鍉針點(diǎn)按法對(duì)缺血性卒中后大鼠大腦皮層腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子的影響

楊 康，胡冠宇，王宇峰，謝東伶，叢德毓*

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，長(zhǎng)春 130117；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 針灸推拿科，長(zhǎng)春 130021）

缺血性腦卒中（ischemic stroke,AIS）是由腦部缺血缺氧引發(fā)一系列缺血性級(jí)聯(lián)反應(yīng)所導(dǎo)致的一種具有高發(fā)病率且發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜的難治性疾病[1]，約占全部卒中的80%[2]。其在我國死亡率居高不下，僅次于惡性腫瘤[3]。不僅如此，缺血性腦卒中的高復(fù)發(fā)率及年輕化態(tài)勢(shì)更是讓研究者們面臨著嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）不僅能夠促進(jìn)腦損傷后神經(jīng)功能和運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，而且參與營養(yǎng)和保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。卒中后腦缺血導(dǎo)致腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子分泌減少，神經(jīng)功能恢復(fù)受到抑制?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證實(shí)，推拿點(diǎn)按手法可改善大腦及四肢的血液循環(huán)，促進(jìn)腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子的表達(dá)。本研究旨在觀察鍉針點(diǎn)按干預(yù)方法對(duì)腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子在缺血性卒中后大鼠腦組織中表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 武漢三鷹生物技術(shù)有限公司提供BDNF 抗體，貨號(hào)：28205-1-ap，分子量28-30KD，種屬：Rabbit，一抗稀釋比：1:1 000，二抗稀釋比：1:5 000，鍉針全長(zhǎng)17 cm，針頭直徑4 mm，北京中研太和醫(yī)療器械有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SPF 級(jí)SD（Sprague-Dawley）大鼠24 只，體質(zhì)量280～300 g，許可證號(hào)：SCXK（吉）·2018-007。自由飲水與進(jìn)食，適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)1周后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3 動(dòng)物模型 采用線栓法建立大鼠局灶性永久性腦缺血模型[4]。大鼠麻醉后仰臥固定，頸部正中縱行切口后暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈（common carotid artery，CCA）、頸外動(dòng)脈（external carotid artery，ECA）和頸內(nèi)動(dòng)脈（internal carotid artery，ICA），分離迷走神經(jīng)，在近心端結(jié)扎CCA、ECA，將線栓在距離CCA 分叉處4 mm 切一小口輕插入ICA 約18 mm，將繞在ICA遠(yuǎn)端的細(xì)線扎緊，最后將CCA遠(yuǎn)端的細(xì)線扎緊并縫合。假手術(shù)組僅剝離皮下肌肉組織。手術(shù)后用Zea Longa 評(píng)分評(píng)價(jià)造模是否成功。

1.4 干預(yù)方法 大鼠根據(jù)李忠仁主編的《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[5]進(jìn)行固定，假手術(shù)組和模型組僅抓取、固定，治療組將壓力傳感器接頭置于大鼠頭部頂顳前斜線上，手持鍉針進(jìn)行垂直點(diǎn)按，力度控制在5 N 左右，停留5 s，間隔3 s，每次10 min，每天1次，時(shí)間均連續(xù)2 周。

1.5 腦神經(jīng)功能評(píng)價(jià) 根據(jù)Zea Longa 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[6]：0 分為無神經(jīng)損傷癥狀；1 分為無法完全伸展對(duì)側(cè)前爪或后爪；行走時(shí)向手術(shù)對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈為2 分；3 分為行走時(shí)向手術(shù)對(duì)側(cè)傾倒；4 分為不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。分別在造模后及治療結(jié)束后各評(píng)分1 次。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.6.1 HE 染色 神經(jīng)功能評(píng)分測(cè)試后，各組隨機(jī)抓取2只大鼠，10%水合氯醛（0.35 mL/ 100 g）腹腔注射麻醉，灌注后整個(gè)大腦被迅速取出并儲(chǔ)存于4%多聚甲醛中24～48 h；取中央前回2 mm 的左側(cè)大腦皮層組織，固定、脫水、石蠟包埋，連續(xù)切4 μm 薄片，60 ℃烤片2h 備用。

