豬圓環(huán)病毒3型微滴式數(shù)字PCR檢測方法的建立與應(yīng)用

李原野 陳世界 林華 張婧 安薇 陳瑛琪 張繼宗 朱玲

摘要：?為建立能靈敏、高效、準(zhǔn)確診斷豬圓環(huán)病毒3型（PCV3）的檢測方法，并運(yùn)用該方法研究PCV3傳播特性及組織嗜性，根據(jù)GenBank中PCV3 ORF2基因（MF631813.1）的核苷酸序列，設(shè)計合成PCV3的引物和探針，通過退火溫度以及引物、探針用量和特異性等優(yōu)化，建立了PCV3微滴式數(shù)字PCR檢測方法。試驗(yàn)結(jié)果表明建立的豬圓環(huán)病毒3型微滴式數(shù)字PCR檢測方法具有較好高的靈敏性、重復(fù)性和特異性，最低能檢測到1 μl?16.35拷貝的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，可用于豬圓環(huán)病毒3型的早期診斷。

關(guān)鍵詞：?豬;圓環(huán)病毒3型;微滴式數(shù)字PCR

中圖分類號：?S852.65+9.2??文獻(xiàn)標(biāo)識碼：?A??文章編號：?1000-4440（2021）02-0389-08

Abstract：?To establish a detection method that can diagnose porcine circovirus type 3 （PCV3） sensitively， efficiently and accurately and can be used to explore the transmission characteristics and tissue tropism of PCV3， the primers and probes of PCV3 were designed and synthesized according to the nucleotide sequence of PCV3 ORF2 gene （MF631813.1） in GenBank and the annealing temperature， primer and probe dosages and specificity of droplet digital PCR were optimized to establish droplet digital PCR detection method for PCV3. The results showed that， the established droplet digital PCR detection method for porcine circovirus type 3 with high sensitivity， reproducibility and specificity could detect a minimum of 16.35 copies/μl of plasmid standards. The method established in this study can be used for the early diagnosis of the porcine circovirus type 3.

Key words：?pig;circovirus type 3;droplet digital PCR

豬圓環(huán)病毒3型（Porcine circovirus type 3，PCV3）能夠引起繁殖障礙、皮炎腎病綜合征、心臟及全身多系統(tǒng)衰竭綜合征、淋巴組織病變以及漸行性消瘦等多種病癥[1]。目前，圓環(huán)病毒家族中的豬圓環(huán)病毒2型和豬圓環(huán)病毒3型具有致病性[2]，國內(nèi)外多地區(qū)均檢測出PCV3[3]。PCV3流行廣泛，感染后發(fā)病率高，死亡率較低，因此常常伴發(fā)其他的病毒性疾病和細(xì)菌性疾病的混合感染。最近報道，在羚羊[4]、狍子[5]和蜱中檢測出PCV3[6-7]?？傊?，PCV3可以感染豬[8]、野豬[9]、牛、小鼠、狗和蜱等動物，有宿主廣泛性特點(diǎn)，這為PCV3的跨物種傳播提供了條件。因此，野生動物可能成為PCV3的潛在宿主，并對養(yǎng)豬業(yè)造成威脅。據(jù)報道PCV1和PCV2可以感染人體細(xì)胞[10]，而PCV3是否能夠感染人體細(xì)胞需要進(jìn)一步研究。PCV3自然感染后主要攻擊豬的免疫系統(tǒng)，尚無特效藥物以及疫苗。因此，對PCV3的早期帶毒檢測是防控PCV3最有效的方式。

目前實(shí)驗(yàn)室常用的檢測方法包括熒光定量PCR、普通PCR等都存在局限性。微滴式數(shù)字PCR（Droplet digital PCR，ddPCR）是第3代PCR技術(shù)，是一種對核酸分子進(jìn)行絕對定量的方法，具有高靈敏性及準(zhǔn)確性。該方法不依賴Ct值或內(nèi)參基因，就可以確定低至單拷貝數(shù)的待檢靶分子的絕對數(shù)目[11]。該方法主要用于病原微生物分子診斷、復(fù)雜來源病原微生物的檢測和腫瘤標(biāo)志因子的檢測[12]。此方法大大增加了檢測的準(zhǔn)確性和靈敏性，有利于低病毒含量樣品的檢測以及批量早期診斷檢測。

