思茅松毛蟲(chóng)關(guān)鍵齡期幼蟲(chóng)腸道可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性分析

李選文 熊忠平 張珊 黃雨云 周藝萍 聶中良 潘鴻靜 熊智

摘要：【目的】對(duì)思茅松毛蟲(chóng)（Dendrolimu kikuchii）關(guān)鍵齡期幼蟲(chóng)腸道可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性進(jìn)行研究，探索其腸道細(xì)菌資源及多樣性，為深入研究昆蟲(chóng)腸道微生物功能及思茅松毛蟲(chóng)的種群管理打下基礎(chǔ)?！痉椒ā坎捎脗鹘y(tǒng)微生物分離培養(yǎng)法對(duì)采集自云南省安寧市草鋪鎮(zhèn)林區(qū)的思茅松毛蟲(chóng)1、4和7齡幼蟲(chóng)進(jìn)行腸道細(xì)菌分離純化，對(duì)分離獲得的細(xì)菌進(jìn)行16S rDNA序列同源性分析，初步判定其分類(lèi)學(xué)地位并進(jìn)行多樣性分析?！窘Y(jié)果】從思茅松毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)腸道中共分離得到291株細(xì)菌，隸屬于15屬31種，其中1齡幼蟲(chóng)腸道98株細(xì)菌隸屬于9屬13種，4齡幼蟲(chóng)腸道102株細(xì)菌隸屬于6屬12種，7齡幼蟲(chóng)腸道91株細(xì)菌隸屬于6屬9種。在31個(gè)細(xì)菌種中，芽孢桿菌屬（Bacillus）最多，共有9個(gè)種，占總種數(shù)的29.03%，其次是腸桿菌屬（Enterobacter）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）各有4個(gè)種，分別占總種數(shù)的12.90%。13個(gè)1齡幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌種中，葡萄球菌屬、腸桿菌屬和芽孢桿菌屬的相對(duì)分離率分別為27.54%、21.43%和21.43%，高于其他菌屬的平均分離率（5.31%）;12個(gè)4齡幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌種中，芽孢桿菌屬的相對(duì)分離率為72.53%，高于其他菌屬的平均分離率（5.49%）;9個(gè)7齡幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌種中，克雷伯氏菌屬（Klebsiella）和腸桿菌屬的相對(duì)分離率分別為43.96%和18.68%，高于其他菌屬的平均分離率（9.34%）。思茅松毛蟲(chóng)1齡幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)度指數(shù)、豐富度指數(shù)和Shannon-Weiner指數(shù)均最大，分別為0.9032、2.6172和2.4310，7齡幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌的均勻度指數(shù)最大，為0.9634?！窘Y(jié)論】思茅松毛蟲(chóng)1、4和7齡幼蟲(chóng)腸道可培養(yǎng)細(xì)菌群落組成和結(jié)構(gòu)豐富，具有豐富的細(xì)菌資源。

關(guān)鍵詞： 思茅松毛蟲(chóng);幼蟲(chóng);腸道細(xì)菌;多樣性;分離;16S rDNA

中圖分類(lèi)號(hào)： S433.4;Q993.3? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）02-0527-11

Abstract：【Objective】To study the diversity of culturable bacteria in the intestines of critical instar larvae of Dendrolimu kikuchii， and to explore the resources and diversity of intestinal bacteria， so as to lay a foundation for further research on the function of insect intestinal microorganisms and population management of D. kikuchii. 【Method】Traditional methods of microorganism isolation，pure culture and identification were used to isolate and purify the intestinal bacteria from the 1st， 4th， and 7th instar larvae collected from the forest area of Caopu Town， Anning City， Yunnan Province. The 16S rDNA sequence homology analysis of the isolated bacteria was conducted to preliminarily determine their taxonomic status and conduct diversity analysis. 【Result】A total of 291 strains of bacteria were isolated from the intestines of D. kikuchii larvae， belonging to 31 species of 15 genera. Among them， 98 strains of the intestines of the 1st instar larvae belonged to 13 species of 9 genera， 102 strains of the 4th instar larvae belonged to 12 species of 6 genera， and 91 strains of the 7th instar larvae belonged to 9 species of 6 genera. Among the 31 bacterial species， Bacillus was the most， with 9 species， accounting for 29.03%， followed by Enterobacter and Staphylococcus with each 4 species， accounting for 12.90% of the total species respectively. Among the thirteen 1st instar larvae， the relative isolation rates of Staphylococcus， Enterobacteria and Bacillus were 27.54%， 21.43% and 21.43%， respectively， which were higher than the average isolation rates of other bacteria（5.31%）. Among the twelve 4th instar larvae， the relative isolation rate of Bacillus was 72.53%， higher than the average isolation rate of other genera（5.49%）. Among the nine 7th instar larvae， the relative isolation rates of Klebsiella and Enterobacteria were 43.96% and 18.68%， respectively， which were higher than the average isolation rates of other bacteria （9.34%）.The dominant index， richness index and Shannon-Weiner index of intestinal bacteria of the 1st instar larvae were the highest， which were 0.9032， 2.6172 and 2.4310， respectively. The evenness index of intestinal bacteria of the 7th instar larvae was the highest， which was 0.9634. 【Conclusion】The composition and structure of culturable bacterial communities of the 1st， 4th and 7th instar larvae in the intestines of D. kikuchii are rich， and there are abundant bacterial resources.

