川芎-防風(fēng)藥對通過抗氧化改善大鼠腦缺血再灌注損傷

毛明江，李秋穎，鄭燕飛，翁志偉，羅 杰，郭 瑩

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053）

缺血性腦卒中具有發(fā)病率高等特點，是導(dǎo)致死亡和長期致殘的主要原因之一［1]，給家庭和社會帶來沉重的負擔(dān)［2]，因此，探尋治療腦缺血的有效藥物迫在眉睫。中醫(yī)多以中藥配伍的形式進行疾病的防治［3-4]，藥對是最簡單的中藥配伍形式，被歷代醫(yī)家廣泛應(yīng)用。近年來，在腦缺血損傷的防治研究中發(fā)現(xiàn)，中藥藥對的合理運用，可實現(xiàn)中藥復(fù)方的優(yōu)化組合，明顯減輕缺血半暗帶腦組織的損傷以及腦缺血再灌注引起的損傷［5-6]。

川芎（Ligusticum wallichii）具有活血化瘀［7]、抗氧化、神經(jīng)保護［8]等作用，廣泛用于腦缺血的治療，療效確切。防風(fēng)為傘形科植物防風(fēng)Saposhnikovia divaricata（Turcz.）Schisck 的干燥塊根，具有解表祛風(fēng)、抗炎抗菌、活血化瘀［9]、抗氧化［10]等作用。前期研究中，對中華醫(yī)典5.0 系統(tǒng)中治療腦中風(fēng)的古代方劑進行頻數(shù)分析和關(guān)聯(lián)分析，川芎-防風(fēng)為古代治療腦中風(fēng)的最常用藥對之一［11]。目前對于川芎-防風(fēng)藥對配伍治療腦中風(fēng)的實驗研究尚未見報道，兩者是否存在協(xié)同作用？協(xié)同作用機制如何？是目前要探究的關(guān)鍵問題。本研究從川芎-防風(fēng)藥對體外抗氧化及體內(nèi)抗腦缺血性損傷兩方面開展實驗，探究兩者是否通過清除自由基和抗氧化作用協(xié)同起效。

1 材料

1.1 動物 SPF 級SD 大鼠，雄性，體質(zhì)量（280±20）g，購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心，實驗動物使用許可證號SYXK（浙）2018-0012。

1.2 藥物與試劑 川芎、防風(fēng)（浙江天道醫(yī)藥有限公司；批號分別為181003、180902）；95%乙醇（無錫市晶科化工有限公司，分析純，批號20170502）；1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH，上海 源葉生物科技有限公司，批號W10A8E33599）；超氧化物歧化酶（SOD，批號20181029）、丙二醛（MDA，批號20181029）、乳酸（LD，批號20181107）、乳酸脫氫酶（LDH，批號20181031）、蛋白定量檢測試劑盒（批號20181018）、2，3，5-三苯基氯化四氮唑（2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride，TTC，批號BCBR5462）均購自南京建成生物工程研究所；其余試劑均為分析純。

1.3 儀器 HWS26 電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；RE-52 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海嘉鵬科技有限公司）；Spectra Max M3 酶標儀（美國MD 公司）。

2 方法

2.1 川芎、防風(fēng)單用及合用對DPPH 自由基清除率的影響

2.1.1 供試品溶液的配制 精密稱取川芎、防風(fēng)單煎及合煎所用藥材5 g，單煎和合煎組中川芎和防風(fēng)的質(zhì)量配比分別為0∶1、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、1∶0，分別加入70% 乙醇50 mL，80 ℃回流提取1 h，濾過，即得（0.1 g/mL）。

2.1.2 DPPH 自由基清除率測定 分別精密移取“2.1.1”中的供試品溶液800 μL，加入70%乙醇至2 mL，混勻，稀釋2.5 倍，精密移取20 μL 于96 孔板中，再加入180 μL 50 mg/mL DPPH 溶液，以70%乙醇作空白對照，避光反應(yīng)30 min，于517 nm 處測定吸光度，計算清除率，公式為［（OD2-OD1）/（OD2-0.036）] ×100%，其中OD1為樣品與DPPH 反應(yīng)后在517 nm 處的吸光度，OD2為70%乙醇與DPPH 反應(yīng)后在517 nm 處的吸光度。