本試驗(yàn)運(yùn)用建立的PCV3微滴式數(shù)字PCR檢測方法對豬臨床各樣品進(jìn)行檢測，從而探究該病毒的流行情況、傳播途徑、組織嗜性，以期為PCV3的檢測提供一種更精確、高效、靈敏的方法，并為該病毒早期診斷及防控提供技術(shù)支持。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?試驗(yàn)樣品?豬圓環(huán)病毒3型（PCV3）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬圓環(huán)病毒1型（PCV1）、豬偽狂犬病毒（Porcine pseudorabies virus，PRV）、豬藍(lán)耳病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV）陽性病料、E. coli DH5α由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生物技術(shù)中心提供。

1.1.2?臨床樣品的收集?238份臨床血清樣品，于2018年采自四川省綿陽市某發(fā)病豬場，該批發(fā)病豬出現(xiàn)疑似斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）癥狀，其中仔豬出現(xiàn)震顫、消瘦、皮膚黏膜蒼白等癥狀，病死后剖解發(fā)現(xiàn)呼吸系統(tǒng)病變明顯，肺部較為突出，部分死亡豬全身多處發(fā)生淋巴結(jié)水腫，收集的樣品置于-70 ℃保存。47份流產(chǎn)胎兒、39份公豬精液、62份唾液拭紙、53份皮膚樣品，為2017-2019年四川地區(qū)豬場送檢樣品。5頭死亡仔豬為2019年四川地區(qū)豬場送檢疑似PCV3感染仔豬，對其進(jìn)行解剖，無菌采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、淋巴結(jié)、腦等樣品，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3?試劑與耗材?ddPCR Supermix for Probes （no DUTP）、ddPCR Droplet Generation Oil、ddPCR Droplet Reader Oil、Droplet Generator DG8 Cartndge Droplet Gene rator、DG8 Gasket Pierceable Foil Heat Seal、核酸蛋白儀均購自美國Bio-Rad公司，DL2000 DNA marker購于北京索萊寶科技有限公司，磁珠法病毒DNA/RNA提取試劑盒（Magnetic Viral DNA/RNA Kit）、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司，Premix Ex Taq（Probe qPCR）、Prime Script RT reagent Kit、pMD19-T Simple Vector、Prime STAR Max DNA Polymerase、2×Taq PCR Master Mix等均購自寶生物工程（大連）有限公司，引物、探針購自生工生物工程（上海）股份有限公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

ddPCR微滴生成儀QX100、ddPCR讀數(shù)儀QX100、ddPCR板熱封儀PX1、PCR儀、核酸蛋白測定儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2?方法

1.2.1?引物的設(shè)計與合成?根據(jù)GenBank已公開PCV3 ORF2基因核苷酸序列（MF631813.1），遵循TaqMan復(fù)合熒光引物探針設(shè)計原則，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計一對特異性引物（PCV3-F1/PCV3-R1）和探針（PCV3-P），探針5′端標(biāo)記熒光報告基團(tuán)為FAM，3′端標(biāo)記熒光淬滅集團(tuán)BHQ。根據(jù)GenBank已公開PCV3 ORF2（ MF139082.1）全基因核苷酸序列，設(shè)計檢測上下游引物（PCV3-F2/PCV3-R2）。引物和探針均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列見表1。

1.2.2?重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備?采用特異性PCV3 ORF2檢測引物（PCV3 F2/R2）對模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95 ℃ 4 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán);72 ℃ 7 min。依據(jù)天根普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的回收、純化。將回收的產(chǎn)物連接至pMD 19-T simple Vector，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19-PCV3-ORF2。陽性克隆經(jīng)上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序分析，依據(jù)天根質(zhì)粒抽提試劑盒明書對陽性克隆菌進(jìn)行質(zhì)粒抽提，測定計算出拷貝數(shù)，以陽性質(zhì)粒作為PCV3 ddPCR的陽性標(biāo)準(zhǔn)品和后續(xù)試驗(yàn)的陽性模板。

