病死藍(lán)孔雀胚中細(xì)菌的分離與鑒定

焦鳳超 李迎曉 李洵 徐光科 趙瑜 饒丹 劉錦妮 吳海港 黃立 趙聘

摘? 要：2019～2020年，河南省某藍(lán)孔雀繁育基地連續(xù)出現(xiàn)死胚增多、出雛率下降等情況，通過對(duì)送檢藍(lán)孔雀死胚進(jìn)行細(xì)菌病原學(xué)檢測(cè)，結(jié)果共檢出綠膿桿菌、大腸桿菌、陰溝腸桿菌和奇異變形桿菌四種細(xì)菌，分離率分別為38.82%、17.65%、17.65%和16.47%。其中綠膿桿菌和大腸桿菌混合感染分離率為16.47%、綠膿桿菌和奇異變形桿菌混合感染分離率為10.59%、奇異變形桿菌和大腸桿菌混合感染分離率為5.88%。由此可見，四種細(xì)菌單獨(dú)或混合感染可能是引起該孵化場(chǎng)死胚增多、出雛率下降的主要原因。

關(guān)鍵詞：藍(lán)孔雀;綠膿桿菌;大腸桿菌;陰溝腸桿菌;奇異變形桿菌;分離;鑒定

中圖分類號(hào)：S858.39? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B? ? 文章編號(hào)：1673-1085（2021）4-0033-05

奇異變性桿菌屬于腸桿菌科變形桿菌屬，是一種條件性致病菌，自1981年首次被發(fā)現(xiàn)以來，該菌對(duì)多種動(dòng)物致病的報(bào)道不斷出現(xiàn)[1-7]。陰溝腸桿菌屬于腸桿菌科腸桿菌屬，近年來關(guān)于動(dòng)物發(fā)病的報(bào)道屢見不鮮[8， 9]。綠膿桿菌，又稱為銅綠假單胞菌，該菌在自然界廣泛分布，對(duì)雞胚、鴨胚、鵝胚、鴿胚等表現(xiàn)出較強(qiáng)的致病性[10-13]。禽大腸桿菌是引起雞、火雞及其它禽類局部或全身性大腸桿菌病的病原，常表現(xiàn)為心包炎、肝周炎、腹膜炎、氣囊炎、輸卵管炎等癥狀，是目前嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的傳染病之一[14]。

河南省某藍(lán)孔雀繁育基地近兩年來連續(xù)出現(xiàn)死胚增多、出雛率下降等情況，筆者對(duì)死亡孔雀胚蛋進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)、16S rDNA基因檢測(cè)和系統(tǒng)發(fā)育分析，為揭示孔雀胚死亡原因和孔雀細(xì)菌性疾病的預(yù)防提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 病料? 樣品來源于河南省某藍(lán)孔雀繁育基地的死亡藍(lán)孔雀胚蛋85枚。

1.2? 主要試劑和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物? 營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、SS瓊脂、細(xì)菌微量生化鑒定管購自杭州天和微生物試劑有限公司;無菌脫纖維羊血購自南京茂捷生物科技有限公司;即用型Taq酶PCR試劑盒、DL2000 DNA Marker等購自生工生物工程（上海）股份有限公司、細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司;3日齡藍(lán)孔雀購自信陽市鳳天農(nóng)業(yè)科技有限公司。

1.4? 細(xì)菌學(xué)檢查

1.4.1? 細(xì)菌的分離培養(yǎng)? 仔細(xì)檢查死亡胚蛋外殼完整程度，丟棄蛋殼破損的胚蛋。將死亡胚蛋外殼消毒后，無菌采集胚體內(nèi)臟組織，劃線接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落分別接種鮮血瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基和營養(yǎng)肉湯，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)表現(xiàn)，并挑取單菌落革蘭氏染色后鏡檢。

1.4.2? 生化試驗(yàn)? 將分離菌純培養(yǎng)物接種細(xì)菌微量生化鑒定管，37 ℃培養(yǎng)24～48 h后記錄結(jié)果。

1.4.3? 分子生物學(xué)檢測(cè)

