塞來(lái)昔布對(duì)幽門螺桿菌感染的胃癌細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)的影響

王 競(jìng)，段志英，楊明月，朱秀芳，霍曉輝，范紅云

河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院消化內(nèi)科，河北 石家莊 050081

胃癌是常見的惡性腫瘤之一，其形成是一個(gè)多基因、多因素和多步驟共同作用的結(jié)果[1]。幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)是一種微需氧菌，其感染與胃癌、慢性胃炎、消化性潰瘍等疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，WHO已將H.pylori列為Ⅰ類致病因子[2]，目前H.pylori感染引起胃癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚不明確。環(huán)氧合酶(COX)是前列腺素合成的關(guān)鍵酶，在多種腫瘤細(xì)胞中COX-2呈高表達(dá)，其表達(dá)可促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn)，選擇性COX-2抑制劑塞來(lái)昔布對(duì)包括胃癌在內(nèi)的多種腫瘤生長(zhǎng)有抑制作用[5]。也有研究發(fā)現(xiàn)，塞來(lái)昔布對(duì)H.pylori感染的胃上皮細(xì)胞(GES-1)有抑制增殖和促凋亡作用[6]，但機(jī)制尚不明確。微小RNA(miRNA)是一類非編碼RNA，在細(xì)胞增殖、凋亡、分化等過程中發(fā)揮重要作用，其異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7]。有研究顯示，胃癌組織及細(xì)胞中miR-145低表達(dá)，其表達(dá)與胃癌進(jìn)展有關(guān)[8]。塞來(lái)昔布可通過miR-145/TGFBR2/Smad3分子軸抑制膀胱癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[9]。塞來(lái)昔布是否可調(diào)節(jié)miR-145影響H.pylori感染的胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)尚不明確。有研究顯示，H.pylori感染可增加胃黏膜IL-6、IL-8、IL-1等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，改變胃的生理環(huán)境[10-11]。因此，本研究旨在探討塞來(lái)昔布對(duì)H.pylori感染的胃癌細(xì)胞增殖、凋亡及炎癥因子IL-6和IL-8表達(dá)的影響，并進(jìn)一步研究對(duì)miR-145的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器RPMI 1640培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；MTT、DMSO及塞來(lái)昔布均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡試劑盒均購(gòu)自中國(guó)碧云天公司；PCNA、Bcl-2、Bax和p-AKT3抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；Trizol試劑盒及Lipofectamine 2000試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；qRT-PCR儀、酶標(biāo)儀均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 菌株與細(xì)胞H.pylori標(biāo)準(zhǔn)菌株NCTC11637及人胃癌SGC-7901細(xì)胞均購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。凍存的H.pylori常規(guī)復(fù)蘇后，取100 μl接種于含質(zhì)量濃度為100 g/L的脫纖維羊血的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基中，置于體積分?jǐn)?shù)為5%的O2、10%的CO2、85%的N2微需氧三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種72 h后對(duì)H.pylori進(jìn)行鑒定。SGC-7901細(xì)胞使用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于體積分?jǐn)?shù)5%的CO2、37 ℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)、傳代。實(shí)驗(yàn)為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。

