辣椒NHX基因家族的鑒定和表達分析

羅 建，許春苗，張國斌，郁繼華

(1.甘肅農業(yè)大學 園藝學院，甘肅 蘭州 730070；2.定西市安定區(qū)園藝工作站，甘肅 定西 743000)

栽培地土壤鹽分過高，土質鹽堿化成為植株生長和發(fā)育進程中的主要環(huán)境限制因子之一[1-3]。高鹽脅迫下植株生長環(huán)境改變，過多鈉離子(Na+)在植株體內累積，導致質膜完整性和通透性喪失[4]，正常生理活動被抑制，進而造成植物早衰加速，品質和產量下降[5-6]。研究表明，Na+/H+逆向轉運蛋白(Vacuolar Na+/H+exchange or antiporter，NHX)在植株體內不僅參與細胞擴增[7]、pH值調節(jié)[8]、保護K+穩(wěn)態(tài)性[9-10]，還可參與到抗鹽脅迫[11]和Na+長距離運輸[12]中可將植株細胞內多余吸收的Na+向外排出或在液泡中對Na+進行區(qū)域化來控制Na+累積對膜系統(tǒng)的傷害，是植株體內抵御鹽脅迫、維持離子穩(wěn)定、調節(jié)細胞滲透重要的參與者[13-14]。

在甜菜(Betavulgaris)[15]的下部根系中首次檢測到液泡膜型Na+/H+逆向轉運蛋白(NHX)活性的發(fā)生，隨后在擬南芥(Arabidopsisthaliana)[16]中發(fā)現植物中最早的液泡膜型Na+/H+逆向轉運蛋白基因AtNHX1的存在。目前已在玉米(Zeamays)[17]、鹽地堿蓬(Suaedasalsa)[18]、菊苣(CichoriumintybusL.)[19]、豇豆(VignaunguiculataL.)[20]等多種植物中克隆到液泡膜型Na+/H+逆向轉運蛋白基因NHX的同源基因，說明NHX1在高等植物生物進程中普遍存在[4，21]，且通過異源表達酵母互補試驗證實，NHX1基因不僅對酵母中Na+轉運起到直接調節(jié)作用，而且其耐鹽性也有所提高[22]。Fukuda等[23]研究發(fā)現，在鹽脅迫下，基因OsNHX1的產物可作為Na+/H+交換子，并在水稻的耐鹽性中起重要作用。郭會敏等[24]在200 mmol/L NaCl中進行NnNHX1基因轉化煙草耐鹽性研究發(fā)現，轉基因植株較對照有著良好的生長，且體內葉綠素含量顯著高于對照，膜完整性更好，耐鹽性提高。Zhang 等[25]在油菜研究中發(fā)現，過表達AtNHX1(來自擬南芥的液泡Na+/H+antiport)的轉基因甘藍型油菜植物能夠在200 mmol/L NaCl處理下進行正常的生理進程，其耐鹽性增加，且在油菜種子采收后其產量和菜籽油的品質在鹽脅迫下無影響。He等[26]研究棉花表明，在200 mmol/L NaCl脅迫下，過表達AtNHX1基因的棉花植株較野生型相比有著更好光合作用性能和更高的氮同化率，且其產量和棉花纖維品質提高，轉基因植株棉花的耐鹽脅迫能力提高。Bao等[27]研究百脈根時發(fā)現，過表達ZxNHX轉基因百脈根在200 mmol/L NaCl處理下較野生型表現出更好的保水能力和較高的凈光合作用率，其對鹽分的耐受性增強，植株生物量在后期生長中也有所增加。Su等[28]研究認為，高鹽脅迫下0.2 mg/L外源油菜素內酯(BL)的施用增加了蘋果幼苗體內反向轉運蛋白基因(MhNHXs)的表達水平，提高了植株耐鹽能力，有效減少了鹽脅迫下芽和根中Na+的積累，保持了蘋果幼苗體內滲透平衡。擬南芥AtNHX1在番茄[29]和菜籽[30]中超表達增加它們在高鹽環(huán)境中的抗性。Long等[31]發(fā)現，GhNHX1的沉默導致棉花幼苗對高鹽濃度的敏感性增強，這表明GhNHX1正調控棉花對鹽脅迫的耐受性。Mushke等[32]研究向日葵(HelianthusannuusL.)耐鹽性時發(fā)現，小麥TaNHX2基因過表達使得轉基因向日葵植物顯示出更好的抗細胞損傷保護能力，穩(wěn)定的相對水含量、葉綠素含量、脯氨酸積累增加和活性氧物種(ROS)清除能力提高，其對鹽分的抗性增強。Wu等[33]發(fā)現，AtNHX5在大豆中的超表達使得其在300 mmol/L NaCl脅迫下有著較強的耐受性。

