玉竹多糖對高脂飲食誘導的大鼠肥胖和非酒精性脂肪肝的作用

朱 琪，李庚喜，曾 立，伍世清

（邵陽學院藥學院，湖南 邵陽 422000）

非酒精性脂肪肝（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的特征是在沒有飲酒史的前提下，肝臟脂肪變性，許多研究顯示肥胖會顯著增加NAFLD 的發(fā)生率［1]。隨著生活節(jié)奏的加快和飲食習慣的改變，肥胖癥等慢性病患者迅速增加，這引發(fā)了全球公共衛(wèi)生工作者對現(xiàn)代社會健康問題的關(guān)注［2]。此外，NAFLD 和肥胖是許多代謝疾病的重要誘發(fā)因素，例如2 型糖尿病、心血管疾病、非酒精性脂肪肝炎、肝硬化和癌癥，因此，尋找一種安全和有效的治療方法已成為公共衛(wèi)生目標［3]。

玉竹具有養(yǎng)陰潤燥、生津止渴的功效［4]，玉竹多糖是其主要功效成分之一，由D-果糖、D-甘露糖、D-葡萄糖及半乳糖醛酸組成［5]。已有研究報道，玉竹多糖具有抗氧化、抗糖尿病和增強免疫活性等功能［6-8]，但關(guān)于它對改善肥胖以及非酒精性脂肪肝癥狀的機制研究報道不多。本研究通過建立高脂飲食誘導的肥胖模型大鼠，從體質(zhì)量、血脂參數(shù)、肝功能酶、肝臟氧化應激、炎癥因子和肝臟病理研究等多角度出發(fā)，探究玉竹多糖改善高脂飲食誘導的大鼠肥胖癥狀和預防NAFLD，以期為開發(fā)相關(guān)功能產(chǎn)品提供參考。

1 材料

1.1 動物 SPF 級雄性SD 大鼠40 只，體質(zhì)量145～160 g，來自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（湘）2016-0002，分籠飼養(yǎng)，自由飲水進食。高脂飲食參照《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范-輔助降血脂功能評價方法》（2012 年修訂），配方為基礎(chǔ)飲食63.6%、蔗糖20.0%、豬油15.0%、膽固醇1.2%、膽酸鈉0.2%。

1.2 藥物與試劑 玉竹多糖購自于蘭州沃特萊斯科技有限公司（批號WTLS-010），純度≥30%，再采用水提醇沉法，經(jīng)Sevag 分離純化制得［9]，采用苯酚硫酸法測得樣品中總糖質(zhì)量分數(shù)約58%。甘油三酯（Triglyceride，TG，批號20180324）、總膽固醇（Total cholesterol，TC，批 號20180412）、高密度脂蛋白膽固醇（High density lipoprotein cholesterol，HDL-C，批號20180323）、低密度脂蛋白膽固醇（Density lipoprotein cholesterol，LDL-C，批號20180330）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Alanine aminotransferase，ALT，批號20180403）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate transaminase，AST，批號20180403）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD，批號20180415）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA，批號20180420）、抗過氧化物酶（Catalase，CAT，批號20180420）和谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px，批號20180416）等試劑盒購自南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor，TNF-α，貨號EK0526）和白細胞介素-6（（Interleukin 6，IL-6，貨號EK0412）等ELISA 試劑盒購自于武漢博士德生物工程公司；總RNA 提取試劑盒（貨號9767）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號RR047A）、RT-PCR 試劑盒（貨號RR820A）購于日本TakaRa 公司；引物購于廣州擎科生物技術(shù)有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒（貨號P0009）購于上海碧云天生物技術(shù)公司；p-p65 蛋白抗體（貨號8242S）購于美國CST 公司；二抗（貨號ab20272）購于英國Abcam 公司；ECL 發(fā)光劑（貨號29050）購于北京英格恩生物有限公司。

1.3 儀器 多功能酶標儀（美國賽默飛世爾科技公司）；MIKRO22R 型臺式冷凍離心機（德國Hettich 公司）；電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；冷凍干燥機（廣州三元科技有限公司）；PowerGen 125 高速勻漿機（中國賽默飛世爾科技公司）；7060 全自動生化分析檢測儀（日本Hitachi 公司）；移液槍（美國Thermo 公司）；病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）；FluorChem FC2 化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（南京非同科學儀器有限公司）；Applied Biosystems 實時熒光定量PCR 儀器（美國賽默飛世爾科技公司）。

2 方法

2.1 大鼠肥胖模型建立 將40 只大鼠適應性飼養(yǎng)7 d，正常組8 只和高脂飲食組32 只。正常組正常飲食，高脂飲食組喂食高脂飲食。喂養(yǎng)4 周后，從高脂飲食組中選擇24 只肥胖大鼠進一步灌胃玉竹多糖。肥胖模型大鼠的標準是高脂飲食組大鼠體質(zhì)量比正常組平均體質(zhì)量至少多20%。

