微透析技術(shù)在中藥經(jīng)皮給藥系統(tǒng)中研究進展

雷雅婷張 也蔡 雄黃 丹嚴建業(yè)*李順祥*

（1.湖南中醫(yī)藥大學藥學院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學科技創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410208）

經(jīng)皮給藥系統(tǒng)又稱為透皮吸收系統(tǒng)，是指藥物以恒定速度（或接近恒定速度）進入皮膚，通過體循環(huán)并達到有效血藥濃度對局部或全身起到治療作用的新系統(tǒng)，也是繼口服、注射給藥系統(tǒng)后最有發(fā)展?jié)摿Φ慕o藥系統(tǒng)之一［1-3]。與其他常規(guī)給藥方式相比，該系統(tǒng)可避免肝臟首過效應，提高了生物利用度，并且藥物通過皮膚給藥十分方便，患者順應性良好［4-5]。

由于中藥成分組成復雜、結(jié)構(gòu)多樣，可能同時含有水溶性、脂溶性、揮發(fā)性或大分子、小分子物質(zhì)等，而且其含量經(jīng)皮膚吸收、分布、代謝后會有所降低，導致定性定量分析存在問題［6-7]，為中藥經(jīng)皮吸收研究帶來一定的難度。目前，相關(guān)研究存在局部組織采樣和藥物濃度檢測困難、中藥復方藥效物質(zhì)基礎不明確等問題［8]，其中生物樣品取樣是首要環(huán)節(jié)，會直接影響實驗結(jié)果的準確度和可靠性，常規(guī)方法有測定體內(nèi)血藥濃度、切下給藥后皮膚制勻漿、測定敷貼劑使用后殘留量［9]，但均無法滿足微創(chuàng)、精確定量等要求，也不能反映成分在機體內(nèi)的實時變化。

近年來，微透析技術(shù)作為一種新型生物活體在線取樣技術(shù)，正引起國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。1972 年Delgado等［10]創(chuàng)造了首枚微透析探針，1991 年Anderson 等［11]改進了微透析探針并對乙醇在人體上的經(jīng)皮吸收進行研究，開始真正意義上的經(jīng)皮微透析研究，該技術(shù)可在生物體處于麻醉或正常生命活動的情況下進行在體、實時、在線取樣與檢測，具有活體、微創(chuàng)、微量、實時、動態(tài)等特點，彌補了傳統(tǒng)取樣方法的缺陷。隨著大量靈敏度高、選擇性好的現(xiàn)代分析檢測技術(shù)出現(xiàn)，將其與微透析技術(shù)相結(jié)合時可使后者在中醫(yī)藥領域研究中的應用迅速發(fā)展，從而為中藥經(jīng)皮給藥研究提供更高效、精準、便捷的新途徑，因此在闡明中藥經(jīng)皮給藥后的藥效物質(zhì)基礎、體內(nèi)過程、作用機制、靶向性及進一步指導臨床用藥方面具有優(yōu)勢，在藥動學、藥效學、藥動-藥效學等領域也備受青睞。本文綜述了目前微透析技術(shù)在中藥經(jīng)皮給藥系統(tǒng)的應用，并對其發(fā)展進行了展望。

1 微透析技術(shù)的原理和基本結(jié)構(gòu)

微透析技術(shù)是一種用來收集細胞外液中游離的內(nèi)源性和（或）外源性化合物的生物采樣方法［12]，最初用于研究腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，為神經(jīng)科學領域的一項重要工具［13]。其原理為在生物體內(nèi)埋入具有半透膜的探針，由于灌流液與細胞外液組成接近，滲透壓相同，而藥物在半透膜兩端存在一定的濃度梯度，游離型藥物會順著這一濃度梯度擴散進入探針被灌流液連續(xù)不斷的帶出，而與蛋白結(jié)合的藥物和大分子物質(zhì)均被擋在半透膜外，從而達到活體組織取樣的目的，然后與HPLC、HPLC-MS 等分析檢測系統(tǒng)相連接，即可得到透析液中藥物的濃度［14-15]。