1.4.3.1? 引物設(shè)計(jì)? 參考文獻(xiàn)合成大腸桿菌phoA基因、綠膿桿菌toxR基因、奇異變形桿菌ureR基因、沙門菌invA基因和細(xì)菌通用16S rRNA引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 具體信息見表1。

1.4.3.2? 16S rDNA序列測(cè)定與分析? PCR反應(yīng)體系25 μL：2× Taq Master Mix 12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，模板1 μL，超純水9.5 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃ 預(yù)變性3 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72℃ 1.5 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸 5 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分析后，送生工生物工程 （上海） 股份有限公司測(cè)序，并通過在線Blast檢索確認(rèn)。

1.4.3.3? 細(xì)菌特異性基因PCR檢測(cè)? 對(duì)經(jīng)過16S rDNA檢測(cè)和序列初步分析的細(xì)菌，應(yīng)用合成的細(xì)菌特異性基因引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分析后，送生工生物工程 （上海） 股份有限公司測(cè)序，并通過在線Blast檢索確認(rèn)。

1.5? 動(dòng)物致病性試驗(yàn)? 將3日齡的藍(lán)孔雀分為若干組，試驗(yàn)組腹腔注射0.1 mL（約2×109CFU）經(jīng) 37 ℃ 200 r/m振搖培養(yǎng)16 h的主要種類分離菌的液體培養(yǎng)物;同時(shí)設(shè)立對(duì)照組，腹腔注射0.1 mL滅菌液體培養(yǎng)基。接種后每天觀察并記錄各組發(fā)病死亡情況。無菌采集死亡孔雀和人為處死孔雀的內(nèi)臟組織進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定[19-22]。

2? 結(jié)果

2.1? 細(xì)菌分離與染色? 從死亡的孔雀胚蛋中主要分離到4種類型的細(xì)菌。

菌1：在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上形成圓形凸起、光滑濕潤(rùn)并且邊緣整齊的紅色菌落，在營養(yǎng)瓊脂上長(zhǎng)成隆起、濕潤(rùn)、光滑、灰白色菌落。革蘭氏染色陰性的直桿菌，兩端鈍圓，散在或成對(duì)存在。

菌2：在麥康凱培養(yǎng)基上長(zhǎng)出圓形、扁平、半透明、無色、濕潤(rùn)菌落;在SS培養(yǎng)基上長(zhǎng)出橘黃色或中心成黑色的菌落。革蘭氏染色鏡檢發(fā)現(xiàn)該分離菌為革蘭氏陰性的中等大小、兩端鈍圓的桿菌。

菌3：分離菌在SS培養(yǎng)基上長(zhǎng)出無色的菌落。革蘭氏染色鏡檢發(fā)現(xiàn)該分離菌為革蘭氏陰性的中等大小、兩端鈍圓的桿菌。

菌4：在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上形成潤(rùn)滑、隆起、邊沿整齊菌落，且培養(yǎng)基逐漸變?yōu)榫G色。革蘭氏染色鏡檢該菌為革蘭氏陰性菌中等大小，單個(gè)或成對(duì)，呈短鏈或桿狀。

2.2? 生化試驗(yàn)結(jié)果? 四種分離菌生物特性見表2。

2.3? 分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果? 根據(jù)菌3的16S rDNA PCR檢測(cè)以及基因序列在線Blast檢索，確定菌3為陰溝腸桿菌（圖1）;根據(jù)菌1、菌2和菌4的16S rDNA序列在線Blast檢索和特異性基因PCR檢測(cè)（圖2～圖4），確定菌1為大腸桿菌、菌2為奇異變形桿菌、菌4為綠膿桿菌。

2.4? 孔雀胚蛋帶菌情況統(tǒng)計(jì)結(jié)果? 根據(jù)生化試驗(yàn)和分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果，從85枚孔雀死胚蛋中共分離到四種主要細(xì)菌：綠膿桿菌、大腸桿菌、陰溝腸桿菌和奇異變形桿菌，分離率分別為38.82%、17.65%、17.65%和16.47%，并且存在一定的混合感染情況，詳情見表3。

2.5? 動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果? 菌1試驗(yàn)組的孔雀在接種之后普遍出現(xiàn)精神沉郁，24 h內(nèi)死亡3只，剖檢變化可見心包積液，肝臟、脾臟充血現(xiàn)象;病程較長(zhǎng)的可見不同程度的肝周炎、心包炎和氣囊炎現(xiàn)象。