目前，NHX耐鹽機制雖然在多種植物當中都有研究，然而在辣椒(CapsicumannuumL.)這種日常調味蔬菜中有關液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白NHX耐鹽性的作用機制研究尚不清楚，通過了解辣椒中NHX基因家族生物信息學功能，探究其在非生物脅迫下基因的表達特性，進而為辣椒CaNHX基因的功能開發(fā)以及辣椒耐鹽抗旱育種基因提供基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以當地日光溫室主栽辣椒品種隴椒5號為非生物脅迫處理材料。在隴椒5號辣椒幼苗真葉完全展開葉多于6片時進行[34]。

脅迫處理：滲透脅迫(PEG )利用5%濃度甘露醇，赤霉素 (GA3) 、茉莉酸甲酯 (MeJA) 和NaCl分別以濃度100，200，200 mmol/L噴施在辣椒幼苗真葉的正反面，對照以蒸餾水噴灑處理。辣椒幼苗植株培養(yǎng)在12 h光照(光照強度為200 μmol/(m2·s))和12 h黑暗的培養(yǎng)箱內；白天溫度設置為28 ℃，晚上設置為26 ℃[31]。

1.2 試驗方法

1.2.1 辣椒幼苗真葉總RNA的提取與cDNA的合成 總RNA的提取：按照PureLink RNA小量提取試劑盒說明書對幼苗真葉中RNA進行提取。

RNA逆轉錄為cDNA的步驟：利用mRNA模板按照InvitrogenTMSuperScriptTM試劑盒說明進行。

1.2.2 CaNHXs家族基因成員的篩索 利用擬南芥基因庫(https://www.arabidopsis.org)和茄科植物基因庫(https：//solgenomics.net)搜索刪選符合辣椒NHX相應序列的基因，確定其NHX基因家族的成員。

1.2.3 CaNHXs家族基因生物信息特性分析 利用ProtParam[34]對CaNHXs家族基因理化特質進行計算。NHX基因的信號肽、蛋白親疏水性以及跨膜結構分別通過SignalP4.1 Server、ProtScale和TMHMM進行預測。CaNHXs家族蛋白的保守結構域和亞細胞定位分析分別利用MEME和WoLF PSORT[35]進行。通過FGENESH-C[36]對序列進行基因框架預測。CaNHXs家族蛋白二級結構對比分析通過Prabi?；蝽樖阶饔迷治隼肞lantCARE軟件進行。通過在線軟件phyre(http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/)對NHX基因的三級結構進行預測。MEGA 5.0[37]和ClustalX[38]軟件對NHX基因進行系統(tǒng)發(fā)育樹繪制。

1.2.4 CaNHXs家族基因的定量表達分析 提取辣椒真葉葉片RNA，利用試劑盒反轉錄出cDNA，通過軟件Primer premier 5.0以辣椒Actin基因作內參設計引物，通過KAPA SYBR?FAST定量熒光儀，以不同非生物脅迫處理下辣椒真葉葉片cDNA為試材，對非生物脅迫處理CaNHXs基因家族進行定量熒光差異分析。差異表達量通過2-ΔΔCt法[39]計算得出。

定量熒光所用引物序列見表1。

表1 CaNHXs基因家族表達分析的實時熒光定量引物Tab.1 qRT-PCR primers for expression on analysis of CaNHXs

1.2.5 分析與繪圖 通過SPSS 22軟件對測得數據進行整理分析，利用Excel 2010繪圖，定量試驗均進行3次重復。

2 結果與分析

2.1 CaNHXs基因家族信息及蛋白理化性質分析

辣椒7個NHX基因通過ProtParam進行定位分析表明(表2)：7個辣椒NHX基因各自分布在5條染色體上。其基因大小之間差異明顯，CaNHX5的基因全長最小(1 231 bp)，CaNHX6的基因全長最長(11 897 bp)。CaNHXs的氨基酸數目維持在198～952，CaNHX5的氨基酸數目最小，為198 aa，CaNHX7的氨基酸數目最大，為952 aa。CaNHX5的相對分子質量最小，為21.868 57 ku，CaNHX7的相對分子質量最大，為105.113 89 ku。各基因等電點變化范圍差異較大，分布在5.53～9.18。CaNHX4和CaNHX7的不穩(wěn)定系數均大于40，說明這2個基因編碼產物不穩(wěn)定。

