橡膠樹(shù)HbDHAR2基因克隆及表達(dá)分析

李雙江，馮成天，胡義鈺，袁 坤，劉進(jìn)平，王真輝，劉 輝

(1.海南大學(xué) 熱帶作物學(xué)院，海南 海口 570228；2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 橡膠研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部橡膠樹(shù)生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地-海南省熱帶作物栽培生理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571101)

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferase，GST)是一類由超基因家族編碼的多功能酶，在動(dòng)植物和微生物中廣泛存在[1-3]。其通過(guò)催化還原型谷胱甘肽與內(nèi)源和外來(lái)的各種有害物質(zhì)共價(jià)結(jié)合，形成復(fù)合物，隔離在液泡或轉(zhuǎn)移到質(zhì)外體，從而將其降解排出，降低其對(duì)細(xì)胞的損害[1，3-4]。植物GSTs可分為14類：Phi (GSTF)、Tau (GSTU)、DHAR (Dehydroascorbate reductase，脫氫抗壞血酸還原酶，EC 1.8.5.1)、EF1Bγ (Elongationfactor1Bγ)、GHR (Glutathionyl hydroquinone reductase)、Hemerythrin (GSTH)、Iota (GSTI)、Lambda (GSTL)、Theta (GSTT)、Zeta (GSTZ)、mPGES-2 (Microsomal prostaglandin E synthasetype 2)、TCHQD (Tetrachloro hydroquinone dehalogenase)、Ure2p和Metaxin[5]。其中，Phi、Tau、DHAR和Lambda類是植物所特有的[6]。DHAR是抗壞血酸(Ascorbic acid，AsA)-谷胱甘肽循環(huán)中的關(guān)鍵酶之一。植物DHAR具有2個(gè)典型的結(jié)構(gòu)域：相對(duì)保守的GST N-端結(jié)構(gòu)域和變化的GST C-端DHAR結(jié)構(gòu)域，其中N-端結(jié)構(gòu)域是由α螺旋和β折疊組成的類硫氧還原蛋白結(jié)構(gòu)域，C-端DHAR結(jié)構(gòu)域主要由多個(gè)α螺旋組成[5，7]。此外，在其N-端結(jié)構(gòu)域中含有一個(gè)保守的催化模體CPFS/C[8]。DHAR N-端結(jié)構(gòu)域具有谷胱甘肽特異結(jié)合位點(diǎn)，能以谷胱甘肽為還原性底物，催化脫氫抗壞血酸還原成AsA。DHAR能促進(jìn)AsA再生，對(duì)維持植物細(xì)胞內(nèi)AsA的動(dòng)態(tài)平衡具有重要意義[9-10]。

1952年，Yamaguchi和Joslyn[11]首次從豌豆中分離純化出DHAR。此后，陸續(xù)從許多植物中克隆鑒定了DHAR基因，如擬南芥[12]、水稻[13]、玉米[14]和茶樹(shù)[15]等。研究表明，DHAR除調(diào)控植物體內(nèi)AsA動(dòng)態(tài)平衡外，還調(diào)控著植物的活性氧水平、氣孔開(kāi)閉、光合作用和生長(zhǎng)發(fā)育[16-19]。此外，越來(lái)越多的研究證實(shí)，DHAR基因在植物非生物脅迫抗性中發(fā)揮重要作用[10，20]。Ushimaru等[21]將水稻OsDHAR1轉(zhuǎn)入擬南芥發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因株系的發(fā)芽率和生長(zhǎng)情況顯著優(yōu)于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨蜏孛{迫下轉(zhuǎn)基因株系與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ毡硇筒o(wú)明顯差異，表明超量表達(dá)OsDHAR1能顯著提高轉(zhuǎn)基因植株對(duì)鹽脅迫的抗性，卻未能提高抗寒性。但Le Martret等[22]的研究表明，在煙草中超量表達(dá)OsDHAR1同時(shí)提高了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)低溫和鹽脅迫的抗性。此外，在擬南芥中超量表達(dá)油菜BrDHAR基因也顯著提高了轉(zhuǎn)基因植株的抗寒性[23]。Eltayeb等[24]將擬南芥AtDHAR1基因轉(zhuǎn)入煙草，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)臭氧、干旱、高鹽等非生物脅迫的抗性顯著提高。張珊[25]從小麥中克隆了DHAR基因，并在小麥中超量表達(dá)該基因，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的DHAR酶活性較非轉(zhuǎn)基因植株顯著增加，同時(shí)提高了小麥對(duì)干旱和氧化脅迫的抗性。