菌2試驗(yàn)組的孔雀從接種10 h后出現(xiàn)精神沉郁、厭食，約24 h后出現(xiàn)腹瀉和死亡，至試驗(yàn)的第4天，5只孔雀全部死亡，對(duì)照組孔雀無異常。

菌3試驗(yàn)組的孔雀從接種24 h后出現(xiàn)精神沉郁、厭食，腹瀉等臨床癥狀。

菌4試驗(yàn)組的孔雀接種18 h后出現(xiàn)精神沉郁、厭食、腹瀉等臨床癥狀，48 h后死亡2只;對(duì)照組孔雀均無異常。

無菌采集試驗(yàn)組發(fā)病孔雀肝臟和脾臟病料，抹片經(jīng)革蘭染色鏡檢細(xì)菌及細(xì)菌分離，各試驗(yàn)組均能發(fā)現(xiàn)和分離到原接種菌。

3? 討論

針對(duì)某藍(lán)孔雀繁育基地近兩年來連續(xù)出現(xiàn)死胚增多、出雛率下降等情況，本研究對(duì)信陽市某藍(lán)孔雀繁育基地送檢的85枚病死胚蛋進(jìn)行培養(yǎng)、生化特性及分子生物學(xué)鑒定，確定分離的細(xì)菌分別為綠膿桿菌、大腸桿菌、陰溝腸桿菌和奇異變形桿菌，且分離率分別為38.82%、17.65%、17.65%和16.47%。其中，綠膿桿菌和大腸桿菌混合感染分離率為16.47%，綠膿桿菌和奇異變形桿菌混合感染分離率為10.59%，奇異變形桿菌和大腸桿菌混合感染分離率為5.88%。由此可見，四種細(xì)菌單獨(dú)或混合感染可能是引起孵化場(chǎng)死胚增多、出雛率下降的主要原因。這與課題組成員前期的部分研究結(jié)果相一致[19， 20]。

目前國內(nèi)對(duì)藍(lán)孔雀孵化期致病因素的研究資料較少，而關(guān)于家禽胚蛋細(xì)菌性病原的分離鑒定報(bào)道比較常見[11， 21-23]。郭繁霞等[11]將遼寧省某種雞孵化場(chǎng)送檢的245枚病死雞胚進(jìn)行病原分離鑒定，最終確定禽波氏桿菌和奇異變形桿菌的混合感染是引起該場(chǎng)疫情發(fā)生的主要原因。宮艷杉[22]對(duì)山東省某多個(gè)種鴨場(chǎng)12個(gè)批次共計(jì)315枚20日齡無破損鴨胚進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn) 245枚存在細(xì)菌感染，其中大腸桿菌、沙門氏菌和奇異變形桿菌分別占38.30%、26.24%和8.16%，是死亡鴨胚中的主要致病菌群。以上研究結(jié)果為弄清本次種孔雀孵化場(chǎng)發(fā)生胚胎死亡、孵化率降低、弱雛率升高等情況提供了很好的借鑒。

本次試驗(yàn)未開展病死孔雀胚中病毒的分離鑒定，因此，此次該孔雀孵化場(chǎng)疫情的發(fā)生不排除可能會(huì)有病毒的參與。李清等隨機(jī)選取送檢的死亡雞胚80枚進(jìn)行病毒檢測(cè)，結(jié)果ALV、REV和CIAV檢出率依次為6.12%、4.49%和2.86%，關(guān)于孔雀胚中相關(guān)病毒性病原的報(bào)道較少，還需要進(jìn)一步的研究證實(shí)[23]。

參考文獻(xiàn)：

[1]? Bisgaard M.Arthritis in ducks I.aetiology and public health aspects[J]. Avian Pathol，1981，10（1）：11-21.

[2]? 孫化露，盧艷，鄒曉艷，等. 3株鴿源奇異變形桿菌的分離與鑒定[J]. 畜牧與獸醫(yī)，2012，44（1）：68-70

[3]? 朱榮華，朱瑞良，馬明德，等.雞奇異變形桿菌的分離鑒定和16S rRNA基因序列測(cè)定與系統(tǒng)進(jìn)化分析[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2011， 31（6）：804-808.

