非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳檢測，銀染后分析結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計分析

使用軟件Excel 2016、SPSS 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。參考張海萍等[28]的方法，對含有該等位基因的品種賦值為“1”，不含該等位基因的品種賦值為“0”，采用SPSS 25.0進(jìn)行分子標(biāo)記單倍型與相對發(fā)芽率的相關(guān)性分析，利用Spearman相關(guān)分析模型評估每個等位基因與相對發(fā)芽率的相關(guān)顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 48份小麥外引種質(zhì)的種子相對發(fā)芽率

相對發(fā)芽率測定結(jié)果顯示，48份小麥外引種質(zhì)材料相對發(fā)芽率為34.9%～94.5%，平均相對發(fā)芽率為70.0%(表2)，種質(zhì)材料的相對發(fā)芽率間存在明顯差異。其中，抗旱性等級達(dá)極強(qiáng)、強(qiáng)、中等、弱和極弱的種質(zhì)材料分別為3，22，16，7，0份，占到供試材料的6.3%，45.8%，33.3%，14.6%和0；中等及以上抗旱等級的種質(zhì)材料占85.4%；其中，種質(zhì)墨S139、CL0442、Salmone的相對發(fā)芽率分別為94.5%，93.8%，93.0%，達(dá)極強(qiáng)抗旱等級(表2)。

表2 48份外引種質(zhì)中抗旱基因單倍型類型及相對發(fā)芽率Tab.2 Haplotypes and relative germination rate of drought resistant genes in 48 introduced germplasms

表2(續(xù))

2.2 1-feh-w3基因的分子標(biāo)記檢測

利用1-feh-w3基因的CAPs分子標(biāo)記(引物6BPF2、6B60R)對48份外引小麥種質(zhì)進(jìn)行檢測，擴(kuò)增產(chǎn)物長為241 bp，再經(jīng)限制性內(nèi)切酶BsoBⅠ酶切，切出102 bp條帶的為Westonia type，切出116 bp條帶的為Kauz type。結(jié)果顯示，31份小麥種質(zhì)酶切切出102 bp特異性條帶，為高千粒質(zhì)量抗旱型Westonia type，占64.6%，其余17份小麥種質(zhì)酶切切出116 bp特異性條帶，為低千粒質(zhì)量抗旱型Kauz type，占35.4%(圖1、表2)。

2.3 Dreb-B1基因的分子標(biāo)記檢測

利用Dreb-B1基因序列770 bp處的SNP設(shè)計AS-PCR引物(P40、P18R)，對48份外引種質(zhì)進(jìn)行檢測，其中擴(kuò)增產(chǎn)物有2條帶(1條為616 bp，1條小于616 bp)的為抗旱型TaDreb-B1a，擴(kuò)增產(chǎn)物只有1條616 bp特異性條帶的為干旱敏感型TaDreb-B1b。結(jié)果顯示，17份小麥種質(zhì)擴(kuò)增出1條616 bp特異性條帶，為干旱敏感型TaDreb-B1b，占35.4%，其余31份小麥種質(zhì)擴(kuò)增出2條特異性條帶，為抗旱型TaDreb-B1a，占64.6%(圖2、表2)。

2.4 NRX-B1基因的分子標(biāo)記檢測

利用NRX-B1基因顯性互補(bǔ)STS標(biāo)記對48份外引種質(zhì)進(jìn)行檢測，在25份小麥種質(zhì)中擴(kuò)增出抗旱型TaNRX-B1a單倍型的841 bp特異性條帶，占52.1%；在18份小麥種質(zhì)中擴(kuò)增出干旱敏感型TaNRX-B1b單倍型的870 bp特異性條帶，占37.5%；48份外引種質(zhì)中有5份小麥種質(zhì)沒有擴(kuò)增出條帶，占10.4%(圖3、表2)。

2.5 FerA1基因的分子標(biāo)記檢測

利用FerA1基因的共顯性STS標(biāo)記對48份外引小麥種質(zhì)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，有2份小麥種質(zhì)擴(kuò)增出170 bp特異性條帶，為干旱敏感型TaFer-A1b單倍型，占4.2%；其余46份小麥種質(zhì)均同時擴(kuò)增出167，170 bp 2條帶，為FerA1基因雜合型位點(diǎn)，占95.8%(圖4、表2)。