橡膠樹(shù)(Heveabrasiliensis)作為主要的熱帶經(jīng)濟(jì)作物，是重要工業(yè)原料和戰(zhàn)略物資天然橡膠的主要來(lái)源。我國(guó)主要在海南、云南和廣東種植橡膠樹(shù)。這些地區(qū)地處熱帶北緣，屬于非傳統(tǒng)植膠區(qū)，低溫、干旱、臺(tái)風(fēng)等非生物脅迫嚴(yán)重制約著天然橡膠產(chǎn)業(yè)發(fā)展。分離鑒定抗逆基因是橡膠樹(shù)非生物脅迫抗性遺傳改良的基礎(chǔ)。DHAR基因在植物非生物脅迫抗性中起著重要作用，但迄今為止并未見(jiàn)有關(guān)橡膠樹(shù)DHAR基因的研究報(bào)道。本研究克隆了橡膠樹(shù)HbDHAR2基因，進(jìn)行了生物信息學(xué)和表達(dá)模式分析，以期為進(jìn)一步探究該基因在橡膠樹(shù)非生物脅迫應(yīng)答中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 植物材料與處理

本研究所用的成熟葉、衰老葉、嫩梢、雌花、雄花、膠乳和樹(shù)皮組織樣品采自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)六隊(duì)的橡膠樹(shù)品種熱研7-33-97，植株2003年種植，2011年開(kāi)始割膠。根組織樣品采自熱研7-33-97組培苗，植株已移栽培養(yǎng)8個(gè)月。樣品采集時(shí)，將3株植株的組織樣品等量混合作為1次生物學(xué)重復(fù)，每組織樣品采集3次生物學(xué)重復(fù)。

選取移栽培養(yǎng)8個(gè)月的熱研7-33-97組培苗健康植株，進(jìn)行甲基紫精(MV)、過(guò)氧化氫(H2O2)、乙烯利(ETH)、水楊酸(SA)、脫落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、低溫、干旱和高鹽處理。其中，MV、ABA和MeJA處理濃度均為200 μmol/L，SA處理濃度為5 mmol/L，ETH處理濃度為10 mmol/L，H2O2處理濃度為20 mmol/L。處理時(shí)，將溶液均勻噴灑于植株所有葉片正反面。同時(shí)，以噴灑清水的植株作為對(duì)照組。低溫、PEG (Polyethylene glycol)誘導(dǎo)的干旱及NaCl誘導(dǎo)的鹽脅迫處理參照劉輝等[26-27]的方法。4 ℃低溫處理在人工氣候箱中進(jìn)行，處理時(shí)光照時(shí)間為16 h，強(qiáng)度為600 μmol/(m2·s)。PEG6000處理的濃度為20%，NaCl處理的濃度為400 mmol/L，處理時(shí)將植株從育苗袋中取出，洗凈栽培基質(zhì)，根部浸沒(méi)于PEG6000或NaCl 溶液中。在處理0，3，6，12，24，48 h時(shí)采集植株第2，3片葉，每處理時(shí)間點(diǎn)設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，每重復(fù)取自3株植株。樣品采集后液氮凍存，用于RNA提取。

1.2 總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及目標(biāo)基因克隆

采用北京百泰克生物技術(shù)有限公司的通用植物總RNA提取試劑盒提取葉、嫩梢、雌花、雄花、樹(shù)皮和根等組織樣品總RNA，采用天根生化科技有限公司的多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒提取膠乳總RNA，具體提取方法參照試劑盒說(shuō)明書。采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) (TaKaRa)去除質(zhì)量檢測(cè)合格RNA樣品中的基因組DNA，并反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。具體實(shí)施方法參照試劑盒說(shuō)明書。

