牡丹PsZFP1轉(zhuǎn)錄因子的特性及表達(dá)分析

劉 慶，孫廷釗，蓋樹鵬，張玉喜，劉春英

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東省高校植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109)

鋅指蛋白(Zinc finger protein，ZFP)是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在植物生長發(fā)育和逆境響應(yīng)中均起著重要作用。ZFP最早是在非洲爪蟾(Xenopuslaevis)的卵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的[1]。鋅指蛋白均具有保守的鋅指結(jié)構(gòu)域，根據(jù)其序列結(jié)構(gòu)和功能的不同，將其分為C8、C6、C4、C2H2、C3H、C3HC4、C2HC、C2HC5和C4HC39種類型[2]。近些年研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中的CCCH型鋅指蛋白HUA1參與了開花過程的調(diào)控[3]；麻瘋樹鋅指蛋白JcZFP8在煙草中異源表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其可能通過激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑間接調(diào)控?zé)煵莸拿珷铙w發(fā)育[4]；蓖麻鋅指蛋白RcDof參與調(diào)控其植株矮化[5]；沙冬青C2H2型鋅指蛋白基因AmZFP1的轉(zhuǎn)錄水平在干旱或者低溫脅迫下均明顯升高，推測其可能在沙冬青的抗旱和抗寒過程中起重要調(diào)節(jié)作用[6]。此外，Huang等[7]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)OsZFP245基因的水稻株系中脯氨酸含量升高，活性氧清除能力增強(qiáng)，其耐受低溫和干旱脅迫的能力顯著提高?？梢姡\指蛋白在植物冷響應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)是原產(chǎn)中國的名貴木本花卉[8]，觀賞價值和經(jīng)濟(jì)價值極高。反季節(jié)催花是牡丹產(chǎn)業(yè)的重要組成部分，其關(guān)鍵問題是解除花芽內(nèi)休眠[9]。越來越多的證據(jù)表明，低溫是打破花芽內(nèi)休眠的有效途徑[10]。前期利用抑制消減文庫篩選到可能與內(nèi)休眠解除相關(guān)的線粒體磷酸轉(zhuǎn)移子(Mitochondrial phosphate transporter，PsMPT)，該基因受低溫累積誘導(dǎo)，調(diào)控能量代謝，促進(jìn)休眠解除[11-12]；并證明其啟動子中的MYC為響應(yīng)低溫的順式作用元件[13]。最近，通過酵母單雜交篩選到一個可能與MYC序列相互作用的鋅指蛋白PsZFP1。本研究克隆了PsZFP1的開放閱讀框(ORF)并對其進(jìn)行了生物信息學(xué)、表達(dá)特性和轉(zhuǎn)錄因子特性分析，構(gòu)建原核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化BL21，最后將表達(dá)出的可溶性重組蛋白純化，旨在為進(jìn)一步研究PsZFP1參與調(diào)控牡丹花芽休眠解除機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 4～5年生牡丹品種魯菏紅(PaeoniasuffruticosaLuhehong)的健壯植株(購自山東菏澤牡丹研究所)。

1.1.2 質(zhì)粒及菌種 質(zhì)粒pGBKT7和酵母菌株Y187購自CLONTECH公司；克隆載體質(zhì)粒pMD18-T購自TaKaRa公司；大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌GV3101和質(zhì)粒pBI121由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物遺傳與發(fā)育實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌BL21和原核表達(dá)載體pET28a+由郭寶太教授饋贈。

1.1.3 主要試劑 各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、DNA Marker、Protein Marker、SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit (Clontech)、PrimeScript?RT Master Mix (Perfect Real Time)和SYBR?PremixExTaqTM(Tli RNase H Plus)均購自大連的TaKaRa公司；RNAprep pure Plant Kit和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；SanPrep柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒和Ni-NTA重力預(yù)裝柱購自上海生工生物工程有限公司；化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 材料處理及取樣 將4～5 年生牡丹魯菏紅的健壯植株分別在4 ℃冷庫中處理0，7，14，21，28 d后，選取健壯頂端花芽，剝?nèi)ネ鈱喻[片，液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA的提取和檢測 采用RNAprep pure Plant Kit(DP441)提取花芽的總RNA，然后利用1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳和微量ND 1000分光光度計(jì)(Thermo)分別對提取的總RNA進(jìn)行質(zhì)量和濃度檢測。