2.2 分組、給藥 正常組中的8 只大鼠通過管飼法用蒸餾水進行處理，32 只肥胖大鼠喂食高脂飲食分別為模型組，玉竹多糖低劑量組（200 mg/kg）、玉竹多糖中劑量（400 mg/kg）、玉竹多糖高劑量組（600 mg/kg）。正常組喂食普通飲食，其余4 組喂食高脂飲食。各組大鼠每日灌胃1 次，持續(xù)給藥6 周。在實驗結(jié)束前禁食12 h，所有大鼠用戊巴比妥鈉麻醉后立即從腹主動脈抽取血液，分離血清離心，解剖收集肝臟、腎周脂肪，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 檢測指標

2.3.1 體質(zhì)量、腎周脂肪質(zhì)量 大鼠體質(zhì)量每7 d 稱重1次，處死后解剖得到腎周白色脂肪組織，并稱重記錄。

2.3.2 血清脂質(zhì)水平 將收集的血液靜置45 min 后，3 000×g 離心15 min 分離血清。血清TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平按照試劑盒說明方法檢測。

2.3.3 肝功能指標 按照試劑盒說明書方法，采用自動生化分析儀測量血清中ALT 和AST 的水平。

2.3.4 肝臟氧化指標 按照肝臟∶生理鹽水（1 g∶9 mL）制備肝臟組織勻漿液，離心之后取上清液，按照試劑盒說明書方法，測定SOD、CAT、GSH-Px、MDA 水平。

2.3.5 組織病理學分析 大鼠肝臟病理切片制備。隨機取3 只大鼠肝臟同一部位，4%多聚甲醛固定液固定。標本石蠟包埋，將切片置于油紅O 染液中10 min，用自來水沖洗30 min，甘油封片。將制備好的切片放在100×光學顯微鏡下攝像并觀察染色情況，評價其脂質(zhì)積累程度。

2.3.6 肝臟炎癥因子TNF-α 和IL-6 mRNA 表達 提取肝臟組織的總RNA，將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，qRT-PCR 檢測炎癥因子TNF-α 和IL-6 mRNA 基因表達。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.3.7 肝臟炎癥因子TNF-α 和IL-6 釋放及p-p65 蛋白表達按照ELISA 試劑盒提供的說明方法，采用酶標儀測量肝組織TNF-α 和IL-6 釋放量。將收集的肝臟組織提取總蛋白，并將配制好的一抗（1∶1 000）和二抗（1∶10 000）進行免疫印跡，以GAPDH 作為內(nèi)參。顯影后，計算光密度值。

2.4 統(tǒng)計學分析 以GraphPad Prism 7 軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)采用（）表示，組間比較采用t 檢驗和單因素方差分析。 P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 不同劑量的玉竹多糖對肥胖大鼠體質(zhì)量及腎周脂肪的影響 通常肥胖產(chǎn)生的過程中往往伴隨著白色脂肪的增多，具體表現(xiàn)為白色脂肪質(zhì)量增加［10]，而腎周脂肪組織是典型的白色脂肪組織，大鼠體質(zhì)量變化結(jié)合腎周脂肪重量的變化更能有效判斷肥胖。由圖1 可知，與正常組相比，高脂飲食大鼠的體質(zhì)量和腎周脂肪質(zhì)量均提高（P＜0.01），與模型組相比，中劑量玉竹多糖組可降低體質(zhì)量（P＜0.05），高劑量玉竹多糖組降低體質(zhì)量（P＜0.01），低、中、高劑量玉竹多糖組均降低腎周脂肪質(zhì)量（P＜0.01）。

圖1 玉竹多糖對大鼠體質(zhì)量及腎周脂肪質(zhì)量的影響（，n=8）

3.2 不同劑量的玉竹多糖對大鼠血脂生化指標的影響 由圖2 可知，與正常組比較，模型組大鼠血清TC、TG 和LDL-C 水平增高（P＜0.01），HDL-C 水平下降（P＜0.01），表明造模成功；與模型組比較，低、高劑量玉竹多糖組大鼠血清TC 水平降低（P＜0.01），低、中、高劑量玉竹多糖組大鼠血清TG 水平降低（P＜0.01），高劑量玉竹多糖組大鼠血清LDL-C 水平下降（P＜0.05），HDL-C 水平上升（P＜0.05）。