2.1.3 精密度試驗 精密移取上述供試品溶液各20 μL，加入DPPH，按“2.1.2”項下方法于517 nm 波長處測定吸光度，計算清除率，結(jié)果見表1，可知儀器精密度良好。

表1 酶標法精密度試驗結(jié)果

2.1.4 穩(wěn)定性試驗 精密移取上述供試品溶液各20 μL，于0、2、4、6 h 按“2.1.2”項下方法在517 nm 波長處測定吸光度，計算清除率，結(jié)果見表2，可知6 h 內(nèi)樣品穩(wěn)定性良好。

表2 酶標法穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.2 川芎、防風(fēng)單用及合用對大鼠腦缺血再灌注損傷的影響

2.2.1 分組與給藥 分別稱取川芎90 g、防風(fēng)90 g、川芎和防風(fēng)各45 g，70%乙醇浸泡30 min 后回流提取2 次，提取液濃縮至0.4 g/mL。將60 只雄性SD 大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、川芎組（4 g/kg）、防風(fēng)組（4 g/kg）、川芎防風(fēng)合用組（4 g/kg），每組12 只，再灌注同時灌胃給藥，每天1 次，連續(xù)7 d，假手術(shù)組和模型組灌胃等量的生理鹽水。

2.2.2 大鼠大腦中動脈栓塞模型（MCAO）的建立 將稱重后的大鼠用10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉，Longa 線栓法［12]制備MCAO 模型。缺血1 h 后松開動脈夾行再灌注，若蘇醒后的大鼠出現(xiàn)同側(cè)Honor 癥和對側(cè)前肢提爪，則表示造模成功。

2.2.3 大鼠神經(jīng)功能評分 參考Longa［12]5 分制評分標準，在大鼠再灌注第7 天觀察并記錄神經(jīng)功能缺損癥狀，再進行評分。

2.2.4 大鼠腦梗死率計算 第8 天大鼠斷頭取腦，用生理鹽水漂洗，吸干表面的水分并速凍20 min，作冠狀切片，TTC 溶液38 ℃孵育10 min，利用Image J 軟件計算腦梗死面積和全腦面積，計算出腦梗死面積百分比，腦梗死面積百分比=（梗死面積/全腦面積）×100%。

2.2.5 腦缺血氧化損傷相關(guān)指標檢測 取大鼠缺血側(cè)腦組織制備10%組織勻漿，3 000 r/min 離心10 min，取上清液，按照試劑盒說明書測定腦組織SOD、MDA、LD、LDH水平。

2.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0 軟件進行分析，數(shù)據(jù)以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD 檢驗。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 川芎、防風(fēng)單用及合用對DPPH 自由基清除率的影響如圖1 所示，在8～26.8 mg/mL 范圍內(nèi)，川芎對DPPH自由基的清除率隨川芎比例增加而逐漸增大，隨后保持穩(wěn)定；在13.2～32 mg/mL 范圍內(nèi)，防風(fēng)對DPPH 自由基的清除率隨防風(fēng)比例增加而逐漸增大；川芎防風(fēng)比例為1∶4、1∶3、1∶2、1∶1 時，對DPPH 清除率具有較好的協(xié)同作用，其中以1∶2、1∶1 時協(xié)同作用更為明顯。

圖1 各組DPPH 清除率（n=3）

3.2 各給藥組對腦缺血大鼠神經(jīng)功能和腦梗死面積百分比的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能評分及腦梗死面積百分比增加；給藥組可改善神經(jīng)功能缺損癥狀，降低腦梗死面積百分比（P＜0.01）；合用組優(yōu)于川芎組、防風(fēng)組（P＜0.01）。見圖2、表3。