在進行微透析實驗時，收集到的接收液不能直接反應藥物的真實濃度，要得到真實的藥物濃度需要對探針回收率進行校正，探針的校正即回收率的測定，為微透析過程的關(guān)鍵步驟，回收率是指從灌流液中流出的待測組分與標準溶液的濃度之比［16]。目前，測定回收率的方法主要有外標法、內(nèi)標法、反透析法，其中反向微透析法是實際應用最廣，也最為準確，該方法是在灌流液中加入一定濃度的內(nèi)標物，在與體內(nèi)透析相同的條件下進行操作，測定透析液中內(nèi)標物的濃度及體內(nèi)回收率［17]。

微透析系統(tǒng)裝置主要由微量泵、微透析探針、收集器、連接管、分析檢測裝置組成［18]，探針是整個系統(tǒng)的核心，它由半透膜和微徑導液管組成，有線性、環(huán)形、同心型等不同類型，其中同心型探針應用最為普遍，線性探針常用于皮膚組織取樣，實驗時應根據(jù)具體組織和待測物選擇不同類型微透析探針。需要注意的是，微透析探針的透析膜柔軟、較細、易變形，實驗時動作要輕柔，保證透析膜的完整性，以免透析膜破損。目前，微透析設備主要由瑞典CMA 公司、美國BAS 公司、日本EICOM 公司3 家國外企業(yè)供應，而國內(nèi)研發(fā)設備應用較少。

2 微透析技術(shù)的特點

微透析技術(shù)通過創(chuàng)造一個“人造血管”（微透析探針），使體內(nèi)物質(zhì)在濃度差的作用下擴散而出入此“人造血管”，有以下特點［19-22]：（1）損傷輕微，與傳統(tǒng)取樣方法比較對生物體幾乎無損傷，更能體現(xiàn)藥物進入生物體后的變化；（2）與血液樣本比較，微透析取樣得到的組織液中含有經(jīng)透析膜濾過篩選的“信號分子”，可更真實的反應局部的藥物傳遞和新陳代謝情況；（3）微透析探針的透析膜可將蛋白質(zhì)、酶等大分子物質(zhì)截留，透析液可不經(jīng)預處理，直接進行分析；（4）該技術(shù)擁有在體、原位取樣及在線、實時檢測的優(yōu)點，可連續(xù)跟蹤體內(nèi)多種化合物濃度隨時間的動態(tài)變化，使其特別適用于成分多樣、體內(nèi)過程復雜的中藥給藥研究；（5）微透析技術(shù)可作為一種給藥方式將藥物直接作用于靶器官，從而直接觀察、研究藥物的療效；（6）可直接在皮膚部位取樣，獲得藥物及其代謝物變化等信息，亦可進行皮膚和血液同步取樣，來觀察皮膚、血液中藥物的動態(tài)變化，進而更全面反映藥物經(jīng)皮給藥后的局部和全身作用。

3 微透析技術(shù)在中藥經(jīng)皮給藥系統(tǒng)研究中的應用

3.1 皮膚滲透性評價 皮膚屏障功能是人體屏障功能的基礎，能防御外界有害因素的損傷，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)以預防一些皮膚病的發(fā)生，但同時也阻礙了皮膚對藥物的吸收［23-24]。因此，如何穿透皮膚屏障，增加藥物在皮膚的滲透能力與吸收作用是提高經(jīng)皮給藥藥物療效的關(guān)鍵。