1.3H.pylori與SGC-7901細(xì)胞共培養(yǎng)以2.5×105個(gè)/孔接種生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的SGC-7901細(xì)胞于6孔板，細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)液(不含抗生素)。收集培養(yǎng)72 h的H.pylori，使用PBS稀釋制備為細(xì)胞懸液，紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值(OD值)，以1OD660 nm為1×108CFU/ml，按照1∶100比例加入細(xì)胞和細(xì)菌，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖取生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的SGC-7901細(xì)胞，胰酶消化，計(jì)數(shù)，并以5×104個(gè)/ml密度接種96孔板，細(xì)胞完全貼壁后，棄掉孔內(nèi)液體，按照100 μl/孔加H.pylori菌液。培養(yǎng)2 h后，按照100 μl/孔加終濃度為50、75、100 μmol/L的塞來(lái)昔布，每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)孔，設(shè)置不加藥的為對(duì)照組(共培養(yǎng)組)。繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h，每孔中加入20 μl的MTT(5 mg/ml)，避光培養(yǎng)4 h，再每孔加入150 μl的DMSO，混勻。酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)為490 nm的OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901細(xì)胞于6孔板，待細(xì)胞貼壁后加入終濃度為20、40、80 μmol/L的塞來(lái)昔布，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組(即共培養(yǎng)組)。培養(yǎng)48 h后，胰酶消化細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/ml。預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞，結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，離心，棄上清，重復(fù)洗滌步驟2次。加入Annexin V-FITC和PI各5 μl，室溫條件避光反應(yīng)15～20 min。上機(jī)前再加入300 μl結(jié)合緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Western blotting檢測(cè)PCNA、Bcl-2、Bax和p-AKT3蛋白表達(dá)收集塞來(lái)昔布處理48 h細(xì)胞，加適量RIPA裂解液，反應(yīng)30 min后，離心，收集上清。BCA法定量蛋白。每孔等量蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，濕轉(zhuǎn)PVDF膜，然后將膜置于質(zhì)量濃度為50 g/L的脫脂奶粉中封閉2 h。加PCNA、Bcl-2、Bax和AKT3抗體，4 ℃孵育過夜，洗膜。加HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，洗膜。ECL顯色，顯影，定量，Quantity One軟件分析各抗體條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 qRT-PCR檢測(cè)IL-6、IL-8和miR-145表達(dá)收集塞來(lái)昔布處理48 h細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞總RNA。取2 μl RNA，加入98 μl DEPC水，NanoDrop檢測(cè)RNA樣品在260 nm及280 nm處的OD值。將OD260/OD280為1.8～2.0的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，按照熒光定量試劑盒說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以所得的Ct值，采用2-△△Ct法計(jì)算。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。所有引物由海吉瑪生物制藥公司合成，序列如下：IL-6 F:5′-ATGAGGAGACTTGCCTGGTGAA-3′，R:5′-CAATCTGAGGTGCCCATGCTAC-3′；IL-8 F:5′-CTCTGTTGGCAGCCTTCCTGATTTC-3′，R:5′-AACTTCTCCACAACCCTCTG-3′；GAPDH F:5′-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3′，R:5′-AG-TCCTTCCACGATACCAAAGT-3′；miR-145 F:5′-GGTCCAGTTTTCCCAGG-3′，R:5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；U6 F:5′-CGCAAGGATGACACG-3′，R:5′-GAGCAGGCTGGAGAA-3′。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)靶基因預(yù)測(cè)軟件顯示miR-145與AKT3存在連續(xù)的結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建含有結(jié)合位點(diǎn)的AKT3的野生型(WT)及突變型(MUT)3′UTR報(bào)告質(zhì)粒。接種SGC-7901細(xì)胞(5×104個(gè)/孔)于24孔板，細(xì)胞達(dá)80%融合時(shí)可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將質(zhì)粒與miR-145 mimics和miR-NC參照Lipofectamine 2000試劑盒說明共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h，參照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明檢測(cè)各組細(xì)胞熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 塞來(lái)昔布對(duì)H.pylori感染的SGC-7901細(xì)胞增殖和凋亡的影響MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度塞來(lái)昔布處理SGC-7901細(xì)胞24～72 h，細(xì)胞增殖受到抑制，且呈劑量、時(shí)間依賴性。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度塞來(lái)昔布處理SGC-7901細(xì)胞48 h，隨著塞來(lái)昔布濃度增加，細(xì)胞凋亡率升高，呈濃度依賴性(見圖1、表1)。

圖1 塞來(lái)昔布對(duì)H.pylori感染的SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響Fig 1 The effect of Celecoxib on the apoptosis of SGC-7901 cells infected with H.pylori

表1 塞來(lái)昔布作用于H.pylori感染的SGC-7901細(xì)胞不同時(shí)間OD值及凋亡率Tab 1 The OD value and apoptosis rate of Celecoxib acted on H.pylori-infected SGC-7901 cells at different time