圖2 玉竹多糖對大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C 水平的影響（，n=8）

3.3 不同劑量的玉竹多糖對大鼠肝功能酶的影響 由表2 可知，模型組大鼠的ALT 和AST 水平高于正常組（P＜0.01），說明高脂飲食組大鼠發(fā)生肝功能損傷；在玉竹多糖的干預下，肥胖大鼠的ALT 和AST 水平均低于模型組（P＜0.01）。

表2 玉竹多糖對大鼠AST 和ALT 水平的影響（，n=8）

表2 玉竹多糖對大鼠AST 和ALT 水平的影響（，n=8）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

3.4 不同劑量的玉竹多糖對大鼠肝臟抗氧化酶活性（SOD、CAT 和GSH-Px）和過氧化產(chǎn)物MDA 水平的影響 如圖3 所示，與正常組比較，模型組MDA 水平升高，抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）水平降低（P＜0.01）；經(jīng)玉竹多糖處理后，高劑量組MDA 水平降低（P＜0.05），低、中、高劑量組均能提高抗氧化酶水平（P＜0.05，P＜0.01）。

圖3 玉竹多糖對大鼠肝臟抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-Px）活性和過氧化產(chǎn)物（MDA）水平的影響（，n=8）

3.5 不同劑量玉竹多糖對大鼠肝臟脂質(zhì)積累的影響 由圖4 可知，正常組大鼠肝臟切片未發(fā)現(xiàn)明顯脂滴；與正常組比較，模型組大鼠肝臟切片出現(xiàn)明顯脂肪變性，脂滴增加明顯。隨著玉竹多糖干預劑量的增加，脂滴明顯減少，其中高劑量玉竹多糖的脂滴減少更明顯，這進一步表明玉竹多糖能夠改善高脂飲食誘導的大鼠肝臟脂質(zhì)積累。

圖4 玉竹多糖對大鼠肝臟脂質(zhì)積累的影響（×100）

3.6 不同劑量的玉竹多糖對大鼠肝臟中TNF-α 和IL-6 mRNA 表達的影響 由圖5 可知，模型組較正常組肝臟中炎癥因子TNF-α 和IL-6 mRNA 表達增加（P＜0.01）；玉竹多糖干預后，上述炎癥因子mRNA 表達均有不同程度的降低，呈劑量依賴型，表明玉竹多糖能夠下調(diào)肥胖大鼠肝臟組織的炎癥因子TNF-α 和IL-6 mRNA 的表達。

圖5 玉竹多糖對大鼠肝臟中炎癥因子TNF-α、IL-6 mRNA 表達的影響（，n=8）

3.7 不同劑量的玉竹多糖對大鼠肝臟中TNF-α、IL-6 以及p-p65 蛋白表達的影響 如圖6 所示，與正常組相比，模型組大鼠肝臟中TNF-α、IL-6 及p-p65 蛋白表達增加（P ＜0.01）；玉竹多糖處理后，TNF-α、IL-6 及p-p65 蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01），且隨著其劑量增加，p-p65 的蛋白表達逐漸降低，可能與下調(diào)NF-κB 信號通路、抑制促炎因子TNF-α 和IL-6 的蛋白和mRNA 表達有關(guān)。