1.6.2 TTC 染色 2 周后，取腦組織，冠狀切片，加入1%2，3，5-三苯基四氮唑的磷酸緩沖液，計(jì)算腦梗死面積。腦梗死面積=（白色的梗死面積/片子的總面積）×100%。

1.6.3 Western Blot、Q-PCR 檢測(cè)各組大鼠腦組織皮層BDNF、BDNFmRNA 表達(dá)變化 2 周后，斷頭處死各組剩余4 只大鼠，梗死側(cè)皮質(zhì)在冰盤上迅速取出，液氮速凍，-80 ℃保存，等待檢測(cè)BDNFmRNA及蛋白表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS 19.0進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，t檢驗(yàn)比較組間差異，計(jì)數(shù)資料以n（%）表示。統(tǒng)計(jì)圖用Graph Pad prism 6 軟件繪制。

2 結(jié)果

2.1 組間神經(jīng)功能評(píng)分比較 見表1。

表1 組間神經(jīng)功能評(píng)分比較（，n=8）

表1 組間神經(jīng)功能評(píng)分比較（，n=8）

注：與假手術(shù)組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜ 0.05

2.2 組間腦梗死面積比較 見表2，圖1。

表2 組間腦梗死面積比較（，n=8）

表2 組間腦梗死面積比較（，n=8）

注：與假手術(shù)組比較，# P ＜ 0.05；與模型組比較，△P ＜ 0.05

2.3 組間腦組織病理學(xué)形態(tài)比較 見圖2。與模型組相比較，腦組織結(jié)構(gòu)在假手術(shù)組與治療組相對(duì)完整，細(xì)胞形態(tài)較正常，增殖明顯，而腦組織在模型組結(jié)構(gòu)疏松，腦膜不完整，神經(jīng)元細(xì)胞形狀不規(guī)則，胞核固縮深染，可見大量不規(guī)則空洞。

圖2 各組大鼠腦組織病理學(xué)形態(tài)比較

2.4 組間BDNF 蛋白水平比較 見表3，圖3。

表3 組間BDNF 蛋白水平比較（，n=8）

表3 組間BDNF 蛋白水平比較（，n=8）

注：與假手術(shù)組比較，# P ＜ 0.05；與模型組比較，△P ＜ 0.05

圖3 各組大鼠BDNF 蛋白水平比較

2.5 組間BDNF mRNA 水平比較 見表4。

表4 組間BDNF mRNA 水平比較（，n=8）

表4 組間BDNF mRNA 水平比較（，n=8）

注：與假手術(shù)組比較，# P ＜ 0.05；與模型組比較，△P ＜ 0.05

3 討論

卒中發(fā)病突然，我國腦卒中發(fā)病率據(jù)2019 年全球疾病負(fù)擔(dān)研究數(shù)據(jù)顯示為39.9%[7]，缺血性卒中發(fā)生發(fā)展過程中，腦組織局部血流供應(yīng)受阻，缺血、缺氧導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡或發(fā)生不可逆壞死，這是造成中風(fēng)患者神經(jīng)功能障礙的主要病理基礎(chǔ)。大量研究表明，海馬和皮層中高表達(dá)腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子[8]，腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子及其下游通路可促進(jìn)受損神經(jīng)的神經(jīng)元生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、軸突樹突生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)突觸可塑性以及再生修復(fù)等[9]。此外，缺血性卒中后腦組織一氧化氮合酶能被腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子抑制，從而減輕神經(jīng)元遭受自由基的損傷程度[10]。

在缺血缺氧腦病病程早期，腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子可通過影響轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合DNA 的活性或激活特定的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來保護(hù)神經(jīng)元免受氧化應(yīng)激損傷，隨著缺血缺氧腦病的進(jìn)展，會(huì)引起腦神經(jīng)發(fā)育障礙，進(jìn)而對(duì)腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子的表達(dá)和分泌造成不利影響，導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)元損傷[11-12]。