2.2 塞來(lái)昔布對(duì)H.pylori感染的SGC-7901細(xì)胞PCNA、Bcl-2和Bax表達(dá)的影響Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度塞來(lái)昔布均可明顯抑制PCNA和Bcl-2表達(dá)，增強(qiáng)Bax表達(dá)，且隨著塞來(lái)昔布濃度增加，對(duì)PCNA和Bcl-2表達(dá)抑制及Bax表達(dá)增強(qiáng)作用更明顯(P<0.05)(見圖2、表2)。

表2 各組細(xì)胞PCNA、Bcl-2和Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量Tab 2 The relative expression of PCNA,Bcl-2 and Bax protein in each group of cells

圖2 塞來(lái)昔布對(duì)H.pylori感染的SGC-7901細(xì)胞PCNA、Bcl-2和Bax表達(dá)的影響Fig 2 The effect of Celecoxib on the expression of PCNA,Bcl-2 and Bax in SGC-7901 cells infected with H.pylori

2.3 塞來(lái)昔布對(duì)H.pylori感染的SGC-7901細(xì)胞IL-6和IL-8的影響采用qRT-PCR檢測(cè)不同濃度塞來(lái)昔布對(duì)炎癥因子IL-6和IL-8表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，隨著塞來(lái)昔布濃度增加，IL-6和IL-8表達(dá)水平降低，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且呈濃度依賴性(P<0.05)(見表3)。

表3 各組細(xì)胞IL-6和IL-8 mRNA相對(duì)表達(dá)量Tab 3 The relative expression of IL-6 and IL-8 mRNA in each group of cells

2.4 塞來(lái)昔布對(duì)H.pylori感染的SGC-7901細(xì)胞miR-145表達(dá)的影響qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，塞來(lái)昔布濃度越高，miR-145表達(dá)水平越高，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且呈濃度依賴性(P<0.05)(見表4)。

表4 塞來(lái)昔布對(duì)H.pylori感染的SGC-7901細(xì)胞miR-145和p-AKT3表達(dá)的影響Tab 4 The effect of Celecoxib on the expression of miR-145 and p-AKT3 in SGC-7901 cells infected with H.pylori

2.5 塞來(lái)昔布可調(diào)節(jié)miR-145靶基因AKT3表達(dá)靶基因預(yù)測(cè)軟件顯示，miR-145的5′UTR與AKT3 3′UTR存在連續(xù)結(jié)合位點(diǎn)(見圖3A)。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-145 mimics可明顯降低野生型AKT3質(zhì)粒熒光素酶活性(P<0.05)，而對(duì)突變型AKT3質(zhì)粒熒光素酶活性無(wú)明顯影響(P>0.05)(見表5)。提示miR-145和AKT3存在靶向關(guān)系。Western blotting結(jié)果顯示，隨著塞來(lái)昔布濃度增加，p-AKT3表達(dá)降低，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖3B、表5)。

圖3 miR-145和AKT3的結(jié)合位點(diǎn)及塞來(lái)昔布對(duì)p-AKT3表達(dá)的影響Fig 3 The binding site of miR-145 and AKT3 and the effect of Celecoxib on the expression of p-AKT3

表5 AKT3 WT/MUT與miR-145 mimics共轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞后的熒光素酶活性Tab 5 Luciferase activity of SGC-7901 cells co-transfected with AKT3 WT/MUT and miR-145 mimics