1.2.3?核酸提取與反轉(zhuǎn)錄?采用Magen MagPure Viral Nucleic Acid KF Kits磁珠法病毒DNA/RNA提取試劑盒，從PCV3、PCV1、PCV2、PRV、PRRSV陽性病料、238份血清樣品、47份流產(chǎn)胎兒、39份公豬精液、62份唾液拭紙、53份皮膚樣品、35份疑似PCV3感染豬組織樣品中提取DNA/RNA，并移至干凈的EP管中保存。提取后的RNA使用Prime Script RTKit反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系為：5×PrimeScript Buffer 4.0 μl，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0 μl，Oligo dT Primer 1.0 μl，Random 6 mers 4.0 μl，ddH2O 4.0 μl，RNA模板6.0 μl。反應(yīng)條件為37 ℃，15 min;85 ℃，5 s，并將cDNA產(chǎn)物保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3?PCV3 ddPCR方法的建立

1.3.1?退火溫度的確立?選取1 μl 6.54×103拷貝的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pMD-PCV3進(jìn)行退火溫度優(yōu)化試驗(yàn)。擴(kuò)增體系為：ddPCRTM Supermix for Probes（no dUTP）10 μl，上、下游引物各2 μl，探針1 μl，加ddH2O至20 μl。根據(jù)ddPCRTM Supermix for Probes（no dUTP）的擴(kuò)增程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：95 ℃ 10 min;94 ℃ 30 s，Tm 52～62 ℃，40個循環(huán);98 ℃ 10 min，4 ℃ 2 min。進(jìn)行擴(kuò)增之前將PCR擴(kuò)增儀的退火溫度設(shè)定為52～62 ℃，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最終根據(jù)陰、陽微滴數(shù)的比例以及熒光信號收集情況，得到最佳退火溫度，特別注意升降溫速度不得超過2 ℃/s。

1.3.2?引物用量的確立?選取1 μl 6.54×103拷貝的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pMD-PCV3進(jìn)行引物用量優(yōu)化試驗(yàn)。總反應(yīng)體系為20.0 μl，在ddPCRTM Supermix for Probes（no dUTP）10.0 μl、模板2.0 μl、探針量1.0 μl不變的情況下，分別加入1.8 μl、1.2 μl、0.8 μl和0.4 μl的上、下游引物，剩余用ddH2O補(bǔ)全。在優(yōu)化后的反應(yīng)程序下進(jìn)行反應(yīng)，得出最佳引物量，使陰陽性微滴的熒光信號差異明顯。

1.3.3?探針用量的確立?選取1 μl 6.54×103拷貝的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pMD-PCV3進(jìn)行探針用量優(yōu)化試驗(yàn)?？偡磻?yīng)體系為20.0 μl，在ddPCRTM Supermix for Probes（no dUTP）10.0 μl、模板2.0 μl、最優(yōu)上下游引物量各1.8 μl不變的情況下，分別加入0.25 μl、0.50 μl、0.75 μl和1.00 μl的探針進(jìn)行PCR擴(kuò)增，剩余用ddH2O補(bǔ)全。確立最優(yōu)的探針量，得出擴(kuò)增效率最高、具有明顯陰陽性微滴熒光信號差值的最優(yōu)探針量。

1.3.4?特異性試驗(yàn)?分別提取PCV1、PCV2、PRV、PRRSV的核酸，以DNA或反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，運(yùn)用優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行ddPCR擴(kuò)增，驗(yàn)證本方法的特異性。

1.3.5?敏感性試驗(yàn)?將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pMD-PCV3-ORF2高濃度原液進(jìn)行10倍梯度稀釋，最終稀釋成1 μl 6.54×103～6.54×101拷貝，再從1 μl 65.4拷貝依次進(jìn)行2倍稀釋，稀釋成1 μl 32.7拷貝、16.35拷貝、8.18拷貝共6個系列，并設(shè)置陰性對照，以這6個系列的PCV3重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品梯度進(jìn)行ddPCR，得出該方法能夠檢出的最低濃度。

1.3.6?重復(fù)性試驗(yàn)?選取4個來自同一批次但濃度不同的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pMD-PCV3-ORF2，每個濃度設(shè)置3個重復(fù)，測試批內(nèi)重復(fù)性。以選出的4個濃度不同的PCV3重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，不同時間點(diǎn)做3次ddPCR，測試批間的重復(fù)性，試驗(yàn)過程中設(shè)置陰性對照，分析批內(nèi)和批間的變異系數(shù)，驗(yàn)證本方法的重復(fù)性。