1.2.2PsZFP1的全長cDNA擴(kuò)增及生物信息學(xué)分析 設(shè)計(jì)特異引物PsZFP1-5′(表1)與SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit中的自帶引物UPM配對使用。以牡丹花芽的總RNA為模板，按照試劑盒說明書進(jìn)行5′-RACE擴(kuò)增。將回收的5′-RACE擴(kuò)增片段連接轉(zhuǎn)化和測序拼接后，得到PsZFP1基因的全長cDNA序列。用EditSeq軟件分析PsZFP1序列的開放閱讀框序列，用MEGA 6.0軟件進(jìn)行該蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。

1.2.3PsZFP1基因ORF的克隆 根據(jù)PsZFP1的開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)設(shè)計(jì)帶有不同酶切位點(diǎn)的引物(表1)，以cDNA為模板，采用EasyTaq?DNA Polymerase(全式金，北京)擴(kuò)增目的基因。經(jīng)連接轉(zhuǎn)化、菌落PCR和質(zhì)粒雙酶切鑒定得到陽性克隆，將其送至擎科生物公司測序。獲得的PsZFP1基因的ORF用于構(gòu)建不同載體，進(jìn)行PsZFP1的亞細(xì)胞定位、轉(zhuǎn)錄激活分析和原核表達(dá)。

1.2.4 PsZFP1的亞細(xì)胞定位 將1.2.3中擴(kuò)增得到的PsZFP1的ORF(不含終止密碼子)構(gòu)建到pBI121-GFP載體上，獲得pBI121-PsZFP1-GFP表達(dá)載體。將pBI121-GFP(對照)和pBI121-PsZFP1-GFP分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，侵染煙草(Nicotianabenthamiana)葉片，暗培養(yǎng)24 h，光照培養(yǎng)72 h后使用激光共聚焦顯微鏡觀察，利用熒光染料DAPI(4，6-diamidino-2-phenylindole)指示細(xì)胞核位置。

表1 本研究中所用引物Tab.1 Primers used in this study

1.2.5 PsZFP1的轉(zhuǎn)錄激活分析 將PsZFP1ORF重組到pGBKT7載體上，pGBKT7(對照)和pGBKT7-PsZFP1分別轉(zhuǎn)化酵母菌株Y187，并在SD/-Trp、SD/-Trp/-His/-Ade和含有X-α-gal的SD/-Trp/-His/-Ade培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～5 d，觀察并拍照。

1.2.6PsMPT啟動子與PsZFP1蛋白互作檢測 將PsMPT基因啟動子序列中的低溫響應(yīng)元件MYC的三重復(fù)序列重組到pHIS2.1載體上，獲得pHIS2.1-MYC重組誘餌表達(dá)質(zhì)粒。將PsZFP1的ORF重組到pGADT7載體上，獲得pGADT7-PsZFP1重組質(zhì)粒。將pHIS2.1-MYC分別與 pGADT7(對照)和pGADT7-PsZFP1共同轉(zhuǎn)化酵母菌株Y187，在SD-Leu/-Trp培養(yǎng)4 d后，挑取單菌落分別溶于200 μL滅菌超純水中，并分別吸取原液、稀釋10，100倍的稀釋液各2 μL，按濃度依次點(diǎn)在SD/-His/-Leu/-Trp/50 mmol/L 3-AT培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～5 d，觀察并拍照。

1.2.7PsZFP1的表達(dá)特性分析 分別以4 ℃處理 0，7，14，21，28 d的牡丹花芽cDNA為模板，采用qRT-PCR技術(shù)檢測PsZFP1基因在低溫解除休眠過程中的轉(zhuǎn)錄水平，所用引物見表1，qRT-PCR體系按照SYBR Premix ExTaqTMⅡ(TaKaRa)配制，在Applied Biosystems Quant Studio TM 5(ABI，美國)熒光定量PCR系統(tǒng)上運(yùn)行。以牡丹的Actin基因?yàn)閮?nèi)參，用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。3個生物學(xué)重復(fù)。