表2 辣椒NHX基因家族信息及理化性質Tab.2 Physical and chemical property of CaNHX

2.2 CaNHXs蛋白的親水性/疏水性、跨膜結構與亞細胞定位

通過Signal P4.1 Server對辣椒CaNHXs基因家族成員所含有的信號肽預測分析發(fā)現，7個NHX蛋白中CaNHX1～CaNHX4、CaNHX6和CaNHX7均不具有信號肽，因此，這6個蛋白都不屬于分泌蛋白類型，而CaNHX5則相反，在17～18號氨基酸有信號肽屬于分泌蛋白類型。

利用ProtScal軟件對CaNHXs基因家族成員進行親水性/疏水性的預測，結果表明，7個NHX蛋白多肽鏈不同位置(CaNHX1為374和65位，CaNHX2為529和35位，CaNHX3為465和26位，CaNHX4為450和32位，CaNHX5為149和120位，CaNHX6為636和779位，CaNHX7為339和56位)出現親水性(精氨酸(Arg))和疏水性(異亮氨酸(Ile))最強的氨基酸都相同且分值大小相近，7個NHX蛋白的平均親疏水性值預測結果分別是，CaNHX1為0.572，CaNHX2為0.543，CaNHX3為0.512，CaNHX4為0.468，CaNHX5為0.708，CaNHX6為0.356，CaNHX7為0.259。說明NHX整條多肽鏈表現為疏水性，故推測CaNHXs蛋白為疏水性蛋白。

通過TMHMM對辣椒NHX蛋白進行跨膜結構預測分析得到CaNHXs基因家族成員有明顯的跨膜結構，均屬于跨膜蛋白。

對CaNHXs基因亞細胞定位預測表明(表3)，CaNHXs基因家族成員在細胞膜(除CaNHX5)、內質網和液泡中均有不同程度的表達；在線粒體中表達的有CaNHX1、CaNHX2、CaNHX4；在細胞核中只有CaNHX3有表達。

表3 辣椒NHX基因的亞細胞定位Tab.3 Subcellular location prediction of NHX genes in pepper

2.3 CaNHXs基因家族保守結構域分析

通過MEME軟件對辣椒NHX基因成員結構域預測，共得到10個結構域，都包含有Na+/H+exchange保守結構域，其中CaNHX5中只含有Motif5，CaNHX6中只含有Motif9，CaNHX7中只含有Motif6和Motif9存在，其他4個基因的保守結構域均相似，具有9個Motif的存在，N端主要是Motif7，該氨基酸保守域結構含有CXC24XC的鋅指結構，C端主要是Motif6，該氨基酸保守域結構含有Trp(W)-24和TrKA-N，在序列中高度保守(圖1)。對每個結構域進行分析發(fā)現(圖2)，Motif1、Motif2、Motif3、Motif4、Motif7、Motif9均含有50個保守氨基酸，Motif5含有49個保守氨基酸，Motif6含有41個保守氨基酸，Motif8含有40個保守氨基酸，Motif10含有的保守氨基酸較少有23個。

2.4 CaNHXs基因家族基因結構分析

CaNHXs基因家族的結構框架通過FGENESH-C分析表明(圖3)，CaNHXs基因家族成員均含有上下游完整基因框架序列。CaNHXs基因家族成員不僅在基因長度上存在差異，而且在內含子和外顯子數量上也差異明顯，但其基因結構相似。CaNHX1～CaNHX4基因中均含有14個外顯子和13個內含子，CaNHX5、CaNHX6和CaNHX7基因分別含有7，19和21個外顯子以及6，18，20個內含子。

2.5 CaNHXs蛋白二級結構對比分析

對辣椒NHX蛋白二級結構通過Prabi在線結果表明(表4)，7個NHX蛋白質二級結構完整，主要以不規(guī)則卷曲 (Random coil)和α-螺旋 (Alpha helix)為主。

表4 CaNHXs蛋白二級結構對比分析Tab.4 The secondary structure of CaNHXs protein sequence %

2.6 CaNHXs基因順式作用元件分析

使用PlantCare軟件對辣椒NHX基因啟動子序列的相關順式調控元件進行分析發(fā)現(表5)，7條NHX具有的作用元件大致分為植物激素應答元件，如茉莉酸應答元件(TGACG)等。植物生長發(fā)育相關順式作用元件，如植物分生組織表達應答元件(CAT-box)等。生物和非生物脅迫響應順式作用元件，如冷脅迫應答元件(LTR)、光響應元件(G-box)、鹽脅迫應答元件(DRE)等。結果表明，CaNHXs在植株細胞分裂、激素信號響應以及在逆境生長中有調節(jié)作用。