Key words： Dendrolimus kikuchii; larvae; intestinal bacteria; diversity; isolation; 16S rDNA

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31660029）; Major Science and Technology Proje-cts of Yunnan （202002AA1000）

0 引言

【研究意義】思茅松毛蟲(chóng)（Dendrolimu kikuchii）又名赭色松毛蟲(chóng)，鱗翅目（Lepidoptera）枯葉蛾科（Lasiocampidae）松毛蟲(chóng)屬（Dendrolimus），因最早在云南的思茅發(fā)現(xiàn)而命名（侯陶謙，1987）。該蟲(chóng)在云南思茅地區(qū)主要危害思茅松，在昆明周邊主要危害滇油杉（白林喜等，2016;聶中良等，2019）。思茅松毛蟲(chóng)是危害最嚴(yán)重的6種松毛蟲(chóng)之一，嚴(yán)重時(shí)會(huì)使大量松科植物枯萎死亡，狀如火燒，嚴(yán)重影響相關(guān)地區(qū)的生態(tài)環(huán)境和旅游業(yè)（程克華，2018）。此外，思茅松毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)體表長(zhǎng)有毒毛，人畜接觸后會(huì)引發(fā)嚴(yán)重皮炎，甚至導(dǎo)致人類(lèi)致病、致殘、致盲等（王寅威等，1999;蘇有順，2016），給當(dāng)?shù)厝藗兊纳a(chǎn)生活帶來(lái)極大不便。昆蟲(chóng)腸道微生物參與宿主的多項(xiàng)生理活動(dòng)，除可為宿主提供營(yíng)養(yǎng)、解毒，增強(qiáng)宿主免疫力等有益作用外，還可能對(duì)宿主健康造成影響，在害蟲(chóng)防治方面具有巨大潛力;宿主則為腸道細(xì)菌提供食物和定殖場(chǎng)所，二者相互依存、互利共生（張振宇等，2017;杜慧民等，2020）。隨著化學(xué)殺蟲(chóng)劑的大量使用，思茅松毛蟲(chóng)已產(chǎn)生了一定的抗藥性（鄧秀明，2002）。因此，研究思茅松毛蟲(chóng)腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的種群結(jié)構(gòu)和多樣性，有助于微生物殺蟲(chóng)劑的開(kāi)發(fā)和利用，為思茅松毛蟲(chóng)的防控打下基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來(lái)，隨著動(dòng)物腸道微生物研究的不斷深入，有關(guān)昆蟲(chóng)腸道微生物的研究也日益增多。研究表明，大多數(shù)昆蟲(chóng)腸道微生物包括細(xì)菌、真菌、古細(xì)菌和原生生物，而細(xì)菌豐度最高，約占90%以上，是其中的優(yōu)勢(shì)菌群（Philipp and Moran，2003）。在家蠶（Bombyx mori）腸道微生物中存在大量的好氧細(xì)菌，春蠶腸道優(yōu)勢(shì)菌以腸桿菌屬（Enterobacter）、微球菌屬（Micrococcus）和芽孢桿菌屬（Bacillus）細(xì)菌為主，秋蠶腸道好氧菌只有少量微球菌屬（Russo et al.，2015）;其腸道菌群結(jié)構(gòu)與其特殊的食性有關(guān)，食料改變及生長(zhǎng)受阻后腸道微生物平衡也會(huì)發(fā)生變化（相輝等，2007）。王金昌等（2017）通過(guò)Illumina HiSeq高通量測(cè)序研究了甘南尕海高寒草地4齡草原毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌群落組成，發(fā)現(xiàn)10個(gè)細(xì)菌門(mén)。王蕊蕊等（2018）采用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法研究了桉樹(shù)枝癭姬小蜂（Leptocybe invasa Fisher & La Salle）成蟲(chóng)腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性，共分離得到11株細(xì)菌，其中厚壁菌門(mén)（Firmicutes）中的芽孢桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬。張志紅等（2020）采用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法研究了云南芒市草地貪夜蛾[Spodoptera frugiperda （J.E. Smith）]5齡幼蟲(chóng)腸道可培養(yǎng)細(xì)菌，共分離得到6種細(xì)菌，變棲克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）為優(yōu)勢(shì)菌種。有關(guān)松毛蟲(chóng)腸道微生物的研究也有一些報(bào)道。張珊等（2019）采用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法研究了思茅松毛蟲(chóng)4齡幼蟲(chóng)腸道可培養(yǎng)真菌，共分離鑒定出12株真菌，其中小孢擬盤(pán)多毛孢（Pestalotiopsis microspora）產(chǎn)蛋白酶能力最強(qiáng)，產(chǎn)黃青霉菌（Penicillium chrysogenum）產(chǎn)淀粉酶能力最強(qiáng)，菌核青霉（P. sclerotiorum）產(chǎn)纖維素酶能力最強(qiáng)，青霉菌屬（Penicillium）為優(yōu)勢(shì)菌屬。江宇航等（2020a，2020b）采用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法研究了馬尾松毛蟲(chóng)（D. punctatus）幼蟲(chóng)腸道可培養(yǎng)產(chǎn)細(xì)菌素和產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）產(chǎn)細(xì)菌素活性最高，地衣芽孢桿菌（B. licheniformis）產(chǎn)蛋白酶能力最強(qiáng)。對(duì)落葉松毛蟲(chóng)（D. superans）和赤松毛蟲(chóng)（D. spectabilis）的研究多集中于生物學(xué)特性及防控方面（梁立明，2018;李和爽，2019;趙佳，2020;周俊華等，2020）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】國(guó)內(nèi)關(guān)于鱗翅目的其他昆蟲(chóng)腸道微生物多有報(bào)道，但關(guān)于思茅松毛蟲(chóng)1、4和7齡幼蟲(chóng)可培養(yǎng)細(xì)菌群落組成和多樣性尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以健康的思茅松毛蟲(chóng)1、4和7齡幼蟲(chóng)為材料，采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法及16S rDNA同源性分析對(duì)其腸道可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定，明確其腸道細(xì)菌資源及多樣性，為深入研究昆蟲(chóng)腸道微生物的功能及思茅松毛蟲(chóng)的種群管理打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