1.2.8PsZFP1的原核表達(dá)及純化 將PsZFP1ORF插入到原核表達(dá)載體pET28a+，經(jīng)PCR和酶切鑒定后，將重組質(zhì)粒pET28a+-PsZFP1轉(zhuǎn)化至菌株BL21。選取陽性克隆至含Kan的 LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。提取水溶性蛋白和包涵體，進(jìn)行 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，考馬斯亮藍(lán)染色后，再用脫色液脫色至蛋白條帶清晰可見。重組蛋白使用Ni-NTA親和層析技術(shù)分離純化，并利用SDS-PAGE檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 PsZFP1基因的5′-RACE擴(kuò)增及生物信息學(xué)分析

以牡丹花芽的總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后對PsZFP1基因進(jìn)行5′-RACE擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示。測序結(jié)果顯示，擴(kuò)增得到的5′-RACE序列為987 bp，與本實(shí)驗(yàn)室前期獲得的PsZFP1基因的序列進(jìn)行拼接后，獲得PsZFP1基因的全長cDNA序列為1 313 bp，包含5′-UTR序列204 bp，3′-UTR序列194 bp，最大ORF為915 bp，編碼304個氨基酸。推測該蛋白的理論分子量約為31.829 ku，等電點(diǎn)(pI)為9.41，推測其分子式為C1379H2159N417O415S19，不穩(wěn)定系數(shù)36.8，為親水性的穩(wěn)定蛋白，具有CCCH保守結(jié)構(gòu)域(圖2)。用MEGA 6.0軟件構(gòu)建牡丹PsZFP1與其他12個物種ZFP的系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)牡丹PsZFP1與葡萄VvZFP的親緣關(guān)系最近(圖3)。

2.2 PsZFP1基因的ORF擴(kuò)增

以牡丹花芽的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增含有不同酶切位點(diǎn)的PsZFP1的ORF序列，得到與預(yù)期大小一致的特異條帶(圖4)，用于構(gòu)建不同載體進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 PsZFP1的亞細(xì)胞定位

利用熒光顯微鏡觀察PsZFP1的亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)其定位于細(xì)胞核中(圖5)。

2.4 PsZFP1的轉(zhuǎn)錄激活分析

如圖6所示，含有pGBKT7的酵母菌株Y187(對照菌)可以在SD/-Trp培養(yǎng)基上生長，但在SD/-Trp/-His/-Ade和含有X-α-gal的SD/-Trp/-His/-Ade培養(yǎng)基上均無法生長。而含有pGBKT7-PsZFP1的酵母菌株Y187(重組菌)在3種培養(yǎng)基上均可生長，且在含有X-α-gal的SD/-Trp/-His/-Ade培養(yǎng)基上生長的菌落顯藍(lán)色，這表明PsZFP1具有轉(zhuǎn)錄激活活性。

2.5 PsMPT啟動子與PsZFP1蛋白互作檢測

如圖7所示，只有含pGADT7-PsZFP1+pHIS2.1-MYC的酵母菌株Y187可以在TDO(SD/-His/-Leu/-Trp/+50 mmol/L 3-AT)培養(yǎng)基上生長，而含pGADT7+pHIS2.1-MYC的酵母菌株Y187(對照菌)不能在TDO培養(yǎng)基上生長，表明PsZFP1可以與PsMPT啟動子的MYC元件互作。

2.6 PsZFP1的表達(dá)特性分析

為研究PsZFP1基因的表達(dá)是否受低溫累積誘導(dǎo)，本研究利用qRT-PCR技術(shù)分析了PsZFP1基因在低溫處理不同時間的花芽中的表達(dá)模式。結(jié)果表明，PsZFP1基因的表達(dá)量隨低溫天數(shù)的增加呈上調(diào)趨勢，在低溫21 d時其表達(dá)水平達(dá)到峰值，但在低溫28 d時表達(dá)量顯著下降(圖8)。

2.7 PsZFP1的原核表達(dá)及純化

經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，含重組質(zhì)粒pET28a+-PsZFP1的原核表達(dá)菌株BL21表達(dá)出分子量約為37 ku的重組蛋白，且重組蛋白主要集中在包涵體中(圖9-A)。利用Ni-NTA親和層析技術(shù)純化重組蛋白，SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示成功獲得較為純凈的重組蛋白(圖9-B)。