Zu 等［25]研究了川芎嗪微乳劑經(jīng)微針預處理后的經(jīng)皮給藥療效，在體外滲透研究中發(fā)現(xiàn)其滲透累積值增加了2倍，Cmax增加了1.25 倍，Tmax降低了0.93 倍，AUC0～t升高了0.88 倍，其機制可能涉及可逆的屏障擾動效應，表明經(jīng)皮微透析技術(shù)也是研究經(jīng)皮吸收的重要工具。Xie 等［26]進行以樟腦為滲透增強劑時在不同親脂性藥物經(jīng)皮給藥中的潛在應用研究，通過細胞毒性實驗、體內(nèi)透皮水分損失測定、體外經(jīng)皮滲透實驗、體內(nèi)皮膚微透析等，發(fā)現(xiàn)它能顯著促進模型藥物的透皮吸收，具有相似的滲透行為，可導致皮膚通透性屏障的改變，是一種安全有效的透皮給藥促透劑，也表明經(jīng)皮微透析可用于皮膚實時藥動學監(jiān)測和皮膚滲透性評價研究。皮膚屏障功能的完好對維持皮膚生理狀態(tài)十分重要，為了克服皮膚障礙，上述實驗考察在可控范圍內(nèi)最小程度影響皮膚屏障功能的促滲透透皮給藥技術(shù)（微針、促透劑）。

3.2 藥動學 藥動學是借助于動力學原理，研究活性成分體內(nèi)吸收、分布、代謝、排泄的動態(tài)變化規(guī)律及其體內(nèi)藥物濃度隨時間變化規(guī)律的一門學科［27]。中藥經(jīng)皮給藥后透過皮膚再吸收入血，通常藥物富集于局部組織或以局部作用為主，靶組織藥物濃度和血藥濃度相關(guān)性較差，傳統(tǒng)藥動學研究只測定血藥濃度，明顯不足以反映藥物體內(nèi)過程［28]。

微透析技術(shù)可同時測定皮下和血液的藥物濃度，采用微透析取樣聯(lián)合HPLC、HPLC-MS 等分析檢測技術(shù)進行藥動學研究時，有助于更加準確地測定體內(nèi)藥代動力學過程。顧清等［29]采用皮膚血液雙位點同步微透析系統(tǒng)聯(lián)合LC-MS分析技術(shù)，測定苦參堿凝膠經(jīng)皮給藥后在皮膚、血液中的藥物濃度，發(fā)現(xiàn)皮膚中其濃度、AUC、半衰期均顯著高于血液中，間接反映出該制劑良好的透皮能力和局部治療效果。周開等［30]建立了蛇床子軟膏在經(jīng)皮給藥后的皮膚微透析采樣方法，對其在SD 大鼠體內(nèi)的局部藥動學進行研究，發(fā)現(xiàn)它在皮膚組織中的蓄留量能在較長時間保持較高的水平。杜清等［31]基于微透析技術(shù)對雷公藤白芍微乳凝膠的皮膚和血液透析液進行藥動學研究，發(fā)現(xiàn)微乳凝膠經(jīng)皮滲透有形成皮膚儲庫的作用，提高了藥物的透皮效率，并能使藥物持續(xù)緩慢釋放，從而形成長效作用。Yang 等［21]對雷公藤甲素納米乳、納米凝膠的經(jīng)皮作用機理進行了研究，采用微透析技術(shù)采樣分析發(fā)現(xiàn)，普通凝膠很難通過皮膚，而納米乳、納米乳凝膠在皮膚和血液的藥物濃度顯著增加，具有更好的透皮效果；與納米乳相比，納米凝膠經(jīng)皮給藥后在皮膚、血液中的AUC 更高，藥物釋放更平穩(wěn)，具有緩釋作用，并提高了生物利用度。Shan 等［32]開發(fā)和評價負載雷公藤甲素的立方、六方液態(tài)晶體透皮給藥系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)該成分在皮膚中的濃度高于血液中，而且液態(tài)晶體大大提高了其生物利用度，具有良好的抗關(guān)節(jié)炎作用。李敏［33]對復方駱駝篷子軟膏劑、凝膏劑的皮膚及血液微透析液進行了藥動學研究，檢測其中去氫駱駝蓬堿等6 種主要成分，發(fā)現(xiàn)凝膠劑相對軟膏劑不僅延長了作用時間，也在一定程度上降低了藥物不良反應。

