氨氯地平對去勢大鼠前列腺增生的影響及其機制

李卓 莫介榮 葉木石 莫妍妍 彭志宏 吳昊開 柳建軍

1廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科（廣東湛江524000）；2佛山市第一人民醫(yī)院急診科（廣東佛山528000）

良性前列腺增生（BPH）近年來已成為一個嚴(yán)重的健康問題，并影響世界范圍內(nèi)老年男性的生活質(zhì)量，且良性前列腺增生發(fā)病率有明顯上升趨勢，很多患者最終都要接受手術(shù)治療［1-2］。然而，其發(fā)病機制尚未明確。據(jù)統(tǒng)計，60 歲以上的BPH 患者中，約25%伴有高血壓［3］，其前列腺體積明顯高于非高血壓患者，另一項研究顯示BPH 與（舒張）血壓［4］呈正相關(guān)，而且高血壓可使前列腺上皮及間質(zhì)細胞增殖增加，前列腺體積及前列腺上皮細胞增殖率與高血壓持續(xù)時間顯著相關(guān)［5］，提示高血壓病和BPH 顯著相關(guān)，更說明高血壓是BPH 的一個重要因素，因此，高血壓的治療可以減輕甚至抑制BPH 的發(fā)生發(fā)展。治療高血壓的鈣離子阻滯劑在治療高血壓的同時也對BPH 的防治有相關(guān)作用，或許能增強特異性抗BPH 治療的效果。根據(jù)目前的報道，氨氯地平鈣通道阻滯劑（CCB）是世界衛(wèi)生組織/國際高血壓學(xué)會推薦的一線降壓藥之一，可用于治療不同程度的高血壓［6］。因此，本研究通過建立BPH 大鼠模型，通過多種方法探究氨氯地平對BPH的作用效果及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 試劑和藥品大鼠酸性磷酸酶和大鼠非前列腺特異性酸性磷酸酶酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自R&D（美國），Trizol RNA 分離試劑盒購自Sigma。VEGF 抗體、Bcl-2 抗體、Bax 抗體、GAPDH 抗體均購自Bioss（中國北京），SP-0023 免疫組化試劑盒購自Zymed（美國）。AR 和actin 的PCR 引物由南京建成生物工程研究所（中國南京）提供，非那雄胺購自Proscar（5 mg，lot no.）。（默克公司，285922）。

1.2 儀器本研究使用了以下工具：電子分析天平（GB2002，梅特勒-托利多全球、瑞士），冰機（AF100、蘇格蘭人、意大利），電泳儀（Liuyi，北京），microinstrument（上海手術(shù)器械廠、上海、中國），解剖顯微鏡（日本奧林巴斯）PCR 循環(huán)（美國Bio-Rad 580 bk），冷凍離心機（3 k18，σ，德國），數(shù)字彩色顯微圖像分析系統(tǒng)（7001×紫外線指數(shù)，紫外線指數(shù)，英國），輻射免疫計數(shù)器（gc-1500r，Zonkia，中國），離心機（Biofuge Fresco，Sorvall，美國），切片機（RM2125，徠卡，德國），酶標(biāo)板閱讀器（MK3，F(xiàn)innpipette）。

1.3 BPH 大鼠模型的建立42 只健康的8月齡雄性SD大鼠（動物許可證：SCXK（Jing）2012-0001），體質(zhì)量450 ～520 g，馴化1周后，隨機分為6組（n=7）：正常對照組、去雄組、模型組、非那雄胺組、低劑量氨氯地平組、高劑量氨氯地平組［7-9］。正常對照組大鼠進行假去勢，其余各組大鼠均進行去勢，7 d 后皮下注射丙酸睪酮5 mg/（kg·d）（藥物處理組）或等量大豆油（去勢對照組和模型組）。各組通過灌胃的方式給予非那雄胺、氨氯地平6 d。

1.4 前列腺指數(shù)計算閹割30 d后，大鼠稱重并麻醉，通過下腹正中切口切除前列腺。腹葉的濕重被確定，使用溢水法測量他們的體積。以前列腺濕重（mg）/大鼠體質(zhì)量（g）計算前列腺指數(shù)（PI）。

1.5 前列腺組織病理學(xué)檢查前列腺稱重脫水后，從每個前列腺中取一個腹側(cè)葉用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切成薄片。蘇木精和伊紅染色（HE）檢查組織切片有無病理改變。

1.6 免疫組織化學(xué)（包含IHC）石蠟切片在二甲苯中脫蠟，在乙醇梯度中脫水，在3%過氧化氫中孵育10 min 以抑制內(nèi)源性過氧化物酶，分別與一抗和二抗結(jié)合后，用蘇木精染色，再用中性膠密封。VEGF 染色采用Image-Pro Plus version 6.0 軟件分析。

1.7 Western blot用冷凍蛋白裂解緩沖液裂解前列腺組織，在4 ℃超聲裂解，12 000 g 離心30 min 并測定上清蛋白濃度。用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離每個樣品等量的蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。封閉后與一抗（1∶1 000稀釋）在4 ℃孵育過夜，清洗后再與二抗（1∶2 000 稀釋）在室溫孵育1 ～2 h，然后用化學(xué)發(fā)光試劑顯色。使用Image-Pro Plus 6.0軟件掃描分析。

