河南部分地區(qū)番茄黃化曲葉病毒和番茄褪綠病毒復(fù)合侵染的分子鑒定

王東 劉帥 張燕 楊世瑋 蘇玉靜 陳紅旭 丁飛 薛東齊 賈芝琪

摘? ? 要：為調(diào)查河南省部分地區(qū)番茄病毒病危害情況，于2019年10月采集16份表現(xiàn)黃化、曲葉癥狀的番茄植株，利用分子生物學(xué)技術(shù)對其進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明：供試樣品均被TYLCV（Tomato yellow leaf curl virus）侵染，31.75%的樣品被TYLCV和ToCV（Tomato chlorosis virus）復(fù)合侵染;DNA全序列比對分析發(fā)現(xiàn)，供試樣品中分離的TYLCV河南菌株與TYLCV-Is等地區(qū)的核苷酸序列同源性均達(dá)到94%以上，其中TYLCV-HN-AY-1分離物與TYLCV-Almeria（NC004005.1）序列相似性最高，為99.5%;對供試樣品TYLCV抗病基因分子檢測發(fā)現(xiàn)，部分番茄樣品含有Ty-1、Ty-2、Ty-3/Ty-3a，表明部分TYLCV株系已突破Ty-1、Ty-2、Ty-3/Ty-3a的抗性。該結(jié)果對指導(dǎo)河南省番茄的安全生產(chǎn)具有重要意義。

關(guān)鍵詞：番茄;黃化曲葉病毒;番茄褪綠病毒;復(fù)合侵染

中圖分類號：S641.2+S436.412.1+1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-2871（2021）02-012-006

Molecular identification of Tomato yellow leaf curl virus and Tomato chlorosis virus in some areas of Henan province

WANG Dong， LIU Shuai ， ZHANG Yan， YANG Shiwei， SU Yujing， CHEN Hongxu， DING Fei， XUE Dongqi， JIA ZhiqiA

（College of Horticulture， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， Henan， China）

Abstract： In order to investigate the damage of tomato virus disease in some areas of Henan province， 16 tomato samples with symptoms of yellow leaf curl were collected in October 2019 and identified by molecular biology techniques.Results showed that the samples were all infected by TYLCV（tomato yellow leaf curl virus）， and 31.75% of the samples were infected by TYLCV and ToCV（tomato chlorosis virus）. DNA sequence alignment analysis showed that the nucleotide sequence homology between the Henan isolates and other regions reached over 94%. The sequence identity between TYLCV-HN-AY-1 and TYLCV-Almeria （NC004005.1） isolation is 99.5%. The detection of TYLCV resistance genes found that some tomato samples contained TYLCV resistance genes Ty-1， Ty-2 and Ty-3/Ty-3a， indicating that TYLCV Henan strains have broken the resistance of Ty-1， Ty-2 and Ty-3/Ty-3a. The results are of great significance to guide the safe production of tomato in Henan Province.

Key words： Tomato; Tomato yellow leaf curl virus（TYLCV）; Tomato chlorosis virus（ToCV）; Mixed infections

番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）屬于雙生病毒科（Geminiviridiae）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus）。該病毒由煙粉虱傳播，發(fā)病迅速，嚴(yán)重危害番茄生產(chǎn)，甚至導(dǎo)致番茄絕產(chǎn)[1]。番茄感病植株表現(xiàn)為植株生長發(fā)育緩慢、矮化，節(jié)間明顯變短，葉片變厚、變小，葉片邊緣至葉脈區(qū)域黃化，葉緣向上卷曲，果實(shí)坐果數(shù)量明顯減少，且易出現(xiàn)變小和畸形[2]。TYLCV首次在以色列被發(fā)現(xiàn)，然后隨著媒介煙粉虱的傳播在全球范圍內(nèi)大暴發(fā)，我國在2006年首次在上海檢測到TYLCV后，北京、河北、河南、浙江等20個(gè)省市的番茄產(chǎn)區(qū)陸續(xù)檢測到該病毒，給番茄生產(chǎn)帶來巨大影響，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1，3-5]。番茄褪綠病毒（Tomato chlorosis virus，ToCV）是由煙粉虱傳播的單鏈RNA病毒，屬于長線型病毒科（Closteroviridae）毛形病毒屬（Crinivirus），番茄感病植株主要表現(xiàn)為葉片褪綠和黃化癥狀，在番茄生產(chǎn)上常被誤認(rèn)為缺素癥，導(dǎo)致診斷和防治的延誤。番茄褪綠病毒于1998年首次在美國佛羅里達(dá)州被發(fā)現(xiàn)，之后在意大利、巴西、以色列等國也相繼被報(bào)道[6-8]。番茄褪綠病毒在2004年傳播到我國臺灣，隨后在江蘇、北京、南京、河南、河北、天津、湖南等設(shè)施番茄產(chǎn)區(qū)陸續(xù)有該病毒的報(bào)道，并且造成嚴(yán)重?fù)p失[9-11]。