微透析技術(shù)可在減少動物組織受損的前提下進行中藥經(jīng)皮給藥后的藥動學研究，具有活體連續(xù)取樣、節(jié)省動物、采樣量小、樣品易分析等特點。傳統(tǒng)經(jīng)皮藥動學研究大多采用血液樣本或切下給藥后的皮膚制勻漿等，所收集的數(shù)據(jù)難以準確反映藥物經(jīng)皮給藥后的藥動學過程，而微透析可利用其優(yōu)勢得到更準確的數(shù)據(jù)，故可采用該方法進行藥物經(jīng)皮藥動學研究，闡明其作用機制，并篩選出更為安全有效的中藥經(jīng)皮給藥新劑型。

3.3 藥效學 藥效學主要驗證藥物在不同系統(tǒng)/模型中的有效性，研究藥物作用的量效關(guān)系，探索藥物的給藥方案以及闡明藥物的作用機制［34]。利用微透析技術(shù)監(jiān)測皮膚組織或血液中的藥物濃度，同時觀察藥效方面的改變，將有助于藥物作用機理的探討。

邵繼征等［35]用卵蛋白建立家兔類風濕性關(guān)節(jié)炎模型，考察青藤堿灌胃、經(jīng)皮給藥后對類風濕關(guān)節(jié)炎家兔關(guān)節(jié)液中精氨酸及瓜氨酸的影響，采用微透析技術(shù)進行樣本收集，利用HPLC-MS 法測定關(guān)節(jié)液中青藤堿，HPLC-FLD 法測定精氨酸和瓜氨酸，并將精氨酸和瓜氨酸的濃度變化作為關(guān)節(jié)炎藥效學指標。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)腔中藥效學指標濃度明顯降低，其中經(jīng)皮給藥后青藤堿濃度更高，持續(xù)時間更長，表明其療效更好。

3.4 藥動-藥效學 藥動-藥效模型即為PK-PD 模型，是研究藥物濃度與效應之間關(guān)系的結(jié)合模型，有助于更好地解釋藥物發(fā)揮的藥效、評估新劑型的開發(fā)。隨著微透析技術(shù)的發(fā)展，可實現(xiàn)微透析/PK-PD 同步在線分析，將最大限度地反映藥物濃度、效應、時間三者之間的關(guān)系［36]，不僅可實時監(jiān)測藥物濃度，還能實時收集藥效指標，使兩者同步完成，大大提高了效率及準確度。

左婷等［37]采用微透析技術(shù)聯(lián)合HPLC 法對痤瘡大鼠局部組織液進行采樣，以隱丹參酮含量為藥動學指標，利用液相芯片檢測局部樣本中IL-1α、AR 作為藥效學指標，并進行PK-PD 模型擬合，發(fā)現(xiàn)藥物濃度達到峰值一段時間后藥效指標濃度下降到最低，符合效應抑制模型。邵繼征等［38]利用微透析技術(shù)建立了家兔類風濕性關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)腔局部青藤堿的PK-PD 模型，符合S 型最大效應模型，并發(fā)現(xiàn)藥物效應與藥物濃度之間存在滯后效應，藥物進入關(guān)節(jié)腔后不能立即作用于受體。