《內(nèi)經(jīng)》曰：“其有三虛而偏于邪風(fēng)，則為擊仆偏枯矣”，首次提出腦梗死這一病名，在《醫(yī)學(xué)綱目》中，首次出現(xiàn)卒中這一病名的描述癥狀以突然昏倒，不省人事，口舌渦斜，半身不遂，言語蹇澀為主，與腦梗死癥狀相似。虛、火、風(fēng)、痰、氣、血在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中認(rèn)為是中風(fēng)的主要病因病機(jī)，本虛標(biāo)實(shí)貫穿疾病始終。頭部腧穴治療腦梗死，《靈樞·五亂》曰：“氣亂頭則為逆，蘇醒免災(zāi)危”，是對(duì)頭部相關(guān)腧穴治療中風(fēng)的早期描述，《靈樞·熱病》曰：“偏枯，身偏不用而痛……益其不足，損其有余”，界定中風(fēng)病的實(shí)則瀉之，虛則補(bǔ)之的治療原則。

《靈樞·九針十二原》：“鍉針，長(zhǎng)三寸半?！盵13]《內(nèi)經(jīng)》記載其起源于夏、商、周時(shí)代，到了春秋戰(zhàn)國時(shí)期基本發(fā)展成型[14]?！夺樉募伞ぶ凭裴樂ā吩唬骸懊}氣虛少宜鍉針?！笔菍?duì)鍉針的用途作進(jìn)一步注釋?！鹅`樞·官針第七》載：“三者人也，人之所以成生者血脈也?！盵15]古人將鍉針比作人部，人體的生命活動(dòng)皆有賴于血脈的濡養(yǎng)，鍉針尖圓潤，不傷血脈，用以疏通脈痹正宜。

“頭為諸陽之會(huì)，元神之府”，解剖上，中醫(yī)認(rèn)為“腦為髓之?！?，頭部點(diǎn)按區(qū)域正好位于腦缺血病灶附近，對(duì)于腦梗死的治療更為直接；生理上，“百脈之氣皆歸于頭”，全身經(jīng)脈血?dú)舛紖R聚于頭腦空竅，針刺或點(diǎn)按頭部腧穴功能區(qū)可通過神經(jīng)、血管、內(nèi)分泌等機(jī)制間接作用到梗死的腦組織，從而發(fā)揮快速有效的治療作用，如王順等[16]認(rèn)為頭針起效的主要機(jī)制是頭針可以誘發(fā)顱內(nèi)相應(yīng)皮質(zhì)區(qū)產(chǎn)生動(dòng)態(tài)電位（MEP）。吳緒平等[17]研究表明，頭穴透刺可減輕腦缺血患者腦水腫程度，主要是通過降低腦內(nèi)β-內(nèi)啡肽含量，對(duì)病灶區(qū)腦組織起到治療作用。于氏[18]認(rèn)為人體一身之經(jīng)絡(luò)皆匯聚于頭部，刺激特定的頭皮區(qū)域既能調(diào)理經(jīng)絡(luò)氣血，又能直接作用于病損皮層，改善微循環(huán)，提高供血供氧，這種刺激可改善缺血性半暗帶區(qū)域腦組織神經(jīng)元缺血缺氧的狀態(tài)[19]。

《頭皮針穴名國際標(biāo)準(zhǔn)化方案》通過后，很多學(xué)者致力于頭針的機(jī)理機(jī)制研究[20]。頂顳前斜線在生理解剖結(jié)構(gòu)上，又與大腦中央前回相對(duì)應(yīng)，而此區(qū)功能又與肢體痙攣的治療相對(duì)應(yīng)，故點(diǎn)按此區(qū)域，刺激頭皮可以直接作用于其下的大腦皮層，能夠激活Trk B信號(hào)傳導(dǎo)，腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子聯(lián)合Trk B 等保護(hù)神經(jīng)元，減輕神經(jīng)元損傷。

基于國醫(yī)大師任繼學(xué)和石學(xué)敏院士的學(xué)術(shù)思想，從“腦損絡(luò)傷”的病機(jī)出發(fā)，故以鍉針點(diǎn)按頭部頂顳前斜線功能區(qū)為主，通脈活血、補(bǔ)益臟腑、平衡陰陽，進(jìn)而起到調(diào)暢全身陰陽經(jīng)脈氣血的作用，使得筋脈自柔的同時(shí)又能補(bǔ)瀉經(jīng)氣，促進(jìn)中風(fēng)后恢復(fù)。

本研究結(jié)果表明：鍉針點(diǎn)按治療在腦缺血模型大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分、腦梗死面積、腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子蛋白和mRNA 含量方面有顯著作用（P＜0.05）。