綠豆暈疫病病原菌的分離和鑒定

田曉燕，孔慶全，賀小勇，趙存虎，陳文晉，馬顯民

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特010031；2.赤峰市翁牛特旗農(nóng)牧局，內(nèi)蒙古翁牛特旗024500）

綠豆是溫帶、亞熱帶和熱帶高海拔地區(qū)廣泛種植的食用豆類作物[1]，產(chǎn)區(qū)主要在亞洲，被譽(yù)為“亞洲豆類作物”[2-3]。綠豆在我國(guó)已有2 000多年的栽培歷史，我國(guó)綠豆年種植面積在80萬hm2左右，總產(chǎn)量約100萬t，是世界上最大的綠豆出口國(guó)[4-5]。內(nèi)蒙古自治區(qū)是我國(guó)綠豆的主產(chǎn)區(qū)之一，播種面積每年平均保持在20萬hm2以上，具有悠久的栽培歷史和獨(dú)特的地區(qū)優(yōu)勢(shì)，是一些冷涼山區(qū)、干旱與半干旱地區(qū)的主栽作物，也是當(dāng)?shù)剞r(nóng)民主要的經(jīng)濟(jì)來源。

近年來隨著綠豆產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，出現(xiàn)了許多新的病蟲害，特別是2009年我國(guó)東北地區(qū)的綠豆種植區(qū)首次發(fā)生綠豆暈疫病[6]，隨后在全國(guó)綠豆主產(chǎn)區(qū)迅速傳播和蔓延，造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失，成為我國(guó)綠豆生產(chǎn)的主要威脅。朱振東等[6]從2009年開始直至2014年，持續(xù)6年對(duì)覆蓋我國(guó)7個(gè)地理區(qū)域的15個(gè)?。ㄗ灾螀^(qū)）連續(xù)多年實(shí)地調(diào)查發(fā)現(xiàn)，綠豆暈疫病發(fā)生在我國(guó)黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、北京、河北、山西、陜西和新疆9個(gè)省和自治區(qū)的37個(gè)縣（市），包括我國(guó)東北、北部和西北3個(gè)主要的綠豆產(chǎn)區(qū)。綠豆暈疫病造成綠豆平均減產(chǎn)30%～50%，產(chǎn)量損失超過80%，發(fā)病率最高為100%。該病曾造成陜西榆林市和河北宣化縣綠豆絕收，已經(jīng)威脅到我國(guó)綠豆生產(chǎn)體系[7]，因此，綠豆暈疫病的深入調(diào)查研究對(duì)于總結(jié)病害的流行規(guī)律和綜合防控意義重大。

本研究在實(shí)地調(diào)查內(nèi)蒙古自治區(qū)綠豆主產(chǎn)區(qū)暈疫病發(fā)生情況的基礎(chǔ)上，通過病理學(xué)、生理生化及分子生物學(xué)方法對(duì)病原菌進(jìn)行了分離與鑒定，旨在為綠豆暈疫病的防治奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病害分布調(diào)查

由于新病害綠豆暈疫病的流行蔓延，對(duì)內(nèi)蒙古綠豆產(chǎn)區(qū)造成了嚴(yán)重產(chǎn)量損失，本試驗(yàn)于2014—2018年連續(xù)5年實(shí)地調(diào)研內(nèi)蒙古呼和浩特市、烏蘭察布市、赤峰市、興安盟等7個(gè)盟（市），包括托克托縣、清水河縣、涼城縣、豐鎮(zhèn)市、翁牛特旗、敖漢旗、突泉縣和扎賚特旗等20多個(gè)縣（市、旗）的綠豆暈疫病發(fā)生分布和危害程度情況，幾乎涵蓋了整個(gè)內(nèi)蒙古綠豆產(chǎn)區(qū)。調(diào)研同時(shí)采集發(fā)病植株，并及時(shí)分離病原菌。