2.6 基因單倍型與相對發(fā)芽率的關(guān)系及相關(guān)性分析

本研究中，每個抗旱相關(guān)基因均包含2種單倍型，就單個基因2種單倍型的平均相對發(fā)芽率來看，1-feh-w3基因的Westonia type 單倍型與Kauz type單倍型沒有顯著差異；Dreb-B1基因和FerA1基因各自的2種單倍型間差異均達(dá)顯著水平；NRX-B1基因的TaNRX-B1b單倍型平均相對發(fā)芽率略高于TaNRX-B1a，但差異不顯著(表3)。其中，TaDreb-B1a單倍型的平均相對發(fā)芽率最高，為72.75%，TaFer-A1(H)單倍型平均相對發(fā)芽率次之，為70.94%。

4個抗旱性基因單倍型與平均相對發(fā)芽率的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，1-feh-w3基因的單倍型Westonia type和Kauz type，NRX-B1基因的單倍型TaNRX-B1a和TaNRX-B1b與相對發(fā)芽率相關(guān)性不顯著；Dreb-B1基因的TaDreb-B1a單倍型與相對發(fā)芽率呈顯著正相關(guān)，TaDreb-B1b單倍型與相對發(fā)芽率呈顯著負(fù)相關(guān)；FerA1基因的TaFer-A1(H)單倍型與相對發(fā)芽率呈顯著正相關(guān)，TaFer-A1b單倍型與相對發(fā)芽率呈顯著負(fù)相關(guān)(表3)。

在外引種質(zhì)材料中，4個基因共有10種單倍型組合類型(表4)，單倍型組合Westonia type/TaDreb-B1a/TaFer-A1(H)/TaNRX-B1b占總數(shù)比例最高，為20.8%，達(dá)強(qiáng)抗旱性等級，Kauz type/TaDreb-B1b/TaFer-A1(H)的比例最低，為2.1%，達(dá)中等抗旱性等級。平均相對發(fā)芽率最高的單倍型組合是Westonia type/TaDreb-B1a/TaFer-A1(H)/TaNRX-B1a，達(dá)77.35%，其次Westonia type/TaDreb-B1a/TaFer-A1(H)/TaNRX-B1b，為75.82%，Kauz type/TaDreb-B1a/TaFer-A1(H)/TaNRX-B1a，為75.39%，以上單倍型組合均達(dá)到強(qiáng)抗旱性等級；平均相對發(fā)芽率最低的單倍型組合是Westonia type/TaDreb-B1a/TaFer-A1b，為48.16%，且未檢測到TaNRX-B1基因的單倍型，為弱抗旱性等級。Westonia type/TaDreb-B1a/TaFer-A1(H)/TaNRX-B1a、Westonia type/TaDreb-B1a/TaFer-A1(H)/TaNRX-B1b、Kauz type/TaDreb-B1a/TaFer-A1(H)/TaNRX-B1a單倍型組合類型中，中等及以上抗旱性等級種質(zhì)材料分別占該組合類型的100.0%,90.0%,100.0%(表4)。

表3 不同基因單倍型對種子相對發(fā)芽率的影響及相關(guān)性分析Tab.3 Performance of seed relative germination rate of different haplotypes and correlation analysis

表4 不同單倍型組合對種子相對發(fā)芽率的影響Tab.4 Performance of seed relative germination rate of different haplotype combinations %

3 結(jié)論與討論

相對發(fā)芽率與抗旱指數(shù)呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，能在一定程度上反映小麥全生育期的抗旱性，是評估小麥抗旱性的重要指標(biāo)[29]。雖然對于小麥抗旱相關(guān)基因位點(diǎn)的研究取得了較多進(jìn)展，但相關(guān)抗旱性分子標(biāo)記在小麥育種中的應(yīng)用還較為有限[30]。張帆等[12]利用開發(fā)的TaNRX-B1基因抗旱性分子標(biāo)記對150份小麥品種(系)進(jìn)行檢測，平均相對發(fā)芽率達(dá)到中等及以上抗旱性等級品種(系)占70.0%，TaNRX-B1a單倍型的平均相對發(fā)芽率顯著高于TaNRX-B1b單倍型。劉芳軍等[13]利用TaFer-A1和TaNRX-B1基因的抗旱性分子標(biāo)記 對117份寧夏小麥品種(系)進(jìn)行檢測，并鑒定了種子萌發(fā)期的相對發(fā)芽率，結(jié)果顯示，寧夏小麥種子萌發(fā)期平均相對發(fā)芽率達(dá)到73.3%，中等及以上抗旱性等級品種(系)占75.2%；TaFer-A1和TaNRX-B1基因的分子標(biāo)記檢測結(jié)果與平均相對發(fā)芽率表型一致性較好，可以用于小麥抗旱性的鑒定和篩選。孫曉燕等[14]利用TaFer-A1和TaNRX-B1基因的抗旱性分子標(biāo)記對137份內(nèi)蒙古春小麥育種材料進(jìn)行檢測，有58份材料屬于抗旱基因型。本研究中，48份外引小麥種質(zhì)的平均相對發(fā)芽率達(dá)到70.0%，而中等及以上抗旱性等級的種質(zhì)材料占到85.4%，明顯超過以上國內(nèi)研究中的抗旱小麥種質(zhì)的比例?？赡艿脑蚴?，一直以來從不同地區(qū)引進(jìn)的小麥種質(zhì)資源對改良國內(nèi)小麥的產(chǎn)量性狀、品質(zhì)性狀和抗逆性等起到了重要作用[31]，一般都具有優(yōu)良的農(nóng)藝性狀，經(jīng)過優(yōu)選引入國內(nèi)，總體上來說平均抗旱水平相對高出一些。