TYLCV和ToCV的單獨(dú)侵染或復(fù)合侵染均能夠?qū)Ψ言斐蓢?yán)重?fù)p失，因此對病害的檢測和防治就顯得尤為必要。目前在ToCV和TYLCV的檢測方法上主要有目測法、分子生物學(xué)方法、組織印跡雜交法、血清學(xué)檢測技術(shù)等[10，12-16]。分子生物學(xué)方法通過檢測病毒核酸來檢測病毒的存在，其特異性更強(qiáng)，檢測病毒的范圍更廣，并可以進(jìn)行大批量樣本檢測。在TYLCV抗病基因挖掘方面，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的TYLCV抗病基因有Ty-1、Ty-2、Ty-3、Ty-4、Ty-5、Ty-6;在抗病品種選育方面，我國育成的一系列抗TYLCV番茄品種中大多數(shù)含有Ty-1，少數(shù)含有Ty-2或Ty-3抗病基因[16]。ToCV雖然發(fā)現(xiàn)較早，但是番茄抗ToCV的種質(zhì)資源篩選和育種進(jìn)展則相對緩慢，目前國內(nèi)外尚未有抗ToCV的番茄品種的報(bào)道。越來越多的田間觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，很多含有Ty抗病基因的番茄品種和材料表現(xiàn)感病，推測原因可能是病毒菌株發(fā)生變異，或是其他病毒的復(fù)合侵染降低了抗病基因的抗病性[17-18]。

本研究于2019年10月在河南省部分番茄產(chǎn)區(qū)收集出現(xiàn)葉脈褪綠、心葉黃化、曲葉等癥狀的番茄樣品，對其進(jìn)行了病原物分析、測序鑒定和序列分析，并分析了ToCV與TYLCV復(fù)合侵染的情況，對樣品攜帶的抗病基因進(jìn)行了分子標(biāo)記鑒定。該結(jié)果對探究番茄黃化曲葉病毒抗病基因抗病性喪失原因及指導(dǎo)河南省番茄的安全生產(chǎn)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

16份表現(xiàn)黃化、曲葉癥狀的番茄樣品于2019年10月采自河南省番茄主要產(chǎn)區(qū)，具體信息見表1。

1.2 番茄黃化曲葉病毒分子鑒定

番茄樣品總DNA提取采用CTAB法，利用TYLCV特異性引物（表2）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR體系：2X San Taq PCR Mix 12.5 ?L，上下游引物各1.5 ?L，模板DNA 1 ?L，ddH2O 8.5 ?L。PCR程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃延伸3 min，35次循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物純化回收送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3 番茄褪綠病毒分子鑒定

番茄樣品采用北京華越洋植物多糖多酚植物RNA提取試劑盒提取RNA，反轉(zhuǎn)錄采用莫納反轉(zhuǎn)錄試劑盒，反轉(zhuǎn)錄體系：RNA 1 ?L，MonScriptTM 5×RTIII AII-in-One Mix 4 ?L，MonScriptTM dsDNase 1 ?L，Nuclease-Free Water 14 ?L。反轉(zhuǎn)錄程序：37 ℃ 2 min，55 ℃15 min，85 ℃ 5 min。反轉(zhuǎn)錄完成后的cDNA于-80 ℃保存。采用ToCV特異性引物ToCV-F/R（表2）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR體系：2× San Taq PCR Mix 12.5 ?L，上下游引物各1.5 ?L，cDNA第一鏈1 ?L，ddH2O 8.5 ?L。PCR程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，57 ℃30 s，72 ℃延伸30 s，35次循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.4 TYLCV抗病基因Ty-1、Ty-2、Ty-3的PCR分子檢測