思茅松毛蟲(chóng)1、4和7齡幼蟲(chóng)采自云南省安寧市草鋪鎮(zhèn)林區(qū)（東經(jīng)102°08′～102°37′，北緯24°31′～25°06′）。在林區(qū)隨機(jī)挑選10個(gè)樣點(diǎn)，每個(gè)樣點(diǎn)每齡期分別采集15頭健康的思茅松毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)，帶回實(shí)驗(yàn)室備用。1齡幼蟲(chóng)主要特征：整體呈黑色間橘黃色和白色，體表長(zhǎng)有白色絨毛，背部有一條白色或黃色的中線(xiàn)，背中線(xiàn)兩側(cè)黑色，蟲(chóng)體兩側(cè)橘黃色間白色;頭殼橘黃色，頭部后面有一塊白色的斑點(diǎn)，蟲(chóng)體下方分布有多對(duì)足，腹足與尾足為黑色間淡黃色，蟲(chóng)體長(zhǎng)度5～10 mm（圖1-A）。4齡幼蟲(chóng)主要特征：整體呈橘黃色間白色和黑色，體表絨毛染色加深為黑色，背中線(xiàn)橙黃色，蟲(chóng)體兩側(cè)棕色間乳白色;頭殼棕色，腹足與尾足為黑色間淡黃色，蟲(chóng)體長(zhǎng)度20～35 mm（圖1-B）。7齡幼蟲(chóng)主要特征：整體呈黑色間橘黃色，絨毛顏色加深變?yōu)槌燃t色和黑色，背中線(xiàn)黑色，背中線(xiàn)兩側(cè)橘黃色間白色，蟲(chóng)體兩側(cè)黑色間橘黃色，背中線(xiàn)兩側(cè)毛束與蟲(chóng)體兩側(cè)毛束前幾對(duì)為橙紅色，后面為白色，白色毛束有1～5對(duì)不等;頭殼棕黃間黑色，腹足與尾足為黑色間淡黃色，蟲(chóng)體長(zhǎng)度60～70 mm（圖1-C）。