1.4?臨床樣品的檢測

依據(jù)本研究所建立的ddPCR檢測方法分別對收集的238份臨床血清樣品分析本方法的有效性及符合度，對47份流產(chǎn)胎兒、39份公豬精液、62份唾液拭紙、53份皮膚樣品進(jìn)行檢測并分析探究PCV3的傳播途徑，對35份疑似PCV3感染豬組織樣品進(jìn)行檢測并探究PCV3的組織嗜性。

2?結(jié)果與分析

2.1?重組質(zhì)粒pMD-PCV3-ORF2的鑒定

以PCV3的DNA，用設(shè)計的特異性引物（PCV3 F2/R2）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得與目的片段大小一致的擴(kuò)增產(chǎn)物，約651 bp（圖1）。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收、連接轉(zhuǎn)化、陽性克隆增菌培養(yǎng)，通過PCR、酶切測序鑒定，證實(shí)成功構(gòu)建重組質(zhì)粒，命名為pMD-PCV3-ORF2。質(zhì)粒含量經(jīng)檢測計算為1 μl 6.54×1011拷貝。

2.2?PCV3 ddPCR退火溫度的優(yōu)化

在設(shè)置的8個退火溫度梯度（52.0 ℃、52.7 ℃、53.9 ℃、55.8 ℃、58.1 ℃、60.0 ℃、61.2 ℃、62.0 ℃）中，均能收集到PCV3陽性微滴。從圖2可以看出當(dāng)退火溫度在55.8 ℃ 時，PCR反應(yīng)具有較高的FAM熒光信號值以及明顯的陰陽性熒光信號差值，因此55.8 ℃ 為最佳的退火溫度。

2.3?PCV3 ddPCR引物用量的優(yōu)化

在其他反應(yīng)條件不變的情況下，對4個不同上、下游引物用量（1.8 μl、1.2 μl、0.8 μl和0.4 μl）進(jìn)行ddPCR反應(yīng)，均收集到PCV3陽性微滴。從圖3可以看出當(dāng)上、下游引物為1.8 μl時，擴(kuò)增效率最高，具有較明顯的陰陽性微滴熒光信號差值，且微滴彌散度小。

2.4?PCV3 ddPCR探針用量的優(yōu)化

在其他反應(yīng)條件不變的情況下，對4個不同探針用量（0.25 μl、0.50 μl、0.75 μl、1.00 μl）進(jìn)行ddPCR反應(yīng)，均收集到PCV3陽性微滴。從圖4可以看出探針用量為1.00 μl和0.75 μl時陰陽性微滴差值明顯，但其微滴不集中。綜合考慮后選取探針用量為0.5 μl，在該探針用量時熒光信號較高，并且陰陽性微滴差值明顯，微滴彌散度低且集中。

2.5?PCV3 ddPCR的特異性

對PCV3 ddPCR檢測方法進(jìn)行特異性驗(yàn)證，PCV1、PCV2、PRV、PRRSV均只擴(kuò)增出陰性微滴，只有PCV3擴(kuò)增出陽性微滴（圖5），說明本試驗(yàn)建立的PCV3 ddPCR檢測方法特異性較高。

2.6?PCV3 ddPCR的敏感性

對連續(xù)稀釋的6個系列質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行本方法的敏感性驗(yàn)證， PCV3 ddPCR方法能檢測出的最低樣品含量為1 μl 16.35拷貝，低于該含量的樣品無法檢測到陽性微滴（表2）。

2.7?PCV3 ddPCR的重復(fù)性

從表3可以看出組內(nèi)以及組間試驗(yàn)的變異系數(shù)都小于3%，說明所建立的PCV3微滴式數(shù)字PCR檢測方法的重復(fù)性以及穩(wěn)定性較好。