通過(guò)對(duì)橡膠樹(shù)樹(shù)皮轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的注釋分析，發(fā)現(xiàn)一DHAR基因scaffold0276_83160，以此序列為探針在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast，獲得該基因的全長(zhǎng)序列，GenBank登錄號(hào)為XM_021823366.1。利用在線程序Primer 3 (http：//primer3.ut.ee/)設(shè)計(jì)擴(kuò)增該基因完整ORF (Open reading frame，開(kāi)放閱讀框)的引物，正向和反向引物序列分別為5′-TTCCGCTAACCAAGATCACA-3′和5′-TGACAACCACTGGCATACATC-3′。PCR 擴(kuò)增目標(biāo)基因，使用的模板為葉片cDNA，PCR反應(yīng)體系如下：5 μL 5×TransStart?FastPfu Buffer，0.5 μL TransStart?FastPfu DNA Polymerase (2.5 U/μL)，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，正、反向引物各0.5 μL(10 μmol/L)，2 μL cDNA模板，14.5 μL 滅菌雙蒸水。PCR程序設(shè)置如下：95 ℃ 3 min；95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，并回收純化目標(biāo)片段與北京全式金生物技術(shù)有限公司的pEASY?-Blunt Simple Cloning Vector連接。連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化Trans1-T1 Phage Resistant感受態(tài)細(xì)胞，并均勻涂于含卡那霉素100 mg/L的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑選PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的單克隆送鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 生物信息學(xué)分析

利用SoftBerry (http：//linux1.softberry.com/)數(shù)據(jù)庫(kù)中的FGENESH程序預(yù)測(cè)基因ORF和編碼的氨基酸序列；使用Compute pI/Mw (http：//web.expasy.org/compute_pi/)分析HbDHAR2的分子量和等電點(diǎn)；分別采用CDD (http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)、TMHMM Server v. 2.0 (http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和ProtScale (http：//web.expasy.org/protscale)預(yù)測(cè)HbDHAR2的保守結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域及親/疏水性；通過(guò)NCBI BlastP獲取與HbDHAR2同源的其他植物DHAR蛋白序列，利用Clustal Omega (http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)進(jìn)行多序列比對(duì)，并利用MEGA 10.0軟件中Neighbor-Joining算法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap重復(fù)次數(shù)設(shè)為1 000。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

使用Primer 3設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qPCR)分析的HbDHAR2特異引物，正向引物：5′-GATCTCAGGGTGGGAGCCTA-3′，反向引物：5′-CCACTGGCATACATCTCGGT-3′。內(nèi)參基因選用HbUBC4，正向引物：5′-TCACCCTGAACCTGATAGCC-3′，反向引物：5′-TTTCTTTGGTGACGCTGCAA-3′。qPCR 在Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀上進(jìn)行，熒光染料采用的是TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus) (TaKaRa)，具體反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照試劑說(shuō)明書實(shí)施。采用2-ΔΔCt計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果以3次生物學(xué)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用Excel 2007程序處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，并制作圖表。差異顯著性分析采用SAS 8.1軟件，顯著性檢驗(yàn)水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 HbDHAR2基因克隆及序列分析

從橡膠樹(shù)HeveaDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//hevea.catas.cn/home/index)獲取scaffold0276_83160序列，并在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast。比對(duì)結(jié)果表明，該基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的XM_021823366.1序列相同。根據(jù)該序列設(shè)計(jì)特異引物，以橡膠樹(shù)品種熱研7-33-97葉片cDNA為模板，采用PCR克隆了該基因(圖1)。測(cè)序分析表明，擴(kuò)增獲得的基因序列長(zhǎng)785 bp，與參考序列完全一致。序列比對(duì)結(jié)果表明，該基因與其他植物DHAR2基因具有很高的序列一致性，故將該基因命名為HbDHAR2。

基因預(yù)測(cè)結(jié)果表明，HbDHAR2基因ORF長(zhǎng)度為639 bp，編碼212個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)HbDHAR2蛋白分子量為23.82 ku，理論等電點(diǎn)為5.69。蛋白序列比對(duì)及保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)表明，HbDHAR2蛋白屬于GST超家族中的DHAR亞類。HbDHAR2含有2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域：GST N-端結(jié)構(gòu)域和GST C-端DHAR結(jié)構(gòu)域，分別位于第19-88位和89-209位氨基酸(圖2)。此外，在其GST N-端結(jié)構(gòu)域中含有一CPFS/C保守模體(圖2)。