1. 2 分離培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）（王蕊蕊等，2018）：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水補(bǔ)充至1000 mL，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min。

1. 3 腸道細(xì)菌的分離純化

分別隨機(jī)選取100頭健康的1、4和7齡幼蟲(chóng)，在溫度22～24 ℃、濕度80%～85%條件下，每20頭幼蟲(chóng)放在一個(gè)裝有50 mL無(wú)菌水的無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)喂養(yǎng)，試驗(yàn)前40 h停止喂食，待其排空體內(nèi)食物殘?jiān)筮M(jìn)行試驗(yàn)。將思茅松毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)置于冰上3～5 min，待其昏迷;用70%酒精擦拭蟲(chóng)體表面30 s，0.25%次氯酸鈉沖泡1 min，無(wú)菌水沖洗3次;隨后將其固定于無(wú)菌蠟盤(pán)上，使用滅菌后的細(xì)尖鉗將幼蟲(chóng)腹部剖開(kāi)，取出整個(gè)腸道，并立即用0.9%無(wú)菌NaCl溶液沖洗表面2次，然后將腸道取出置于無(wú)菌離心管內(nèi)，向離心管中加入1 mL PBS緩沖液研磨成勻漿，備用。

吸取上述腸道勻漿1 mL置于9 mL PBS緩沖液中，稀釋成10-1，按照10的倍數(shù)進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)瞥?0-2、10-3、10-4和10-5懸浮液，每個(gè)濃度吸取100 mL稀釋液分別涂布于NA培養(yǎng)基中，每個(gè)梯度涂3個(gè)平板。涂板均勻后將培養(yǎng)平板倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，選擇單菌落數(shù)在30～300的培養(yǎng)皿，根據(jù)涂有腸道內(nèi)容物懸液培養(yǎng)皿上的單菌落的不同特征，挑取單菌落至新的NA培養(yǎng)基上，采用分區(qū)劃線(xiàn)法進(jìn)行純化，直至菌株形態(tài)基本一致，得到純菌株。將得到的菌種保藏于NA斜面培養(yǎng)基中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4 幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌DNA提取及PCR擴(kuò)增

將分離得到的不同腸道細(xì)菌在NA培養(yǎng)基上活化，接種至NA液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，離心;收集菌體，然后將1 mL培養(yǎng)好的細(xì)菌菌液按照Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]使用說(shuō)明提取腸道細(xì)菌基因組DNA。提取的產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將檢測(cè)合格的DNA產(chǎn)物作為16S rDNA序列擴(kuò)增模板，采用16S rDNA通用擴(kuò)增引物：27F：5'-AGAGTTTGATC CTGGCTGAG-3';1492R：5'-TACGGCTACCTTGTT ACGACTT-3'。PCR反應(yīng)體系50.0 mL：2×Tap PCR MasterMix 25.0 mL，DNA模板3.0 mL，10.0 mmol/L正、反向引物各1.0 mL，雙蒸水補(bǔ)足至50.0 mL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min，-20 ℃保存。取4.0 mL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，檢測(cè)合格的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至昆明碩擎生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1. 5 幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

測(cè)得的序列通過(guò)DNAMAN 6.0進(jìn)行矯正及拼接，將拼接好的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，選取同源性最高序列作為參照菌株序列，與獲得的細(xì)菌16S rDNA一起，運(yùn)用MEGA 7.0構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，用Bootstrap法計(jì)算1000次進(jìn)行檢測(cè)，判定其分類(lèi)學(xué)關(guān)系。

1. 6 分離率及多樣性指數(shù)

根據(jù)鑒定結(jié)果，計(jì)算思茅松毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌的相對(duì)分離率（指分離到的某種幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌株數(shù)占分離到的總菌株數(shù)的百分率，用來(lái)衡量某種幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)度）（余仲東等，2016），并分析幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性（鄭梅霞等，2019）。多樣性指數(shù)計(jì)算公式：