2.8?PCV3 ddPCR檢測方法的運(yùn)用

2.8.1?臨床樣品的檢測?238份臨床血清樣品的檢測結(jié)果顯示本研究所建立的ddPCR檢測方法可用于血清樣品的檢測，陽性檢出率為50%（119/238）。運(yùn)用李曉菲等[13]建立的PCV3-MGB熒光定量PCR檢測方法（qPCR）同時對238份臨床血清樣品進(jìn)行平行檢測，陽性檢出率為47.05%（112/238）（表4）。利用Kappa分析軟件對2種方法進(jìn)行Kappa分析，結(jié)果顯示Kappa系數(shù)為0.941（SE=0.065，95%置信區(qū)間），說明這2種檢測方法具有良好的符合率。血清樣品的陽性率達(dá)到半數(shù)，表明目前PCV3的傳播較普遍。

2.8.2?PCV3傳播特性的探究?從表5可以看出，47份流產(chǎn)胎兒樣品檢出29份陽性樣品，陽性率為61.7%;62份唾液拭紙樣品檢出43份陽性樣品，陽性率為69.4%;39份精液樣品檢出27份陽性樣品，陽性率為69.2%;53份皮膚樣品檢出31份陽性樣品，陽性率為58.5%。表明本研究所建立的方法可用于臨床流產(chǎn)胎兒、唾液拭紙、精液、皮膚樣品的檢測。在流產(chǎn)胎兒和精液中也被普遍檢出，表明PCV3具有垂直傳播的特性，該種特性可能成為導(dǎo)致豬繁殖障礙的因素之一;在唾液拭紙中被廣泛檢出，表明PCV3可能存在于唾液中;在皮膚中被廣泛檢出，體現(xiàn)PCV3可存活于皮膚表面，并可能通過接觸傳播。

2.8.3?PCV3組織嗜性的探究?將送檢的5頭疑似PCV3感染癥狀的死亡仔豬分別取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、頜下淋巴結(jié)、腦樣品。樣品檢測結(jié)果（表6）顯示，病毒核酸檢出率為60%，表明本研究所建立的ddPCR檢測方法具有較高的準(zhǔn)確性及靈敏性，且可直接檢測出目標(biāo)病毒的拷貝數(shù)。5頭送檢死亡仔豬均檢測出目標(biāo)病毒，其中3號、5號仔豬在各組織器官均檢測出目標(biāo)病毒，表明PCV3廣泛存在于豬的各個器官中。送檢的5頭死亡仔豬各器官檢測結(jié)果顯示，在不同內(nèi)臟器官中PCV3病毒核酸含量具有明顯的差異，病毒含量較高的組織器官為頜下淋巴結(jié)、肺臟、腦、腎臟、心臟，脾臟和肝臟病毒含量相對較低（圖6）。

3?討論

近年來，從PCV3檢測數(shù)據(jù)中可知PCV3并不只存在于發(fā)病豬，在健康豬中同樣存在[14]。Zhai等[3]在健康母豬和生豬屠宰樣本中檢出的PCV3陽性率分別為21.9%和19.14%，且認(rèn)為PCV3可能聯(lián)合豬藍(lán)耳病病毒引起更嚴(yán)重的疾病。Saraiva等發(fā)現(xiàn)健康豬的PCV3陽性檢出率比發(fā)病豬高11.9%[15]。上述研究結(jié)果表明PCV3不僅存在于發(fā)病豬中，對健康豬進(jìn)行早期診斷、帶毒檢測也尤為重要。目前，PCV3的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要包括免疫組化、基于SYBR和TaqMan的qPCR[16-17]、LAMP、ELISA。ddPCR檢測技術(shù)是第3代PCR技術(shù)，具有更保守精密的檢測系統(tǒng)，目前該技術(shù)廣泛用于病原微生物分子診斷[18]、復(fù)雜來源病原微生物檢測、腫瘤標(biāo)記因子檢測等領(lǐng)域。研究結(jié)果表明，ddPCR具有靈敏度極高、直接實(shí)現(xiàn)絕對定量、PCR反應(yīng)穩(wěn)定不受抑制劑影響等明顯優(yōu)勢[19-20]。