1.2 病樣采集及病原菌分離

采集各地具有暈疫病典型癥狀的病葉或病莢，病葉癥狀為初期較下部葉片表面出現(xiàn)水漬斑，隨后壞死，變?yōu)榈S色到棕褐色，病斑周圍產(chǎn)生一個(gè)寬的黃綠色暈圈，后期病斑在葉脈間擴(kuò)展，連接成片，病斑變?yōu)楹谏?/p>

將采集到的病樣，取病健交界部位切成小塊，用75%的酒精表面消毒2～3 s，2%的次氯酸鈉溶液消毒2 min，用無菌水沖洗3次后置于無菌研缽中同時(shí)加入600 μL無菌水研磨，取該組織液涂布在KB培養(yǎng)基（蛋白胨20.0 g，甘油10.0 g，K2HPO41.5 g，Mg2SO4·7H2O 1.5 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.2）平板，于28℃培養(yǎng)，48 h后挑取單個(gè)菌落進(jìn)行劃線純化。

1.3 致病性測(cè)定

將健康綠豆種子，品種為冀綠7號(hào)，用0.3 %高錳酸鉀溶液消毒20 min后，播種于盛有滅菌沙壤土的營(yíng)養(yǎng)缽中，每盆3株，處理與對(duì)照各5盆。將分離所得菌株在KB培養(yǎng)基上28℃下培養(yǎng)48 h后，配成濃度為1×108CFU/mL的懸浮液。用噴霧法接種至生長(zhǎng)14 d左右4～6葉期幼苗上，用手指將菌懸液輕輕涂抹均勻，將接種后的綠豆苗置于18～20℃氣候室，套袋保濕48 h，以無菌水為對(duì)照。7 d后開始進(jìn)行發(fā)病情況的觀察，10～14 d后進(jìn)行病原菌分離。

1.4 病原菌培養(yǎng)性狀觀察

供試菌株在KB平板上于28℃培養(yǎng)48 h后觀察菌落形態(tài)、大小和顏色。

1.5 革蘭氏反應(yīng)

采用3 %的KOH反應(yīng)測(cè)定，具體參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[8]中的方法。

1.6 生理生化和碳源利用的測(cè)定

對(duì)供試菌株進(jìn)行氧化酶測(cè)定，接觸酶測(cè)定，葡萄糖、蔗糖、乳糖發(fā)酵試驗(yàn)，葡萄糖酸鹽的氧化，淀粉水解試驗(yàn)，明膠水解試驗(yàn)，硝酸鹽還原試驗(yàn)，硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)，脲酶測(cè)定，精氨酸雙水解酶測(cè)定，生長(zhǎng)溫度等一系列生理生化指標(biāo)測(cè)定和利用蔗糖、葡萄糖、肌醇、乳糖不同碳源的測(cè)定，具體參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[8]和《植物病原細(xì)菌的分類和鑒定》[9]中的方法。

1.7 病原菌分子生物學(xué)鑒定

將供試菌株接種到KB液體培養(yǎng)基內(nèi)，28℃振蕩培養(yǎng)24 h，用天根細(xì)菌DNA試劑盒提取病原菌總基因組，然后用特異性引物[10]P1：5′-AGCTTCTCC TCAAAACACCTGC-3′，P2：5′-TGTTCGCCAGAGGC AGTCATG-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物為0.5 kb。引物序列交由大連寶生物工程有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系為：DNA模板50 ng，10 μmol/L引物P1、P2各1.0 μL，5 U/μL Taq酶0.5 μL，2.5 mmol/L each dNTP 1.5 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，用ddH2O補(bǔ)足25 μL。

PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min后，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，循環(huán)38次，72℃延伸5 min。

用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。PCR產(chǎn)物委托英俊測(cè)序公司測(cè)序。序列遞交GenBank數(shù)據(jù)庫，使用Blastn程序進(jìn)行相似性比較，從而確定供試菌株分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害分布調(diào)查結(jié)果