式中，S表示某個(gè)齡期幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌的種類(lèi)數(shù)，N表示某個(gè)齡期幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌的總量，Pi表示某個(gè)齡期幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌的相對(duì)分離率。

2 結(jié)果與分析

2. 1 思茅松毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌的分離純化結(jié)果

思茅松毛蟲(chóng)1齡幼蟲(chóng)共分離獲得98株細(xì)菌，根據(jù)菌落形態(tài)特征將98株細(xì)菌分為13個(gè)類(lèi)群，整理編號(hào)為N101～N113;4齡幼蟲(chóng)共分離獲得102株細(xì)菌，根據(jù)菌落形態(tài)特征將102株細(xì)菌分為12個(gè)類(lèi)群，整理編號(hào)為N401～N412;7齡幼蟲(chóng)共分離獲得91株細(xì)菌，根據(jù)菌落形態(tài)特征將91株細(xì)菌分為9個(gè)類(lèi)群，整理編號(hào)為N701～N709。

2. 2 思茅松毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)腸道可培養(yǎng)細(xì)菌鑒定結(jié)果

提取分離獲得的細(xì)菌DNA，經(jīng)檢測(cè)合格后測(cè)序，應(yīng)用16S rDNA基因序列鑒定，NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)在線(xiàn)比對(duì)，將所獲得的幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌16S rDNA序列在GenBank中注冊(cè)，獲得GenBank登錄號(hào)（表1），初步將分離獲得的291株細(xì)菌鑒定為15個(gè)屬，31個(gè)種，其中1齡幼蟲(chóng)腸道98株細(xì)菌隸屬于9屬13種，4齡幼蟲(chóng)腸道102株細(xì)菌隸屬于6屬12種，7齡幼蟲(chóng)腸道91株細(xì)菌隸屬于6屬9種;部分幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌菌落形態(tài)如圖2。在31個(gè)細(xì)菌種中，芽孢桿菌屬（Bacillus）最多，共有9個(gè)種，占總種數(shù)的29.03%，其次是腸桿菌屬（Enterobacter）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）各有4個(gè)種，分別占總種數(shù)的12.90%。

2. 3 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果

對(duì)思茅松毛蟲(chóng)1、4和7齡幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。1齡幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌主要聚為兩大類(lèi)，分別是厚壁菌門(mén)的葡萄球菌屬、小細(xì)菌屬（Microbacterium）、科薩克氏菌屬（Kosakonia）和芽孢桿菌屬，變形菌門(mén)的泛生菌屬（Pantoea）、腸桿菌屬、沙雷氏菌屬（Serratia）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和類(lèi)香味菌屬（Myroides）（圖3）;4齡幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌主要聚為三大類(lèi)，第一類(lèi)是厚壁菌門(mén)的葡萄球菌屬（Staphylococcus）和芽孢桿菌屬，第二類(lèi)是變形菌門(mén)的單胞菌屬（Stenotrophomonas）和假單胞菌屬，第三類(lèi)是金黃桿菌屬（Chryseobacterium）（圖4）;7齡幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌主要聚為三大類(lèi)，第一類(lèi)是變形菌門(mén)的克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、腸桿菌屬、沙雷氏菌屬和單胞菌屬，第二類(lèi)是厚壁菌門(mén)的腸球菌屬（Enteroco-ccus），第三類(lèi)是產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）（圖5）。1齡幼蟲(chóng)中N101、N112、N108和N105，7齡幼蟲(chóng)中N704和N708在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)上未與NCBI中比對(duì)的最高序列菌株聚在一起，疑似新種資源，有待進(jìn)一步探究。

2. 4 思茅松毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌生境分布分析結(jié)果

對(duì)從思茅松毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)腸道分離出的細(xì)菌數(shù)量和相對(duì)分離率進(jìn)行分析，結(jié)果表明，芽孢桿菌屬是幼蟲(chóng)腸道的優(yōu)勢(shì)菌屬（表2）。