TMHMM Server v.2.0預(yù)測(cè)結(jié)果表明，HbDHAR2蛋白不具有跨膜結(jié)構(gòu)域。ProtScale預(yù)測(cè)結(jié)果如圖3所示，HbDHAR2氨基酸序列的第9位的丙氨酸分值最大，為1.833，是疏水性最強(qiáng)的氨基酸；第117位的天冬氨酸分值最小，為-2.600，是親水性最強(qiáng)的氨基酸。HbDHAR2氨基酸序列預(yù)測(cè)分值為負(fù)值的氨基酸數(shù)量明顯高于分值為正值的氨基酸數(shù)量，表明HbDHAR2為親水性蛋白。

2.2 HbDHAR2蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

對(duì)橡膠樹(shù)HbDHAR2、小麥TaDHAR2、水稻OsDHAR1、擬南芥AtDHAR2、棉花GhDHAR2、胡楊PeDHAR2、麻風(fēng)樹(shù)JcDHAR2、蓖麻RcDHAR2和木薯MeDHAR2蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)分析，結(jié)果顯示，所分析的DHAR蛋白之間的一致性都在67%以上，說(shuō)明DHAR在不同植物中較為保守(圖2)。HbDHAR2與木薯MeDHAR2 (XP_021624573.1)氨基酸序列一致性最高，達(dá)91.94%。其次是蓖麻RcDHAR2 (XP_002523030.1)，一致性為85.78% (圖2)。進(jìn)一步構(gòu)建HbDHAR2與所選其他植物DHAR蛋白的進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)這些DHAR蛋白可分為2組。麻風(fēng)樹(shù)JcDHAR2、甜橙CsDHAR2、陸地棉GhDHAR2、雷蒙德氏棉GrDHAR2、榴蓮DzDHAR2、亞洲棉GaDHAR2、木槿HsDHAR4聚為一組；橡膠樹(shù)HbDHAR2與其他8個(gè)DHAR蛋白聚為一組，該組又可進(jìn)一步分為2個(gè)亞組。HbDHAR2與木薯MeDHAR2、蓖麻RcDHAR2聚在同一亞組，表明三者親緣關(guān)系最近(圖4)。

2.3 HbDHAR2基因的組織表達(dá)模式

如圖5所示，在橡膠樹(shù)根、膠乳、樹(shù)皮、衰老葉、成熟葉、嫩梢、雄花和雌花中均檢測(cè)到HbDHAR2基因的表達(dá)，但在各組織中的表達(dá)量不同，其中，在嫩梢和雌花中的表達(dá)量較高，其次是成熟葉，而在膠乳和根中的表達(dá)量較低(圖5)。比較HbDHAR2基因在衰老葉和成熟葉的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，HbDHAR2在衰老葉中的表達(dá)量顯著低于成熟葉(P<0.05)。

2.4 激素處理對(duì)HbDHAR2基因表達(dá)的影響

對(duì)照組中，HbDHAR2基因的表達(dá)水平基本是穩(wěn)定的，僅在12 h出現(xiàn)明顯下調(diào)。ETH、MeJA、SA及ABA處理后，不同時(shí)間點(diǎn)葉片中HbDHAR2基因的表達(dá)量均顯著高于相應(yīng)對(duì)照(P<0.05)，說(shuō)明HbDHAR2的表達(dá)受這些激素誘導(dǎo)(圖6)。其中，ETH和MeJA處理后，HbDHAR2基因的表達(dá)變化趨勢(shì)相似，均以在處理48 h的表達(dá)量最高，分別為對(duì)照的9.4，7.6倍，表明在ETH和MeJA處理后期HbDHAR2的響應(yīng)更強(qiáng)烈。SA處理能快速提高HbDHAR2基因的表達(dá)，在處理3 h表達(dá)量便達(dá)到最高，為對(duì)照的7.6倍。ABA處理也能迅速誘導(dǎo)HbDHAR2基因的表達(dá)，也以處理3 h的表達(dá)量最高，為處理前的6.7倍；此后HbDHAR2基因的表達(dá)有所下降，而處理48 h又有所上升，接近3 h的表達(dá)量。SA和ABA處理后，HbDHAR2表達(dá)量迅速增加，在3 h就達(dá)到最大值，表明HbDHAR2基因能快速響應(yīng)SA和ABA。以上結(jié)果表明，ETH、MeJA、SA和ABA處理均能誘導(dǎo)HbDHAR2基因的表達(dá)，其中ETH和MeJA處理的誘導(dǎo)效果更明顯。