[4]? 段二珍，夏平安，張鳳華，等.狐貍奇異變形桿菌的分離與鑒定[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2008，38（12）：1050-1054.

[5]? 王建科，程悅寧，易立，等.水貂奇異變形桿菌的分離鑒定和16S rRNA基因序列分析[J].中國畜牧獸醫(yī)， 2015，42（4）：852-858.

[6]? 陳曦，王遠(yuǎn)微，王永，等.山羊腹瀉糞便中奇異變形桿菌的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析[J].中國畜牧獸醫(yī)， 2014，41（8）：215-218.

[7]? 楊霞，張飄，曾茂芹，等.1株鴨源奇異變形桿菌的分離鑒定與毒力基因檢測(cè)[J/OL].中國畜牧獸醫(yī)， 2021（03）：1084-1092[2021-03-25].https：//doi.org/10.16431/j.cnki.1671-7236.2021.03.033.

[8]? 李才武，王承東，湯純香，等.大熊貓呼吸道感染陰溝腸桿菌1例[J].畜牧與獸醫(yī)，2013， 45（10）：64-66.

[9]? 張亞黎.由陰溝腸桿菌引起的綿羊肺炎的調(diào)查研究[J].中獸醫(yī)雜志，2014（9）：37.

[10]? 汪東紅，劉國強(qiáng)，劉妹.死亡雞胚中綠膿桿菌的分離與鑒定[J].養(yǎng)禽與禽病防治， 1995（04）： 42-43.

[11]? 陳紅梅，程龍飛，萬春和，等. 死亡番鴨胚中綠膿桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].中國獸醫(yī)雜志， 2012，48（12）：40-42.

[12]? 路振香，許大洋.綠膿桿菌致死鵝胚的初步研究[J].畜牧與獸醫(yī)，2005（05）：38-39.

[13]? 趙寶華，竇新紅，劉敏，等.死胚鴿蛋中綠膿桿菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)[J].經(jīng)濟(jì)動(dòng)物學(xué)報(bào)， 2015，19（01）： 31-33.

[14]? 盧琴，羅青平，張騰飛，等. 禽優(yōu)勢(shì)血清型大腸桿菌部分相關(guān)毒力基因的檢測(cè)[J].中國家禽，2016， 38（08）：56-58.

[15]? Wei B，Cha S Y，Kang M， et al.Development and application of a multiplex PCR assay for rapid detection of 4 major bacterial pathogens in ducks[J]. Poultry Science， 2013， 92（5）：1164-1170.

[16]? 譚燕玲，朱瑞良，王慧，等.雞胚胎性病原菌多重PCR檢測(cè)方法的建立[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2011， 33（05）：374-377.

[17]? Wang Z， Zuo J， Gong J， et al. Development of a multiplex PCR assay for the simultaneous and rapid detection of six pathogenic bacteria in poultry[J]. AMB Express， 2019，9（1）：1-11.

[18]? 王濤，王亮，杜冬冬，等.雞源性腸炎沙門氏菌的鑒定[J]. 中國人獸共患病學(xué)報(bào)， 2012， 28（10）： 982-986.

[19]? 李迎曉，焦鳳超，潘志明，等.孔雀奇異變形桿菌的分離鑒定及遺傳進(jìn)化分析[J]. 畜牧與獸醫(yī)， 2016， 48（5）： 79-81.

[20]? 焦鳳超，李迎曉，劉錦妮，等.藍(lán)孔雀陰溝腸桿菌的分離鑒定與遺傳進(jìn)化分析[J].中國家禽，2016， 38（18）：63-65.

[21]? 郭繁霞，朱瑞良，劉冠華，等.由禽波氏桿菌和奇異變形桿菌共感染為主所致雞胚發(fā)病死亡的生物學(xué)鑒定[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，33（11）：1668-1673.

[22]? 宮艷杉.山東地區(qū)死亡鴨胚中細(xì)菌分離鑒定及沙門氏菌耐藥性與毒力基因檢測(cè)[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.

[23]? 李清.死亡鴨胚中常見病毒的分離鑒定及序列分析[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2017.