PCV3 ORF2基因編碼該病毒的衣殼（Cap）蛋白質(zhì)，PCV3 Cap蛋白質(zhì)是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白。本研究針對PCV3 ORF2基因的相關(guān)保守區(qū)域設(shè)計1對特異性引物和探針，建立了豬圓環(huán)病毒3型（PCV3）ddPCR檢測方法。ddPCR最低能檢測出1 μl被稀釋到16.35拷貝的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。運(yùn)用本試驗(yàn)建立的PCV3 ddPCR檢測PCV1、PCV2、PRV、PRRSV，結(jié)果均為陰性，表明該方法特異性較高，檢測結(jié)果具有可靠性。在本研究重復(fù)性試驗(yàn)中，組內(nèi)以及組間試驗(yàn)結(jié)果的變異系數(shù)均小于3%，表明本方法的重復(fù)性好，較穩(wěn)定。該方法有效減少了樣品處理各環(huán)節(jié)中的污染，降低了樣品中出現(xiàn)假陽性的風(fēng)險。ddPCR適用于早期鑒別診斷，低病毒滴度樣本檢測。

運(yùn)用建立的ddPCR檢測方法對PCV3傳播特性進(jìn)行初探，發(fā)現(xiàn)流產(chǎn)胎兒ddPCR檢測陽性率為61.7%（29/47），精液為69.2%（27/39），表明該病毒可能與繁殖障礙相關(guān)，且具有垂直傳播的特性，該病毒可能是導(dǎo)致母豬繁殖障礙的因素之一。Ku等[21]用PCR技術(shù)在公豬精液中檢測出PCV3。Kedkovid等[22]在對38份母豬初乳樣品檢測中，發(fā)現(xiàn)17份樣品呈PCV3陽性，提示母豬乳液中存在PCV3，且可能發(fā)生垂直傳播。Kwon等[23]在韓國不同地區(qū)唾液拭子樣本中也檢出PCV3。表明該病毒可能潛伏存在于唾液中，最終可能通過唾液排毒進(jìn)行水平傳播。Palinski等[24]在具有豬皮炎與腎病綜合征（Porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS）癥狀的母豬及流產(chǎn)胎兒體內(nèi)及皮膚中檢出PCV3核酸，表明PCV3可能具有皮膚接觸傳播的特性。上述結(jié)果表明PCV3在臨床上可能通過精液傳播、唾液和皮膚的接觸傳播，能突破胎盤屏障感染胎兒，感染PCV3的豬群可以通過唾液排毒感染同居豬群，具備水平傳播和垂直傳播的可能性。

呂素芳等[25]研究發(fā)現(xiàn)PCV3存在于淋巴結(jié)且含量較高。Chen等[26]在PCV3與仔豬先天性震顫研究中也發(fā)現(xiàn)該病毒在腦中的含量較高。Qi等[27]從患有呼吸系統(tǒng)疾病豬采集的病料中檢測出PCV3陽性率為26.6%。Palinski等[24]也在皮炎腎病綜合征病豬體內(nèi)檢測出高病毒滴度的PCV3。目前由于檢測方法不同，檢測的敏感性、準(zhǔn)確性也存在差異，對PCV3組織嗜性的研究結(jié)果也存在差異。運(yùn)用本試驗(yàn)建立的ddPCR方法對5頭送檢死亡仔豬各器官共35份樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，從5頭送檢死亡仔豬中均檢測到PCV3，其中有2頭死亡仔豬的不同內(nèi)臟組織中均檢測出該病毒，且具有較高的病毒載量。在頜下淋巴結(jié)病毒載量最高，推測PCV3主要入侵的組織器官可能是淋巴結(jié);其次為肺臟、腎臟、腦。該病毒在病豬體內(nèi)存在廣泛，可入侵不同組織器官，且在不同的組織器官中病毒含量存在差異，感染后可能引起各器官廣泛感染最終引起全身性病毒血癥。

目前PCV3存在普遍流行與隱性感染，極大增強(qiáng)了該病毒的防控難度，該病毒尚未被分離出且無特效藥與疫苗，因此對該病的早期診斷、帶毒檢測、流行病學(xué)研究十分重要。常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室檢測方法，耗時長、操作復(fù)雜、易污染。本研究建立的PCV3 ddPCR檢測方法，不需要制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，直接對樣品進(jìn)行絕對定量，具有較高的敏感性、特異性、便捷性，可用于PCV3的早期診斷、帶毒監(jiān)測、進(jìn)出口貿(mào)易等環(huán)節(jié)，對該病的深入研究以及防控有重大意義。

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（責(zé)任編輯：張震林）