表3 各組大鼠神經(jīng)功能評分及腦梗死面積百分比（）

表3 各組大鼠神經(jīng)功能評分及腦梗死面積百分比（）

注：與假手術(shù)組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與川芎組比較，△△P＜0.01；與防風(fēng)組比較，☆☆P＜0.01。

圖2 TTC 染色后各組腦切片

3.3 腦組織中腦缺血氧化應(yīng)激指標

3.3.1 各組大鼠腦組織中SOD 水平 如圖3 所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中SOD 水平降低（P ＜0.01）；與模型組比較，給藥組SOD 水平升高（P＜0.01）；與防風(fēng)組比較，合用組SOD 水平升高（P＜0.05）。

圖3 各組大鼠腦組織中SOD 水平（n=9）

3.3.2 各組大鼠腦組織中MDA 水平 如圖4 所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中MDA 水平升高（P ＜0.01）；與模型組比較，給藥組MDA 水平降低（P＜0.01）；與防風(fēng)組比較，合用組MDA 水平降低（P＜0.05）。

圖4 各組大鼠腦組織中MDA 水平（n=9）

3.3.3 各組大鼠腦組織中LDH 水平 如圖5 所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中LDH 水平升高（P ＜0.01）；與模型組比較，給藥組LDH 水平降低（P＜0.01）；與防風(fēng)組和川芎組比較，合用組LDH 水平降低（P ＜0.05）。

圖5 各組大鼠腦組織中LDH 水平（n=9）

3.3.4 各組大鼠腦組織中LD 水平 如圖6 所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中LD 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，給藥組LD 水平降低（P＜0.01）；與川芎組和防風(fēng)組比較，合用組LD 水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖6 各組大鼠腦組織中LD 水平（n=9）

4 討論

DPPH 是一種穩(wěn)定的深紫色自由基，通過測定待測物質(zhì)與DPPH 反應(yīng)后顏色變淺程度來反映該物質(zhì)清除自由基的能力和抗氧化能力［13]。川芎-防風(fēng)比例為1∶2 和1∶1時，兩者合用對DPPH 自由基的清除表現(xiàn)出較好的協(xié)同作用，表明川芎-防風(fēng)在這兩種配伍比例下具有較好的體外抗氧化協(xié)同作用，可為動物體內(nèi)實驗提供配伍比例依據(jù)。

腦缺血再灌注損傷是一個復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)過程，其發(fā)生機制由多種因素共同參與，如過多自由基生成、凋亡基因激活、炎癥反應(yīng)等一系列病理變化，各因素相互影響，最終導(dǎo)致細胞凋亡或壞死，出現(xiàn)腦神經(jīng)功能缺損等癥狀［2]。腦缺血再灌注發(fā)生時，局部缺血引發(fā)了活性氧簇的大量產(chǎn)生［14]。SOD 為人體最重要的抗氧化酶之一，過多的氧自由基會消耗大量的SOD，使其活性降低。SOD 活性下降可導(dǎo)致腦內(nèi)氧自由基大量堆積，進而攻擊生物膜中不飽和脂肪酸，導(dǎo)致MDA（脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物）大量產(chǎn)生［15-17]，從而使機體氧化功能紊亂。LDH 是一種和葡萄糖代謝相關(guān)的酵素，廣泛存在于身體器官組織中。腦缺血發(fā)生時，細胞膜因受到損傷而通透性增加，LDH 釋放到膜外。由于氧供應(yīng)被阻斷，腦組織細胞只能通過無氧代謝獲取能量，產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物L(fēng)D［18]。

腦缺血動物實驗表明，川芎、防風(fēng)及合用均可改善腦缺血大鼠神經(jīng)功能的缺損癥狀、降低腦梗死率、提高腦組織中SOD 水平，降低MDA、LD 和LDH 水平，且川芎-防風(fēng)合用在抗大鼠腦缺血再灌注損傷方面具有一定的協(xié)同效果，其機制可能與清除自由基發(fā)揮抗氧化作用有關(guān)。