不同齡期，思茅松毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌種存在差異。13個(gè)1齡幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌種中，葡萄球菌屬（木糖葡萄球菌、琥珀葡萄球菌和腐生葡萄球菌）、腸桿菌屬（阿氏腸桿菌和香坊腸桿菌）和芽孢桿菌屬（枯草芽孢桿菌和特基拉芽孢桿菌）的相對(duì)分離率分別為27.54%、21.43%和21.43%，高于其他菌屬的平均分離率（5.31%）。12個(gè)4齡幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌種中，芽孢桿菌屬（巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、廈門(mén)芽孢桿菌、韋氏芽孢桿菌和莫海威芽孢桿菌）的相對(duì)分離率為72.53%，遠(yuǎn)高于其他菌屬的平均分離率（5.49%）。9個(gè)7齡幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌種中克雷伯氏菌屬（產(chǎn)酸克雷伯菌、變棲克雷伯氏菌和密歇根克雷伯菌）和腸桿菌屬（香坊腸桿菌和路德維希腸桿菌）的相對(duì)分離率分別為43.96%和18.68%，高于其他菌屬的平均分離率（9.34%）。

2. 5 思茅松毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌多樣性分析結(jié)果

思茅松毛蟲(chóng)1齡幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)度指數(shù)最大，為0.9032，其次是4齡幼蟲(chóng)（0.8883），7齡幼蟲(chóng)最小（0.8745）（圖6-A）;1齡幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌的豐富度指數(shù)最大，為2.6172，其次是4齡幼蟲(chóng)（2.3784），7齡幼蟲(chóng)最?。?.7913）（圖6-B）;1齡幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌的Shannon-Weiner指數(shù)最大，為2.4310，其次是4齡幼蟲(chóng)（2.3294），7齡幼蟲(chóng)最?。?.1169）（圖6-C）;7齡幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌的均勻度指數(shù)最大，為0.9634，其次是1齡幼蟲(chóng)（0.9478），4齡幼蟲(chóng)最小（0.9374）。

3 討論

本研究對(duì)思茅松毛蟲(chóng)關(guān)鍵齡期幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌進(jìn)行了多樣性分析，結(jié)果顯示，1齡幼蟲(chóng)腸道優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為葡萄球菌屬、腸桿菌屬和芽孢桿菌屬，4齡幼蟲(chóng)腸道優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為芽孢桿菌屬，7齡幼蟲(chóng)腸道優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為克雷伯氏菌屬和腸桿菌屬。鱗翅目幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌隨著齡期的改變，其腸道優(yōu)勢(shì)菌群也會(huì)發(fā)生一定變化，究其原因是食物因素造成腸道細(xì)菌組成不同，1齡幼蟲(chóng)取食量較少，而4齡幼蟲(chóng)取食量迅速增加，7齡幼蟲(chóng)則是幼蟲(chóng)的最后一個(gè)時(shí)期，取食量最大（熊忠平等，2018）;從另一方面也暗示上述葡萄球菌屬、腸桿菌屬、芽孢桿菌屬和克雷伯氏菌屬對(duì)思茅松毛蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育、免疫和解毒等有重要作用。高珊珊（2018）對(duì)3種鱗翅目昆蟲(chóng)棉鈴蟲(chóng)、桃蛀螟和玉米螟的幼蟲(chóng)腸道可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行多樣性分析，發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)菌屬為沙雷氏菌屬、克雷伯氏菌屬和腸球菌屬;何歡（2019）以3種不同飼養(yǎng)條件的大蠟螟為研究對(duì)象，通過(guò)傳統(tǒng)分離方法及ITS rDNA、16S rRNA基因序列分析研究其腸道微生物，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬和腸球菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬;王瑩（2020）通過(guò)Illumina HiSeq高通量測(cè)序研究了東方菜粉蝶（Pieris canidia）成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)腸道微生物群落組成，發(fā)現(xiàn)腸桿菌屬的細(xì)菌豐度最高。不同種類(lèi)的昆蟲(chóng)，其腸道細(xì)菌種類(lèi)不同，昆蟲(chóng)腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的群落組成與昆蟲(chóng)的種類(lèi)、食性、生存環(huán)境等有著密切關(guān)系（楊云秋等，2018）。馬艷芳等（2012）、孫佑赫等（2012）分別對(duì)普洱市寧洱縣磨黑鎮(zhèn)4齡和7齡思茅松毛蟲(chóng)腸道細(xì)菌的研究中也發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)菌屬為短芽孢桿菌屬和腸桿菌屬，說(shuō)明不同地區(qū)的思茅松毛蟲(chóng)腸道可培養(yǎng)細(xì)菌有相似的地方，也有不同之處。究其原因可能是由于不同地區(qū)思茅松毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)取食量不同，氣候（安寧河谷性氣候、寧洱亞熱帶山地季風(fēng)氣候）、氣溫（安寧平均氣溫16～26 ℃、寧洱平均氣溫20.8 ℃）（蒙蒙，2012;李清，2015）、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件差異等外部條件影響了幼蟲(chóng)腸道的細(xì)菌種類(lèi)。