圖6 玉竹多糖對大鼠肝臟中炎癥因子TNF-α、IL-6、p-p65 蛋白表達的影響（，n=8）

4 討論

流行病學的研究表明，NAFLD 是全球最常見的慢性肝?。?1]。隨著國民物質(zhì)生活水平的提高，我國的肥胖患者數(shù)量迅速增加，肥胖所引起的NAFLD 的發(fā)病率呈快速增長趨勢［12]。血脂（包括甘油三酯與高、低密度脂蛋白）異常是肥胖患者常見的代謝標志之一［13]，血脂水平能夠反映全身性的脂質(zhì)代謝狀態(tài)［14]。如今，高熱量飲食習慣的流行，飲食中攝入的脂肪增加，體內(nèi)的游離脂肪酸增多，積聚的甘油三酯也逐漸增多，一旦超過了肝臟存儲的極限，將會產(chǎn)生有毒的脂質(zhì)代謝物，這些代謝物又會導致肝損傷或肝功能障礙［15]，因此本試驗中檢測血脂TC、TG、LDL-C 和HDL-C 和大鼠肝臟切片油紅O 染色來探究肥胖大鼠中脂肪聚集程度和NAFLD 損傷程度。在高脂飲食誘導的肥胖大鼠的過程中，由于肝臟積累了甘油三酯和游離脂肪酸，會產(chǎn)生過多的活性氧（ROS），體內(nèi)的自由基代謝平衡主要是通過抗氧化系統(tǒng)維持，主要包括SOD、GSH-Px 和CAT 等［16]。MDA 是脂質(zhì)過氧化物降解的主要產(chǎn)物，不僅能夠阻止線粒體的呼吸鏈電子傳遞，還能促進炎癥反應，因此促進肝臟內(nèi)抗氧化酶活性（SOD、CAT 和GSH-Px）和抑制過氧化產(chǎn)物MDA 含量可以促進脂質(zhì)代謝，預防肥胖所致NAFLD［17]。許多流行病學研究表明，肥胖與肝損傷風險增加有關(guān)［18]。肥胖使肝細胞易于發(fā)生脂質(zhì)過氧化的同時，還會炎癥變性，從而增加NAFLD、肝纖維化、肝硬化甚至肝細胞癌的可能性［19]。AST 和ALT 是肝臟代謝和轉(zhuǎn)運功能的常見指標，一旦肝功能受損，其血清水平可顯著升高［20]。世界衛(wèi)生組織（WHO）把ALT 作為肝功能損傷最靈敏的測定指標［21]，因為1% 的肝細胞發(fā)生壞死時，血清中ALT 含量就會上升1倍［22]。已有研究表明，脂肪組織與炎癥細胞之間存在密切關(guān)系［18]。肥胖往往會引起慢性炎癥，可進一步造成全身性的炎癥狀態(tài)，造成代謝障礙，從而加快肥胖的進程［23]?！肮粜浴毖仔约毎蜃樱ㄈ鏣NF-α、IL-6 等）的無序生成通常與代謝綜合征的發(fā)病機制密切相關(guān)，而NF-κB 是機體內(nèi)調(diào)控促炎細胞因子（TNF-α、IL-6 等）的轉(zhuǎn)錄與合成的關(guān)鍵調(diào)控因子［24]。所以，通過NF-κB 信號通路調(diào)節(jié)機體免疫炎性反應，可以積極改善肥胖所致NAFLD［19，24]。

本研究顯示，與正常組相比，模型組出現(xiàn)了許多與肥胖相關(guān)癥狀，包括NAFLD、高脂血癥、肝功能損傷、氧化還原狀態(tài)失衡和炎癥。玉竹多糖處理組在減輕體重，血脂，氧化應激和脂肪源性和炎性細胞因子方面發(fā)揮了重要作用。在玉竹多糖干預下，肥胖大鼠的體重和腎周脂肪質(zhì)量均有不同程度的降低，其中高劑量組的玉竹多糖效果最好（P＜0.05）；肥胖大鼠的血清中TC、TG 和LDL-C 的水平減少，而HDL-C 水平增多，尤其是高劑量組效果明顯（P＜0.05）；低、中和高劑量的玉竹多糖均極顯著降低了高脂飲食誘導的肥胖大鼠的血清ALT 和AST 水平（P＜0.01）；結(jié)合大鼠肝臟組織切片的油紅O 染色發(fā)現(xiàn)，高脂飲食組脂滴明顯高于正常組，并且隨著玉竹多糖濃度的增加，其脂滴數(shù)量明顯減少，肥胖大鼠肝臟脂質(zhì)積累現(xiàn)象得到顯著改善；不同劑量的玉竹多糖不僅能夠提升抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）水平，降低機體內(nèi)的MDA 水平，且呈劑量效應；玉竹多糖下調(diào)了肥胖大鼠肝臟組織的炎癥因子TNF-α 和IL-6 mRNA 的表達，降低TNF-α 和IL-6 的釋放量和p-p65 的蛋白表達。其中，中濃度和高濃度玉竹多糖抑制p65 的磷酸化的效果越來越好。玉竹多糖抑制TNF-α 和IL-6 的釋放的機制可能與抑制NF-κB（p65）磷酸化，下調(diào)促炎因子TNF-α 和IL-6 mRNA 和蛋白表達有關(guān)。

綜上所述，玉竹多糖可有效改善肥胖大鼠的肥胖和NAFLD，其機制可能與調(diào)節(jié)機體免疫反應，維持脂質(zhì)正常代謝，減輕肝臟組織炎癥反應，增強肝功能和降低脂質(zhì)過氧化水平帶來的毒性反應有關(guān)（圖7）。在本實驗濃度范圍內(nèi)，其處理效果與濃度呈正相關(guān)，高劑量組（600 mg/kg）玉竹多糖對肥胖大鼠的治療作用相對最佳。我們的實驗為揭示玉竹多糖減肥和預防NAFLD 疾病作用提供了科學數(shù)據(jù)。但機體內(nèi)信號通路錯綜復雜［25]，玉竹多糖可有效改善肥胖大鼠的肥胖和NAFLD 的分子作用機制可能不是唯一，今后可以結(jié)合基因組學和蛋白組學等分子生物學技術(shù)做進一步的深入研究。

圖7 玉竹多糖對高脂飲食誘導的肥胖大鼠的減肥和預防NAFLD 作用可能的機制