2014年之前，暈疫病在內(nèi)蒙古綠豆產(chǎn)區(qū)僅零星發(fā)生，并未大面積流行蔓延，2014年該病開始大面積流行蔓延，并造成嚴(yán)重產(chǎn)量損失。2014—2018年研究團(tuán)隊(duì)連續(xù)5年普查調(diào)研了內(nèi)蒙古綠豆產(chǎn)區(qū)的7個(gè)盟（市）28個(gè)旗（縣），發(fā)現(xiàn)幾乎整個(gè)產(chǎn)區(qū)綠豆暈疫病均有發(fā)生，只是嚴(yán)重程度有所不同。干旱少雨的地方發(fā)生較輕，甚至不發(fā)生，冷涼、潮濕地區(qū)易發(fā)病且發(fā)病較重，呼和浩特市的托克托縣、清水河縣、賽罕區(qū)，烏蘭察布市的涼城縣、豐鎮(zhèn)市、興和縣，赤峰市的松山區(qū)、翁牛特旗，興安盟的烏蘭浩特市、突泉縣，呼倫貝爾市的扎蘭屯發(fā)生危害較重。赤峰市和興安盟平均發(fā)病率為20%～50%，其余地區(qū)平均發(fā)病率為50%～80%，個(gè)別發(fā)病較重地區(qū)發(fā)病率達(dá)100%。

2.2 病原菌分離及致病性測(cè)定結(jié)果

從以上各綠豆暈疫病發(fā)生地采集病樣150余份，共分離獲得50余份病原菌分離物，幾乎每個(gè)發(fā)生旗縣都分離到了菌株，在5個(gè)重發(fā)生盟市選取5個(gè)具有代表性的菌株繼續(xù)進(jìn)行試驗(yàn)。將分離得到的5個(gè)菌株接種綠豆幼苗，接種后的第6天植株葉背開始產(chǎn)生不規(guī)則的水漬狀斑點(diǎn)，10 d之后擴(kuò)展為深褐色的病斑，病斑周圍有一圈寬的黃綠色暈圈，接種14 d左右植株系統(tǒng)褪綠、矮化，葉片向下卷曲，與田間癥狀一致（圖1）。相反，接種無菌水的對(duì)照植株長(zhǎng)勢(shì)良好，健康無病。對(duì)發(fā)病植株進(jìn)行再分離可以獲得與接種病原菌相同的菌株，說明接種菌株為造成綠豆暈疫病的致病菌。

圖1 綠豆暈疫病癥狀

2.3 病原菌形態(tài)特征觀察

供試菌株在KB培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，菌落圓形、淡黃色，邊緣整齊，典型特征是生長(zhǎng)期間有淺黃綠色素產(chǎn)生并擴(kuò)散到培養(yǎng)基中，366 nm紫外光下有黃綠色熒光。經(jīng)電子顯微鏡觀察，供試菌株均呈短桿狀，2.2～5.5 μm，無芽孢，有極生鞭毛（圖2）。

圖2 病原菌菌落及其形態(tài)特征

2.4 革蘭氏反應(yīng)結(jié)果

供試菌株經(jīng)3 %的KOH反應(yīng)，能拉出絲狀物，說明為革蘭氏陰性菌。

2.5 生理生化和碳源利用結(jié)果

供試菌株氧化酶反應(yīng)呈陰性，接觸酶反應(yīng)呈陽性，葡萄糖、蔗糖氧化性產(chǎn)酸，乳糖不產(chǎn)酸，葡萄糖酸鹽的氧化、淀粉水解、精氨酸雙水解酶反應(yīng)均呈陰性，明膠水解、硝酸鹽還原、硫化氫產(chǎn)生，脲酶測(cè)定均呈陽性，40℃和4℃下不能生長(zhǎng)，最高生長(zhǎng)溫度為37℃，最低為5℃。蔗糖、葡萄糖、肌醇、乳糖供試菌株均能利用，利用程度為蔗糖＞肌醇＞葡萄糖＞乳糖。