孫博通等（2017）采用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法研究了斜紋夜蛾（Spodoptera litura）4齡幼蟲(chóng)腸道可培養(yǎng)細(xì)菌，共分離鑒定出10株細(xì)菌，變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)為斜紋夜蛾腸道可培養(yǎng)細(xì)菌中的優(yōu)勢(shì)菌群，其中腸桿菌屬能降解纖維素，有助于昆蟲(chóng)的消化和營(yíng)養(yǎng)吸收。江宇航等（2020b）證明從馬尾松毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)中分離的葡萄球菌屬和芽孢桿菌屬產(chǎn)生細(xì)胞素，對(duì)病原菌有抑制作用，參與昆蟲(chóng)免疫。另外，芽孢桿菌屬也能產(chǎn)生抗生素、纖維素酶、細(xì)胞壁降解酶、蛋白酶和脂肪酶等，這有助于昆蟲(chóng)的消化和免疫作用（周艷玲等，2017）。思茅松毛蟲(chóng)1齡幼蟲(chóng)作為卵轉(zhuǎn)變?yōu)橄x(chóng)的第一個(gè)時(shí)期，其腸道菌落組成、結(jié)構(gòu)和多樣性最豐富，有助于1齡幼蟲(chóng)快速地吸取營(yíng)養(yǎng)，適應(yīng)外界環(huán)境。思茅松毛蟲(chóng)從4齡幼蟲(chóng)開(kāi)始迅速生長(zhǎng)發(fā)育，取食量迅速增加，需要吸收大量的營(yíng)養(yǎng)維持生長(zhǎng)并準(zhǔn)備越冬，其腸道細(xì)菌以芽孢桿菌屬的數(shù)量最多，這個(gè)時(shí)期也是思茅松毛蟲(chóng)防治的關(guān)鍵齡期。克雷伯氏菌屬具有較強(qiáng)的水解能力和耐藥性，能降解甘蔗渣和其他甘蔗殘余廢物從而為機(jī)體提供營(yíng)養(yǎng)，并抵御化學(xué)藥劑的侵害，參與昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)和免疫（Dantur et al.，2015;湯純等，2019;張聰?shù)龋?020）。7齡幼蟲(chóng)作為幼蟲(chóng)的最后一個(gè)時(shí)期，其取食量最大，需要吸收大量的營(yíng)養(yǎng)來(lái)維持最后轉(zhuǎn)變?yōu)槔O的過(guò)程，所以此時(shí)的腸道細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬為雷伯氏菌屬和腸桿菌屬。因此，思茅松毛蟲(chóng)1齡幼蟲(chóng)和7齡幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌群落和數(shù)量變化對(duì)于思茅松毛蟲(chóng)整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育具有承前啟后的關(guān)鍵性作用。本研究?jī)H對(duì)思茅松毛蟲(chóng)1、4和7齡幼蟲(chóng)腸道可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行了研究，一些不可培養(yǎng)或特定的細(xì)菌需要結(jié)合高通量技術(shù)（Wooley et al.，2010;Long et al.，2015）和其他特定培養(yǎng)基做進(jìn)一步研究。

昆蟲(chóng)與腸道微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中已形成了一個(gè)聯(lián)系緊密的群體，二者互利共生。探索思茅松毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)腸道微生物群落組成和結(jié)構(gòu)，有助于對(duì)思茅松毛蟲(chóng)的生物群落管理和補(bǔ)充昆蟲(chóng)微生物資源庫(kù)打下基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

思茅松毛蟲(chóng)1、4和7齡幼蟲(chóng)腸道可培養(yǎng)細(xì)菌群落組成和結(jié)構(gòu)豐富，其中1齡幼蟲(chóng)的腸道優(yōu)勢(shì)菌屬為葡萄球菌屬、腸桿菌屬和芽孢桿菌屬，4齡幼蟲(chóng)腸道優(yōu)勢(shì)菌屬為芽孢桿菌屬，7齡幼蟲(chóng)的腸道優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為克雷伯氏菌屬和腸桿菌屬。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）