2.5 非生物脅迫下HbDHAR2基因的表達(dá)變化

由圖7可知，低溫脅迫下，葉片中HbDHAR2基因的表達(dá)呈先升高后回落趨勢(shì)，以處理3 hHbDHAR2的表達(dá)量最高，是處理前的13.3倍；處理3 h后，HbDHAR2的表達(dá)水平逐漸回落，但在3～24 h階段均顯著高于處理前；處理48 h，HbDHAR2的表達(dá)量基本回落到處理前正常水平。PEG誘導(dǎo)的干旱和MV誘導(dǎo)的氧化脅迫下，HbDHAR2基因的表達(dá)變化趨勢(shì)相似，處理3 h的表達(dá)量較處理前顯著上升，6 h明顯回落，但處理12 h，表達(dá)量再次顯著上升，達(dá)到最大值，分別為處理前的10.7，6.1倍；處理24 h后，HbDHAR2的表達(dá)水平逐步回落，但各處理時(shí)間點(diǎn)HbDHAR2的表達(dá)量均顯著高于處理前。NaCl誘導(dǎo)的高鹽脅迫下，HbDHAR2基因的表達(dá)量在處理3，6，24 h時(shí)均顯著高于處理前，其中，處理3，24 h，HbDHAR2基因的表達(dá)水平接近，是處理前的3.4倍；而處理48 h，HbDHAR2基因的表達(dá)量明顯下調(diào)，顯著低于處理前。H2O2誘導(dǎo)的氧化脅迫下，各處理時(shí)間點(diǎn)HbDHAR2基因的表達(dá)量均顯著高于處理前，其中，處理48 h，HbDHAR2基因的表達(dá)量最高，是處理前的4.3倍。上述結(jié)果表明，HbDHAR2基因的表達(dá)受低溫、干旱、高鹽和氧化脅迫的誘導(dǎo)，其中受低溫和干旱脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)更強(qiáng)烈。

3 討論

本研究從橡膠樹(shù)中克隆了HbDHAR2基因，保守結(jié)構(gòu)域和序列比對(duì)分析表明，HbDHAR2具有典型的GST N-端結(jié)構(gòu)域和GST C-端DHAR結(jié)構(gòu)域，與其他植物DHAR2或DHAR2-like蛋白具有較高的一致性。根據(jù)Lallement等[5]對(duì)植物GST超家族的分類，HbDHAR2屬于GST超家族中的DHAR亞類。在HbDHAR2的GST N-端結(jié)構(gòu)域含有CPFS/C保守基序，該保守基序是所有植物DHAR都具有的[7]。研究表明，CXXS/C基序在氧化還原酶中非常保守，其對(duì)于酶氧化還原功能的發(fā)揮至關(guān)重要[28]。DHAR能將氧化型AsA還原為還原型AsA，是植物AsA再生的關(guān)鍵酶，也是植物體內(nèi)一種非常重要的抗氧化酶[9-10，18，20]。CXXS/C保守基序可能在DHAR行使功能中扮演著重要角色。