3 討論

胃癌的發(fā)生發(fā)展與宿主遺傳、環(huán)境、H.pylori等多種因素有關(guān)，H.pylori是目前所知可在人體胃中生存的唯一微生物。H.pylori是胃癌及癌前病變的始動(dòng)因素，H.pylori的根除可延緩癌前病變進(jìn)展，降低胃癌發(fā)病率[12]。COX-2是一種誘導(dǎo)型限速酶，有研究顯示，H.pylori感染可引起胃癌COX-2表達(dá)升高[13]。在正常情況下，COX-2在多數(shù)組織低表達(dá)或不表達(dá)，在受到紫外線照射、腫瘤誘導(dǎo)劑、各種細(xì)胞因子等的刺激后，可出現(xiàn)異常表達(dá)。塞來(lái)昔布是第一個(gè)特異性COX-2抑制劑，可在體內(nèi)體外抑制腫瘤生長(zhǎng)[14]。以往研究已證實(shí)，H.pylori感染的胃癌細(xì)胞能夠促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，此外，通過減少或增加各種miRNA的表達(dá)來(lái)改變胃癌細(xì)胞的主要過程，包括免疫應(yīng)答、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期和自噬[15]。因此，本實(shí)驗(yàn)未對(duì)H.pylori感染的胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖和凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)，以H.pylori感染的胃癌SGC-7901細(xì)胞為對(duì)照，探究塞來(lái)昔布對(duì)H.pylori感染的胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖、凋亡的影響，結(jié)果顯示，不同濃度塞來(lái)昔布均可抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

Bcl-2家族基因與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，有研究顯示，H.pylori可引起B(yǎng)cl-2家族抑凋亡基因Bcl-2表達(dá)升高，促凋亡基因Bax表達(dá)降低[16]。Bcl-2/Bax比率是啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的“分子開關(guān)”，可決定細(xì)胞凋亡程度，Bcl-2表達(dá)增多，Bax-Bax分開，形成Bcl-2-Bax異源二聚體，可抑制細(xì)胞凋亡，有研究顯示，塞來(lái)昔布可通過調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax影響胃癌細(xì)胞凋亡[17]。PCNA是一個(gè)只存在于增殖細(xì)胞中的蛋白，其表達(dá)高低可衡量細(xì)胞增殖狀態(tài)[18]。本研究結(jié)果顯示，不同濃度塞來(lái)昔布均可抑制H.pylori感染的胃癌細(xì)胞PCNA和Bcl-2表達(dá)，增強(qiáng)Bax表達(dá)。提示塞來(lái)昔布對(duì)H.pylori感染的SGC-7901細(xì)胞增殖凋亡影響與調(diào)節(jié)PCNA、Bcl-2和Bax表達(dá)有關(guān)。IL-6是一種多功能的細(xì)胞因子，IL-8是一種細(xì)胞趨化因子，在H.pylori感染引起胃黏膜損傷時(shí)，IL-6和IL-8表達(dá)升高[19-20]。本研究結(jié)果顯示，塞來(lái)昔布可明顯抑制H.pylori感染的SGC-7901細(xì)胞IL-6和IL-8表達(dá)。提示塞來(lái)昔布可降低H.pylori感染的胃癌細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，miRNA異常表達(dá)與胃癌增殖、凋亡等過程密切相關(guān)[21]。miR-145是miRNA家族成員之一，有研究顯示，在H.pylori感染的胃癌中miR-145表達(dá)降低[22]。提示miR-145可能參與H.pylori感染的胃癌發(fā)生發(fā)展。PI3K/AKT信號(hào)通路是一條重要的信號(hào)途徑，其激活是引起胃癌凋亡受阻的機(jī)制之一[23]。有研究發(fā)現(xiàn)，H.pylori可激活胃癌PI3K/AKT信號(hào)通路[24]。塞來(lái)昔布可通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)[25]。AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在組織中廣泛分布，其活化可通過調(diào)節(jié)下游分子表達(dá)，從而參與細(xì)胞增殖、腫瘤生長(zhǎng)等過程[26]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-145和AKT3存在靶向關(guān)系，且塞來(lái)昔布可抑制磷酸化的AKT3表達(dá)。提示塞來(lái)昔布對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)影響與調(diào)節(jié)miR-145表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，塞來(lái)昔布可抑制H.pylori感染的胃癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制炎癥反應(yīng)，機(jī)制可能與塞來(lái)昔布引起miR-145表達(dá)改變進(jìn)而調(diào)控其靶基因AKT3表達(dá)有關(guān)。本研究為H.pylori感染的胃癌治療研究提供了一定的理論依據(jù)。