利用Ty-1、Ty-2、Ty-3抗性基因分子標(biāo)記引物（表2）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR體系：2× San Taq PCR Mix 12.5 ?L，上下游引物各1.5 ?L，模板DNA 1 ?L，ddH2O 8.5 ?L。PCR程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min，隨后94 ℃變性30 s，57.5 ℃ 30 s，72 ℃延伸45 s，35次循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%（w）的瓊脂糖凝膠檢測或7%（w）的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄TYLCV的鑒定

16份番茄樣品經(jīng)TYLCV特異引物擴(kuò)增，全部樣品均檢測出2 800 bp左右的目的條帶（表3，圖1-a），PCR產(chǎn)物測序結(jié)果證實(shí)為TYLCV病毒，感染率為100%;測序獲得的番茄TYLCV河南分離物的全長為2 781 bp。從NCBI中選取各地區(qū)TYLCV分離物，其中包括國內(nèi)分離物20個(gè)，國外分離物6個(gè)，與本次分離得到TYLCV分離物進(jìn)行比較，結(jié)果表明，該基因的核苷酸序列與TYLCV-Is（X15656.1）、TYLCV-Almeria（NC004005.1）、TYLCV- California（EF539831.1）、TYLCV-Florida-3.1 （KY971328.1）、TYLCV-JSNJ1（FN256259.1）、TYLCV-SH3（FN256258.1）、TYLCV-ZJ3（AM698117.1）、TYLCV-HBWH（MF590732.1）、TYLCV-BJ03（KT338293.1）、TYLCV-XX （JQ004048.1、MF668139.1、MF668140.1、MF668141.1）、TYLCV-AY（JQ034613.1、KX034539.1）、TYLCV-JZ（KX034541.1、KX034542.1、KX034546.1）、TYLCV-ZZ（MF590734.1）等分離物的相似性均在94%以上，其中TYLCV-Almeria（NC004005.1）分離物與TYLCV-HN-AY-1序列相似性最高，為99.5%，TYLCV-HN-XX-6與TYLCV-AY（JQ034613.1）序列相似性最低，為94.82%。

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明（圖2），所選擇的序列共分為幾大分支，其中此次分離到的TYLCV河南分離物與來自中國廣東、廣西、云南大理和以色列、泰國等國家或地區(qū)的TYLCV分離物聚在一個(gè)大分支，與TYLCV-XX（MF668139.1、MF668141.1）、TYLCV-JZ（KX034541.1、KX034542.1、KX034546.1）、TYLCV-AY（KX034539.1）、TYLCV-ZZ（MF590734.1）等分離物親緣關(guān)系相對較近，與TYLCV-California（EF539831.1）、TYLCV-JSNJ1（FN256259.1）、TYLCV-XX（JQ004048.1）分離物親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)，與TYLCV-BJ03（KT338293.1）、TYLCV-HBWH（MF590732.1）、TYLCV-SH3（FN256258.1）、TYLCV-ZJ3（AM698117.1）4個(gè)分離物的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.2 番茄ToCV的鑒定

16份番茄樣品經(jīng)ToCV特異性引物檢測并測序驗(yàn)證，有5株番茄樣品檢測出239 bp的ToCV目的條帶（表3，圖1-b），其中新鄉(xiāng)、安陽和長葛地區(qū)分別有2個(gè)、2個(gè)和1個(gè)樣品檢測到ToCV。這5株番茄樣品為TYLCV和ToCV復(fù)合侵染，復(fù)合侵染率31.75%，新鄭地區(qū)番茄樣品沒有檢測到ToCV。

2.3 番茄TYLCV抗病基因分子標(biāo)記分析

對16份番茄樣品進(jìn)行Ty-1基因檢測，發(fā)現(xiàn)所有樣品均檢測到252 bp（Ty-1，抗病條帶）和264 bp（ty-1，感病條帶）的特異性條帶（表3，圖1-c）;其中Ty-1/Ty-1純合基因型番茄樣品3份、Ty-1/ty-1雜合基因型番茄樣品7份、ty-1/ty-1感病基因型番茄樣品6份。對Ty-2基因的檢測發(fā)現(xiàn)，所有樣品均檢測到295 bp（Ty-2，抗病條帶）和619 bp（ty-2，感病條帶）的特異性條帶（表3，圖1-d）;其中Ty-2/Ty-2基因型番茄樣品2份、Ty-2/ty-2基因型番茄樣品3份、ty-2/ty-2基因型番茄樣品11份。對Ty-3基因的檢測發(fā)現(xiàn)，所有樣品均檢測到630 bp（Ty-3a，抗病條帶）、450 bp（Ty-3，抗病條帶）或320 bp（ty-3，感病條帶）的特異性條帶（表3，圖1-e）;其中Ty-3a的純合基因型番茄樣品1份、Ty-3a的雜合基因型番茄樣品6份、不含Ty-3基因的番茄樣品6份、Ty-3純合基因型番茄樣品1份、Ty-3雜合基因型番茄樣品1份、同時(shí)含有Ty-3和Ty-3a基因型番茄樣品1份。