1.8 Reverse transcription（RT）-PCR用Trizol試劑從解凍組織中提取總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。大鼠雄激素受體（AR）基因95 kb 片段的特異性引物序列如下：正向5'-CTGGCATGGAAGGCTTTGTGAAC-3'，反向5'-CAGTGGCGAGTCGTTTGTGTTAC-3'。以actin 為對照，引物序列為：正向5'-GAATTCCCAGTAAGTGCGGGTCATA-3'，反向5'-CGAGGGCCTCACTAAACCATC-3'，擴增片段105 個基點。RT-PCR 在ABI PRISM7500 序列檢測系統(tǒng)中進行，數(shù)據(jù)采用7500 軟件2.0.6 版本進行分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均通過SPSS 17.0 版本軟件（SPSS，IL，USA）采用單因素方差分析進行分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氨氯地平對大鼠PI 的影響各實驗組的PI較去勢對照組明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，非那雄胺和低劑量氨氯地平組的PI 均明顯降低（P＜0.01），結(jié)果見表1。

表1 大鼠體重、前列腺腹側(cè)葉重量、體積和前列腺指數(shù)的比較.Tab.1 Comparison of rat body weight，prostate ventrolateral lobe wet weight，volume，and PI±s

注：與控制組比較：*P ＜0.05，**P ＜0.01；與模型組比較：#P ＜0.05，##P ＜0.01

平均體重（g）前列腺腹外側(cè)葉濕重（mg）前列腺腹外側(cè)葉容積（mL）前列腺指數(shù)508.3±77.4662.5±148.00.51±0.121.32±0.24組別正常組控制組模型組非那雄胺組低劑量氨氯地平組高劑量氨氯地平組498.0±37.4 457.6±62.8 482.5±67.5 523.1±21.7 463.8±35.0 91.4±50.0 417.4±112.0 276.0±191.0 294.1±164.0 385.7±106.0 0.07±0.03 0.38±0.11**0.26±0.20 0.27±0.14*0.34±0.09 0.18±0.05 0.93±0.17**0.54±0.13**##0.57±0.14**##0.83±0.25

2.2 氨氯地平對大鼠前列腺組織病理學(xué)的影響與正常對照組（圖1B）相比，模型組大鼠前列腺腔內(nèi)可見乳頭狀增生和部分鈣化，腺體周圍未見纖維組織和平滑肌增生。低劑量氨氯地平處理大鼠上皮細胞呈立方或管狀，腺腔微增，乳頭及間質(zhì)組織減少。大劑量氨氯地平可導(dǎo)致部分氣泡乳頭狀增生，但整體外觀與正常對照組相似（圖1）。

2.3 氨氯地平對原位前列腺VEGF 表達的影響VEGF 主要表達于腺體細胞，模型組明顯高于正常組（P＜0.01）。與模型組相比，低劑量和高劑量氨氯地平均能顯著恢復(fù)前列腺VEGF 水平（P＜0.01，圖2、表2）。

圖2 氨氯地平對大鼠前列腺組織VEGF 表達的影響Fig.2 Influence of amlodipine on VEGF expression in the rat prostate tissue

表2 大鼠前列腺組織原位血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達Tab.2 Influence of amlodipine on VEGF expression in the rat prostate tissue±s

表2 大鼠前列腺組織原位血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達Tab.2 Influence of amlodipine on VEGF expression in the rat prostate tissue±s

注：與控制比較：*P ＜0.05，**P ＜0.01；與模型組比較：#P ＜0.05,##P ＜0.01

組別VEGF 的光密度（%）正常組0.16±0.05控制組2.50±0.44**模型組1.86±0.27**非那雄胺組低劑量氨氯地平組高劑量氨氯地平組0.95±0.15**#0.39±0.09**,##0.71±0.16**##

2.4 氨氯地平對大鼠前列腺組織Bcl-2/Bax比值的影響與模型組比較，低劑量氨氯地平組的Bcl-2的表達量顯著降低（P＜0.01）。另外，與去勢對照組和模型組相比，非那雄胺、低劑量氨氯地平和高劑量氨氯地平組的Bax 表達水平也顯著升高（P＜0.01）。與去勢對照組相比，模型組Bcl-2/Bax 比值明顯升高（P＜0.01），而低劑量氨氯地平組Bcl-2/Bax 比值明顯降低（P＜0.01，圖3、表3）。

表3 Bcl-2 和Bax 在各組前列腺組織中的表達量Tab.3 Bcl-2 and Bax expression in the prostate tissues of each group±s

表3 Bcl-2 和Bax 在各組前列腺組織中的表達量Tab.3 Bcl-2 and Bax expression in the prostate tissues of each group±s