2.7 CaNHXs蛋白序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析

為分析CaNHXs基因家族的進化，以擬南芥、番茄、胡楊、水稻NHX家族基因做參考。通過MEGA 5.0和ClustalX建立蛋白序列系統(tǒng)發(fā)育樹。結果表明(圖4)，依據親緣關系該基因家族可分為3個分支，其中AtNHX3、CaNHX4、AtNHX1、PeNHX4、AtNHX8、CaNHX5、OsNHX5、PeNHX5、CaNHX7、AtNHX7、PeNHX6為一支，CaNHX3、OsNHX4、CaNHX6、PeNHX1、SlNHX2、AtNHX5、AtNHX6、OsNHX2為一支，剩余的為一支。

2.8 CaNHXs蛋白三級結構分析

通過在線軟件phyre對CaNHXs家族蛋白進行預測發(fā)現(圖5)，除CaNHX1～CaNHX4的蛋白三級結構高度保持一致，剩余CaNHX5、CaNHX6 和CaNHX7的蛋白三級結構各不相同。CaNHXs家族蛋白三級結構的不同是由于其基因結構中內含子/外顯子之間數目和分配位置大小差距過大，進而致使各個基因組和編碼氨基酸數目上存在較大的差異水平；其次所編碼的蛋白二級結構中α-螺旋、β-轉角、延伸鏈、不規(guī)則卷曲的不同導致空間折疊的不同。

表5 CaNHXs家族成員啟動子序列順式作用元件分析Tab.5 Analysis of cis-acting elements of promoter sequence of CaNHXs family members

2.9 CaNHXs基因家族的表達分析

通過定量分析了CaNHXs家族基因在非生物脅迫差異處理下的表達情況(圖6)，包括鹽脅迫 (200 μmol/L)、茉莉酸甲酯 (200 μmol/L)、赤霉素(100 μmol/L)和滲透脅迫(PEG 5%濃度甘露醇)。CaNHX1在GA3脅迫下，表達量下調表達在6 h時出現最小值，較0 h相比降低了28%，差異顯著；在PEG脅迫下，表達量顯著上調在6 h出現最大峰值，為0 h的1.8倍；而在JA脅迫下，表達量下調表達，茉莉酸甲酯處理完全抑制了CaNHX1在葉片中的活性，其表達量在12 h出現最小值，較0 h相比降低了93%，差異顯著；在NaCl脅迫下，表達量顯著上調表達在12 h出現最大值，為0 h的2.8倍。CaNHX2在GA3脅迫下，表達量上調表達，在12 h出現最大值，其表達量是0 h的2.3倍，差異顯著；在PEG脅迫下，其表達量在6 h出現峰值，較0 h增加了50%；在JA處理下，表達量下調，在6 h出現最小值，較0 h減少了82%，差異顯著；在NaCl脅迫下，表達量顯著上調，在12 h出現峰值，為0 h的6倍。CaNHX3在GA3脅迫下，表達量顯著上調，在12 h出現最大值，為0 h的1.8倍；在PEG脅迫下，其表達量上調表達，在6 h出現峰值，為0 h的1.5倍；在JA處理下，表達量上調表達，在12 h出現最大值，為0 h的1.8倍；在NaCl脅迫下，表達量顯著下調，在24 h出現最小值，較0 h減少了84%。CaNHX4在GA3脅迫下，表達量下調表達在12 h出現最小值，較0 h相比降低了31%；在PEG脅迫下，表達量顯著上調，在12 h出現最大峰值，為0 h的2.4倍；而在JA脅迫下，表達量顯著下調，其表達量在12 h出現最小值，較0 h相比降低了23%；在NaCl脅迫下，表達量顯著上調，在6 h出現最大值，為0 h的2.5倍。CaNHX5在GA3脅迫下，表達量顯著上調，在6 h出現最大值，為0 h的2.6倍；在PEG脅迫下，表達量下調在12 h出現最小值，較0 h減少了28%；在JA脅迫下，表達量上調，其表達量在6 h出現最大值，較0 h相比增加了52%，且差異顯著；在NaCl脅迫下，表達量上調，在6 h出現最大值，較0 h相比增加了13%。CaNHX6在GA3脅迫下，表達量上調，在6 h出現最大值，為0 h的4.5倍；在PEG脅迫下，表達量顯著上調，在12 h出現最大峰值，為0 h的13.5倍；在JA脅迫下，表達量上調，其表達量在6 h出現最大值，較0 h相比增加了37%；在NaCl脅迫下，表達量上調，在6 h出現最大值，為0 h的13.6倍。CaNHX7在GA3脅迫下，表達量下調，在12 h出現最小值，相比0 h降低了29%；在PEG脅迫下，表達量上調，在6 h出現最大峰值，為0 h的1.7倍；在JA脅迫下，表達量顯著下調，其表達量在12 h出現最小值，較0 h相比降低了16%；在NaCl脅迫下，表達量上調表達在12 h出現最大值，為0 h的2.7倍，且差異顯著。