AsA是一種重要的抗氧化劑，能清除植物在光合作用、生物及非生物脅迫等過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧，從而保護(hù)植物細(xì)胞免受傷害。除此之外，AsA還調(diào)控著植物的生長(zhǎng)發(fā)育[29]。研究表明，DHAR基因能通過(guò)調(diào)節(jié)AsA水平調(diào)控植物細(xì)胞的分裂、分化及快速生長(zhǎng)[17，30]。本研究通過(guò)組織表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，HbDHAR2在橡膠樹(shù)嫩梢中的表達(dá)量最高。嫩梢生長(zhǎng)快速，細(xì)胞分裂活動(dòng)旺盛，HbDHAR2在該組織中高表達(dá)，推測(cè)其可能參與調(diào)控枝梢生長(zhǎng)發(fā)育。此外，HbDHAR2在雌花中也具有很高的表達(dá)量，其可能參與了雌花發(fā)育調(diào)控。Chen和Gallie[17]的研究表明，降低DHAR的表達(dá)會(huì)加速葉片的衰老，而提高DHAR的表達(dá)能減緩葉片衰老。與此相符，本研究發(fā)現(xiàn)衰老葉片中HbDHAR2基因的表達(dá)水平顯著低于成熟葉片，這表明HbDHAR2可能參與調(diào)控橡膠樹(shù)葉片的衰老。

激素在植物對(duì)逆境的適應(yīng)中起著重要作用，其中調(diào)控植物生物或非生物脅迫響應(yīng)的主要激素有ABA、乙烯(ET)、茉莉酸(JA)和SA[31]。當(dāng)植物受到脅迫刺激后，會(huì)激活這些激素信號(hào)途徑，從而調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)，以抵御逆境脅迫。旨為明確HbDHAR2基因是否受這些激素調(diào)控，筆者分析了該基因在ABA、ETH、MeJA和SA處理后的表達(dá)變化。結(jié)果表明，這些激素處理均能誘導(dǎo)HbDHAR2的表達(dá)。ABA是植物抵御非生物脅迫的關(guān)鍵信號(hào)分子。在玉米中，ABA處理會(huì)快速上調(diào)ZmDHAR1基因的表達(dá)[14]。與之相似，本研究也發(fā)現(xiàn)ABA處理能迅速誘導(dǎo)HbDHAR2的表達(dá)，推測(cè)HbDHAR2可能通過(guò)依賴 ABA的信號(hào)途徑響應(yīng)非生物脅迫。除調(diào)控非生物脅迫響應(yīng)外，JA 、SA和ET還是調(diào)節(jié)植物抗病反應(yīng)的關(guān)鍵信號(hào)分子[31]。HbDHAR2的表達(dá)受MeJA、SA和ETH誘導(dǎo)，預(yù)示著該基因可能參與了橡膠樹(shù)對(duì)病原菌等生物脅迫的應(yīng)答。此外，ET對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，特別是植物的成熟和衰老起著非常重要的調(diào)節(jié)作用。ETH處理后期HbDHAR2具有很高的表達(dá)量，結(jié)合該基因在嫩梢中高表達(dá)而在衰老葉中低表達(dá)的特性，推測(cè)ETH處理后HbDHAR2的上調(diào)表達(dá)可能是植株為了延緩ETH誘導(dǎo)的衰老而采取的抵御措施。

非生物脅迫下，DHAR能催化生成更多的AsA，從而有效清除植物體內(nèi)產(chǎn)生的過(guò)量活性氧，提高植物的抗逆性。眾多研究表明，植物在遭受非生物脅迫后，DHAR基因的表達(dá)會(huì)上調(diào)[14，15，25]。本研究也發(fā)現(xiàn)，低溫、PEG誘導(dǎo)的干旱、高鹽、MV和H2O2誘導(dǎo)的氧化脅迫均能誘導(dǎo)HbDHAR2的表達(dá)，而且在處理3 h就上調(diào)很高，這表明該基因能對(duì)多種非生物脅迫做出快速應(yīng)答，HbDHAR2可能在橡膠樹(shù)響應(yīng)非生物脅迫中發(fā)揮重要的作用。一些研究表明，超量表達(dá)DHAR基因能顯著提高轉(zhuǎn)基因植株的抗逆性，如水稻OsDHAR1[21-22]、油菜BrDHAR[23]、擬南芥AtDHAR1[24]、小麥DHAR[25]等。超量表達(dá)HbDHAR2是否也能提高橡膠樹(shù)對(duì)非生物脅迫的抗性還有待進(jìn)一步的功能驗(yàn)證分析。