3 結(jié)論與討論

CCCH型鋅指蛋白含有由3個半胱氨酸殘基和1個組氨酸殘基組成的CCCH鋅指結(jié)構(gòu)，通過與RNA、DNA或蛋白質(zhì)結(jié)合直接或間接調(diào)控相關(guān)靶基因、蛋白質(zhì)的表達(dá)[14-15]。研究表明，甘薯的CCCH型鋅指蛋白IbC3H18是1種核轉(zhuǎn)錄激活劑，可調(diào)控活性氧清除、ABA信號傳導(dǎo)、光合作用和離子傳遞等相關(guān)途徑的一些非生物脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)[16]。擬南芥AtC3H14蛋白也具有轉(zhuǎn)錄激活作用，可與靶基因如多聚半乳糖醛酸酶基因的RNA結(jié)合，并且參與其靶基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[17]。從橡膠樹中分離的蛋白HbCZF1，具有CCCH型鋅指結(jié)構(gòu)，可與HMG1基因的啟動子結(jié)合激活3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶的表達(dá)，調(diào)控天然橡膠的生物合成[18]。Zhang等[19]發(fā)現(xiàn)水稻的CCCH鋅指蛋白ⅡP4可以抑制次生壁的合成。水稻OsDOS過表達(dá)株系的葉片衰老顯著延遲，而Osdos突變株的葉片衰老進(jìn)程明顯加快[20]。棉花蛋白GhZFP1具有CCCH型結(jié)構(gòu)，過表達(dá)GhZFP1的煙草植株的抗立枯絲核菌能力和耐鹽能力均增強(qiáng)[21]。擬南芥的AtC3H7過表達(dá)植株的抗鹽脅迫能力更強(qiáng)[22]。近期研究發(fā)現(xiàn)，多種PvC3Hs對柳枝稷的抗寒性起調(diào)控作用，過表達(dá)PvC3H72的柳枝稷株系在4 ℃下的耐寒性明顯增強(qiáng)。PvC3H72與ICE1-CBF-COR調(diào)節(jié)因子和ABA應(yīng)答基因共同提高了柳枝稷的抗寒性[23]。在水稻中，低溫脅迫可誘導(dǎo)CCCH型鋅指蛋白OsTZF5基因的表達(dá)[24]。可見，CCCH型鋅指蛋白功能是多樣化的。

本研究對牡丹PsZFP1和不同物種中ZFP蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示,PsZFP1與葡萄的VvZFP同源性較高。PsZFP1蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測結(jié)果表明，該蛋白為親水性的穩(wěn)定蛋白，具有CCCH保守結(jié)構(gòu)域。PsZFP1蛋白亞細(xì)胞定位和轉(zhuǎn)錄激活活性的試驗(yàn)證實(shí)，PsZFP1蛋白定位于細(xì)胞核，且具有轉(zhuǎn)錄激活活性，因而具備轉(zhuǎn)錄因子的特性。這與Huang等[7]證實(shí)水稻鋅指蛋白OsZFP245定位于細(xì)胞核，具有反式激活活性的研究結(jié)果相似。

本研究的實(shí)時定量分析結(jié)果顯示，在低溫0～21 d，PsZFP1表達(dá)水平緩慢上調(diào)，在低溫21 d時急劇升高，表明該基因受低溫累積所誘導(dǎo)。PsZFP1與前期篩選到的線粒體磷酸轉(zhuǎn)移子基因的表達(dá)規(guī)律一致[11]。休眠解除時需要大量能量滿足花芽生理狀態(tài)和生長狀態(tài)的轉(zhuǎn)換，作為能量(ATP)合成的關(guān)鍵基因，PsMPT表達(dá)量此時急劇上升[11-12]，與這一需求相吻合。酵母單雜發(fā)現(xiàn)PsZFP1可結(jié)合在PsMPT啟動子上，表明PsZFP1可能是在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控PsMPT表達(dá)的重要因子。因此推測：伴隨著低溫的累積，PsZFP1表達(dá)水平不斷升高，促進(jìn)了PsZFP1蛋白積累，進(jìn)而激活了PsMPT的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，最終促進(jìn)了牡丹花芽的能量代謝和休眠解除[11-13]。因此，PsZFP1參與了牡丹花芽內(nèi)休眠的調(diào)控，本研究發(fā)現(xiàn)了CCCH鋅指蛋白新的功能。進(jìn)一步構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET28a+-PsZFP1，并在適宜條件下進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)及純化，獲得了較為純凈的PsZFP1蛋白，為后期研究PsZFP1蛋白的功能，及其參與低溫響應(yīng)的調(diào)控機(jī)制，解析牡丹花芽休眠解除的分子機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。