注：與控制比較：*P ＜0.05，**P ＜0.01；與模型組比較：#P ＜0.05，##P ＜0.01

別Bcl-2/GAPDHBax/GAPDHBcl-2/Bax常組0.10±0.010.02±0.003.75±0.25制組0.12±0.010.03±0.003.34±0.28組正控模型組非那雄胺組低劑量氨氯地平組高劑量氨氯地平組0.17±0.01**0.21±0.02**#0.13±0.01##0.19±0.02**0.03±0.00 0.04±0.00 0.05±0.00**##0.05±0.01**#4.71±0.31**5.35±0.41**2.57±0.22##3.56±0.35

圖3 各組前列腺組織中Bcl-2、Bax 表達Fig.3 Bcl-2 and Bax expression in the prostate tissues of each group

2.5 氨氯地平對大鼠前列腺組織AR 表達的影響與去勢對照組相比，去勢后大鼠前列腺組織AR表達水平明顯降低，而在丙酸睪酮注射后所有組的前列腺組織AR表達水平均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，非那雄胺組、高劑量氨氯地平和低劑量氨氯地平組AR表達明顯降低（P＜0.01，表4）。

表4 各組前列腺組織中AR 的表達Tab.4 AR expression in the prostate tissues of each group±s

表4 各組前列腺組織中AR 的表達Tab.4 AR expression in the prostate tissues of each group±s

注：與控制比較：*P ＜0.05，**P ＜0.01；與模型組比較：#P ＜0.05，##P ＜0.01

組別控制組模型組非那雄胺組低劑量氨氯地平組高劑量氨氯地平組AR 表達量0.41±0.07 3.13±0.42**##1.00±0.24**##1.96±0.22**##1.28±0.15**##

3 討論

BPH 是一種由性激素失衡、生長因子以及前列腺間質(zhì)細胞與上皮細胞［10］相互作用引起的多因子變性疾病。去勢后前列腺迅速萎縮，雄激素誘導(dǎo)增生，提示前列腺形態(tài)和功能的維持依賴于雄激素［11］。本研究結(jié)果表明，低劑量氨氯地平可明顯改善前列腺形態(tài)和功能。有研究報道［12］，不同劑量氨氯地平對睪酮誘導(dǎo)的BPH 雄性大鼠模型下尿路障礙有顯著改善作用，細胞外鈣離子通過二氫吡啶敏感的鈣通道進入細胞，進而動員細胞內(nèi)鈣離子以激活逼尿肌。在人逼尿肌中，細胞外鈣離子也在激活過程中起主要作用，而L 型鈣通道拮抗劑對人逼尿肌有較強的抑制作用。因此，氨氯地平可能通過上述途徑改善前列腺增生。

目前，前列腺增生發(fā)生發(fā)展的機制仍未明確，現(xiàn)有的研究認(rèn)為其發(fā)生發(fā)展與性激素及其受體、細胞因子、炎癥、細胞自噬、細胞增殖、細胞凋亡等相關(guān)［13-14］。本研究發(fā)現(xiàn)氨氯地平可以降低BPH 模型大鼠前列腺組織Bcl-2/Bax 比值，從而抑制前列腺增生，誘導(dǎo)細胞凋亡。此外，Bcl-2/Bax 比值與未去勢大鼠的差異表明，前列腺細胞在AR 作用下可能發(fā)生增殖和凋亡，BPH 通常是前列腺上皮細胞和間質(zhì)細胞［15］增殖增加和凋亡減少的結(jié)果。細胞凋亡減少和Bcl-2 的高表達參與BPH 形成過程［16］。在正常細胞中，Bcl-2 在刺激后和發(fā)育過程中維持著增殖和凋亡的平衡。在成熟組織和腫瘤細胞中也有表達，在凋亡細胞中低表達或檢測不到［17］。Bax 和Bcl-2 具有高度的同源性，彼此形成同源二聚體/異源二聚體，從而形成調(diào)節(jié)［18］細胞凋亡的線粒體膜通道。增生前列腺Bcl-2 表達隨Bax 表達增加而下調(diào)，Bcl-2/Bax 比值降低可誘導(dǎo)細胞凋亡，進而抑制前列腺增生［19-20］。本研究發(fā)現(xiàn)氨氯地平也降低了前列腺中VEGF 的表達，表明其對前列腺增生后前列腺組織有保護作用。VEGF 是刺激前列腺內(nèi)皮細胞和前列腺上皮細胞的最有效的有絲分裂因子之一［21］。之前的研究報道，6SL 可通過抑制VEGFR-2 的激活和隨后的血管生成，在體外和體內(nèi)對BPH 模型有改善作［22］。氨氯地平是一種L型鈣通道阻滯劑（L-CCB），研究表明L-CCBs 可抑制逼尿肌收縮，改善膀胱血氧供應(yīng)［23-25］。結(jié)果表明氨氯地平具有調(diào)節(jié)高血壓和抑制前列腺增生的作用。此外，氨氯地平單獨或聯(lián)合特拉唑嗪治療BPH 誘導(dǎo)的［26］大鼠下尿路功能障礙均有改善。因此，通過以上的研究，有理由認(rèn)為氨氯地平通過下調(diào)VEGF、AR、Bcl-2 和Bcl-2/Bax 比值誘導(dǎo)細胞凋亡來抑制前列腺增生。