本研究中，TaDreb-B1a單倍型的平均相對發(fā)芽率最高，為72.75%，TaFer-A1(H)單倍型平均相對發(fā)芽率為70.94%，兩者均與平均相對發(fā)芽率表型呈顯著正相關(guān)關(guān)系，且TaDreb-B1a單倍型與TaDreb-B1b單倍型，TaFer-A1(H)單倍型與TaFer-A1b單倍型的平均相對發(fā)芽率差異均達(dá)到顯著水平，說明Dreb-B1和FerA1基因的抗旱性分子標(biāo)記可用于小麥抗旱性的鑒定和篩選。而1-feh-w3和NRX-B1基因的抗旱性分子標(biāo)記與供試材料的平均相對發(fā)芽率相關(guān)并不顯著。1-feh-w3基因的Westonia type單倍型與Kauz type單倍型，NRX-B1基因的TaNRX-B1a單倍型與TaNRX-B1b單倍型間平均相對發(fā)芽率差異均不顯著。分析認(rèn)為，1-feh-w3基因的單倍型Westonia type與Kauz type的抗旱性表型差異研究是基于小麥品種Westonia和Kauz為親本創(chuàng)制的DH系，在其他小麥品種(系)中的驗(yàn)證研究還未見報道，在本研究中的檢測效果并不理想。NRX-B1基因的單倍型TaNRX-B1a與TaNRX-B1b在前人研究中具有顯著差異，對小麥抗旱性檢測是有效的[13-14]，但并未進(jìn)行相關(guān)性分析，基因效應(yīng)大小也不明確，而在本研究中顯示檢測效果并不理想，還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

10種單倍型組合的平均相對發(fā)芽率值大小與各基因抗旱性單倍型累加結(jié)果基本一致。平均相對發(fā)芽率以單倍型組合Westonia type/TaDreb-B1a/TaFer-A1(H)/TaNRX-B1a最高，Westonia type/TaDreb-B1a/TaFer-A1(H)/TaNRX-B1b次之，Kauz type/TaDreb-B1a/TaFer-A1(H)/TaNRX-B1a稍低于Westonia type/TaDreb-B1a/TaFer-A1(H)/TaNRX-B1b。除此之外，單倍型組合Westonia type/TaDreb-B1b/TaFer-A1(H)/TaNRX-B1a的平均相對發(fā)芽率低于Westonia type/TaDreb-B1b/TaFer-A1(H) /TaNRX-B1b，充分表明NRX-B1基因在本研究中對抗旱性的檢測是無效的。小麥抗旱性是由眾多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀，雖然許多抗旱相關(guān)基因被克隆出來，但涉及不同代謝通路，抗旱機(jī)制十分復(fù)雜，而且受環(huán)境因素的影響也較大[29]，這就需要進(jìn)一步加強(qiáng)基因功能及其調(diào)控研究，并使用更多的小麥品種(系)對相關(guān)抗旱性分子標(biāo)記的有效性進(jìn)行充分驗(yàn)證。

本研究對48份小麥外引種質(zhì)材料的相對發(fā)芽率進(jìn)行測定，利用4個分子標(biāo)記檢測所含抗旱性基因單倍型類型，鑒定出一些抗旱種質(zhì)資源。并首次驗(yàn)證了抗旱性相關(guān)基因Dreb-B1分子標(biāo)記的有效性，初步證明了1-feh-w3基因2種單倍型對抗旱性選擇是無效的。研究結(jié)果為外引種質(zhì)的有效利用和抗旱性分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)在小麥育種中的應(yīng)用提供了一些科學(xué)依據(jù)。