3 討論和結(jié)論

趙黎明等[24]首次在山東發(fā)現(xiàn)TYLCV和ToCV的復(fù)合侵染，隨后吳淑華等[25]在江蘇再次發(fā)現(xiàn)TYLCV和ToCV的復(fù)合侵染。在此期間TYLCV和ToCV的復(fù)合侵染已從我國華南地區(qū)擴(kuò)散到全國各地，造成這種現(xiàn)象的原因可能與農(nóng)藝生產(chǎn)活動(dòng)相關(guān)聯(lián)[24-26]。但ToCV的侵染會不會造成寄主植株對TYLCV抗性的減弱值得進(jìn)一步研究。

本研究樣品TYLCV分離物測序結(jié)果經(jīng)NCBI比對驗(yàn)證為TYLCV。本研究結(jié)果與之前河南地區(qū)報(bào)道的TYLCV-XX（JQ004048.1、MF668139.1、MF668140.1、MF668141.1）、TYLCV-JZ（KX034541.1、KX034542.1、KX034546.1）、TYLCV-AY（JQ034613.1、KX034539.1）、TYLCV-ZZ（MF590734.1）均與TYLCV-Is（X15656.1）進(jìn)行兩兩序列比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)序列相似性均在94%以上，依據(jù)雙生病毒分類標(biāo)準(zhǔn)，同種雙生病毒基因組序列同源性大于 94% 被認(rèn)為是同一株系的不同變種，判斷這6個(gè)分離物屬于TYLCV-Is株系[27]，研究結(jié)果表明TYLCV在河南并沒有發(fā)生新的病毒菌株。

對河南16份番茄樣品Ty抗病基因的檢測發(fā)現(xiàn)，被TYLCV侵染的HN-XX-4、HN-XX-5番茄樣品中同時(shí)含有Ty-1、Ty-2、Ty-3/Ty-3a抗性基因（表3），表明TYLCV已經(jīng)突破Ty-1、Ty-2、Ty3/Ty3a的抗性。但抗病基因抗病性喪失的原因有待進(jìn)一步研究，可能的原因是隨著病毒長時(shí)間的傳播以及含有Ty-1、Ty-2、Ty3/Ty3a抗病品種的廣泛種植，而造成變異菌株的流行，但具體是哪些位點(diǎn)突變所引起的還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。本研究中含有Ty-1、Ty-2、Ty-3抗性基因的部分樣品具有感病癥狀并檢測到TYLCV，卻并未檢測到ToCV，暗示了TYLCV和ToCV的復(fù)合侵染不是抗病性降低的主要原因。田兆豐等[17]為了解不同抗病品種中番茄黃化曲葉病毒基因變異的情況，對感染 TYLCV 的番茄抗病品種進(jìn)行了TYLCV全長基因克隆和測序，未發(fā)現(xiàn)新的病毒菌株，推測是原有菌株的變異引起抗病基因的抗病性喪失，與本研究結(jié)果一致。Torre等[28]在含有Ty-1基因的番茄抗性品種上接種TYLCV病毒18 d后，將其與對照相比觀察到輕微的花葉癥狀，表明不同抗病基因型對TYLCV抗性水平不同，接種壓力、株齡、溫度和光照強(qiáng)度均可能對疾病癥狀產(chǎn)生非常重要的影響[29]。但環(huán)境因素是否會影響抗病基因的抗病性也待更進(jìn)一步的研究。

本研究為了解河南省部分番茄產(chǎn)區(qū)TYLCV和ToCV的分布、序列變異、進(jìn)化等情況提供了研究基礎(chǔ)，同時(shí)該研究結(jié)果對探究番茄黃化曲葉病毒抗病基因抗病性喪失原因以及指導(dǎo)河南省番茄品種選擇和安全生產(chǎn)都具有重要意義。

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