2.6 病原菌分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

供試菌株提取出DNA后用特異性引物P1、P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，從圖3可以觀察到，其片段大小為500 bp左右，與預(yù)期的目標(biāo)條帶大小相同，且完整性好、質(zhì)量較高。

圖3 部分供試菌株P(guān)CR擴(kuò)增結(jié)果

PCR產(chǎn)物委托英俊測(cè)序公司測(cè)序，所測(cè)序列遞交GenBank數(shù)據(jù)庫，使用Blastn程序進(jìn)行相似性比較，結(jié)果顯示所測(cè)序列與丁香假單胞菌菜豆致病變種Pseudomonas syringae pv.phaseolicola的序列相似性高達(dá)99.99%，進(jìn)一步確定了該致病菌株為丁香假單胞菌菜豆致病變種（圖4）。

圖4 分離菌株序列比對(duì)結(jié)果

3 討論

近年來我國(guó)綠豆產(chǎn)業(yè)比重逐年加大，綠豆暈疫病也有明顯的加重趨勢(shì)。該病害是冷涼、潮濕地區(qū)常發(fā)生的病害，嚴(yán)重威脅綠豆的生產(chǎn)和品質(zhì)[11]。到目前為止，只有少數(shù)幾個(gè)國(guó)家報(bào)道了綠豆暈疫病，根據(jù)致病性測(cè)定結(jié)果，供試菌株接種綠豆后能引起與田間相同的癥狀，且與首次報(bào)道[12]的綠豆暈疫病的發(fā)病癥狀一致。據(jù)報(bào)道其病原菌為丁香假單胞菌菜豆致病變種（Pseudomonas syringae pv.phaseolicola）[13]，這與本研究結(jié)果一致。

國(guó)內(nèi)對(duì)于小宗作物綠豆產(chǎn)業(yè)的病蟲害研究少之又少，加之現(xiàn)如今的研究方向多以分子生物學(xué)為主導(dǎo)[14]，綠豆暈疫病菌的基礎(chǔ)研究幾乎沒有，病原菌的生物學(xué)特性等研究在我國(guó)更是空白。本試驗(yàn)基于對(duì)病原菌的表型特征、生理生化特性、碳源利用的檢測(cè)結(jié)果，除了生理生化特性中硝酸鹽還原、脲酶測(cè)定和硫化氫產(chǎn)生結(jié)果與王淑秋等[15]報(bào)道的性狀不一致，其余各性狀均與王淑秋等[15]、GUVEN等[16]、JEON等[17]報(bào)道的性狀一致。而該病原菌生理生化中3個(gè)測(cè)定指標(biāo)不一致的原因可能是王淑秋等[15]的病原菌是從菜豆上分離獲得，本試驗(yàn)的病原菌是從綠豆上分離得到的，同一菌種在不同的寄主上表現(xiàn)性狀也可能會(huì)有差異。通過對(duì)病原菌基因組DNA進(jìn)行特異性引物PCR擴(kuò)增，得到了與Pseudomonas syringae pv.phaseolicola預(yù)期大小相同的目標(biāo)條帶，檢測(cè)結(jié)果同王淑秋等[15]報(bào)道一致，且其基因序列與Pseudomonas syringae pv.phaseolicola的序列相似性高達(dá)99.99%。

目前，國(guó)內(nèi)對(duì)于綠豆新病害暈疫病的研究未見報(bào)道，本試驗(yàn)通過對(duì)綠豆暈疫病菌培養(yǎng)性狀、生理生化特性和碳源利用等方面的研究，增添了對(duì)綠豆暈疫病的新認(rèn)知，也為綠豆生產(chǎn)中病蟲害防治提供了理論基礎(chǔ)。