3 結論與討論

目前，在陸地棉[40]、藜麥[41]、水稻[42]、葡萄[43]等植物中均有對NHX基因家族的研究；Li等[42]研究認為，植物NHX反轉運蛋白對于葡萄細胞的pH值、Na+和K+穩(wěn)態(tài)和鹽耐受性起到重要調節(jié)作用，同時NHX的表達在一定程度上對葡萄生長開花起到影響作用。Krishnamurthy等[44]研究發(fā)現，轉基因AoNHX1在擬南芥和水稻中的高表達，有利于其對土壤鹽分耐受性的增加和植株在鹽漬土壤中成活率升高。盡管已經在許多物種中進行了基因組和功能研究，但尚未描述辣椒NHX家族。與參考文獻部分不符。

通過對辣椒中NHX基因家族生物信息學功能探究發(fā)現，其蛋白理化性質中，7個辣椒NHX基因各自分布在6條染色體上，其基因大小之間差異明顯，各基因等電點變化范圍差異較大，分布在5.53～9.18。CaNHX4和CaNHX7的不穩(wěn)定系數均大于40，這2個基因編碼產物不穩(wěn)定。7個NHX蛋白中CaNHX1～CaNHX4、CaNHX6和CaNHX7均不具有信號肽，不屬于分泌蛋白類型，而CaNHX5則相反。辣椒中7個NHX蛋白疏水性較高，整條多肽鏈表現為疏水性，其N 端含有大量的疏水氨基酸這與郭強等[45]研究結果相似，且均有明顯的跨膜結構，都屬于跨膜蛋白。CaNHXs基因家族成員在細胞膜(除CaNHX5)、內質網和液泡中均有著不同程度的表達。7個NHX基因序列有較高的同源性，同時均包含Na+/H+exchange保守結構域，且在功能域上都是高度保守的，都含有上游和下游基因序列，基因結構完整。其二級結構包含內容完整。在蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育樹中屬于不同分支，可能這7個NHX在辣椒體內有著不同調控作用。順式作用元件分析說明，CaNHXs在植株細胞分裂、激素信號響應以及在逆境生長中有調節(jié)作用。分析蛋白三級結構發(fā)現，除CaNHX1～CaNHX4的蛋白三級結構高度保持一致，剩余CaNHX5、CaNHX6 和CaNHX7的蛋白三級結構由于其基因結構中內含子/外顯子之間數目和分配位置大小差距過大，進而致使各個基因組和編碼氨基酸數目上存在較大的差異水平使得三級結構各不相同。

本試驗研究表明，在NaCl處理后，CaNHX1～CaNHX7在辣椒葉片中的相對表達量均呈上調趨勢，其中CaNHX6的基因表達量最高，是0 h的13.6倍，這與王影等[46]和Ohta等[47]的研究結果基本相似，郭強等[45]研究馬藺時發(fā)現，隨著NaCl濃度從0～200 mmol/L 增加時，葉片中NHX基因表達量顯著增大，劉雪華等[48]發(fā)現，在150 mmol/L NaCl處理下，受到鹽分調節(jié)和誘導蕎麥體內NHX基因表達量顯著增加。在GA3處理后，CaNHX5和CaNHX6在辣椒葉片中表達量均呈顯著上調趨勢，在JA處理后，辣椒葉片中CaNHX1和CaNHX2以及CaNHX4和CaNHX7的表達量受到明顯抑制作用，NHX基因表達量顯著降低，其余則相反。在PEG處理下，辣椒CaNHX1～CaNHX7基因表達量在葉片中均上調表達，其中CaNHX6的基因表達量最高，是0 h的13.5倍。盧世雄等[49]研究葡萄在10% PEG脅迫時發(fā)現，葉片中NHX基因表達量顯著升高為對照的5倍。

總之，本研究所獲得的結果，可以為進一步探索辣椒CaNHX基因的功能開發(fā)以及辣椒耐鹽抗旱育種基因提供基礎。