3.5 應用小結(jié) 見表1。

表1 微透析技術(shù)的應用情況

4 微透析技術(shù)缺點與不足

微透析技術(shù)作為優(yōu)良的取樣技術(shù)，其優(yōu)勢十分突出，但也存在一些缺點與不足［39-41]：（1）微透析探針的植入對局部組織不可避免會產(chǎn)生輕微損傷，進而發(fā)生炎癥反應等，可能對實驗結(jié)果分析產(chǎn)生一定的影響；（2）由于微透析探針膜材料的性質(zhì)及灌流液的水性特征，更適用于水溶性及小分子物質(zhì)采集，而對于與膜發(fā)生不可逆結(jié)合、脂溶性極強、半衰期極短、高蛋白結(jié)合率的藥物不合適；（3）微透析樣品濃度并非真實濃度，必須對樣品進行準確可靠的校正，主要涉及探針回收率的測定，但相關(guān)方法都存在一定的局限性；（4）微透析技術(shù)檢測的是一定時間間隔內(nèi)待測物的平均濃度，導致透析結(jié)果不能反映機體相關(guān)物質(zhì)的瞬時變化。因此，若要充分發(fā)揮微透析技術(shù)的優(yōu)點，就需采用合理科學的設計方案將其應用于醫(yī)藥領域研究中，從而大大提高實驗效率。

5 結(jié)語與展望

微透析采樣技術(shù)最早應用于神經(jīng)遞質(zhì)采樣，現(xiàn)大多用于單一部位、單一成分的取樣，而隨著科學技術(shù)的發(fā)展，多部位、多成分分析取樣已成為其發(fā)展方向。對經(jīng)皮給藥系統(tǒng)同步皮膚和血液微透析可有力評價藥物透皮吸收和吸收入血速率的相關(guān)性，闡明藥物經(jīng)皮給藥后能否在局部作用部位皮膚或整體作用部位血液保持平穩(wěn)而有效的濃度［6]。由于中藥成分復雜，僅使用一種成分代表整個中藥或中藥復方的行為并不合適，也不全面，而采用微透析技術(shù)進行多成分同步取樣，并與中藥指紋圖譜聯(lián)用，可很好地解決以單成分代替中藥整體這一問題，將成為中藥、中藥復方多成分體內(nèi)過程分析的有力手段之一。

目前在中醫(yī)藥領域，微透析技術(shù)的應用還不夠廣泛，主要為中藥經(jīng)皮給藥后藥代動力學研究。近年來代謝組學迅速發(fā)展，其核心思想為研究外源性物質(zhì)對生物體產(chǎn)生的整體效應，這與突出整體效應的中醫(yī)藥思想十分吻合，可為中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究提供了新的思想和途徑。微透析技術(shù)作為一種新型取樣手段，可為代謝組學的研究提供了新的視角，能有效彌補傳統(tǒng)代謝組學樣本量有限、樣本需前處理等不足，具有極大的應用潛力和價值［42]。目前，暫無利用微透析技術(shù)進行中藥經(jīng)皮給藥后代謝組學研究的報道，主要應用于腦部代謝組學的研究，韋園詩等［43]于大腦動脈栓塞大鼠腦紋狀體植入微透析探針，并聯(lián)合UPLC-Q/TOFMS 成功進行了腦靶向性代謝組學研究；Wang 等［44]采用腎組織和頸靜脈雙探針微透析同步取樣，用于進行梔子治療Ⅱ型糖尿病大鼠的靶向代謝組學分析，可為梔子治療糖尿病及其并發(fā)癥的機制提供了新的認識。近年來，國外已有很多關(guān)于微透析技術(shù)應用于經(jīng)皮給藥制劑臨床研究的報道，而且微透析采樣時藥物不僅可從探針外向探針內(nèi)擴散而實現(xiàn)采樣目的，也能由探針內(nèi)向探針外擴散而實現(xiàn)給藥目的，通過將微透析探針精準植入特定組織來將藥物遞送到指定位置，從而實現(xiàn)微透析技術(shù)在中藥臨床研究中的應用。

目前，在中藥經(jīng)皮給藥系統(tǒng)中利用微透析技術(shù)主要應用于藥動學、藥效學、藥動-藥效學的研究，不僅為新藥開發(fā)和研制提供依據(jù)，還促進了新劑型研發(fā)，并對中醫(yī)臨床的合理用藥提供了技術(shù)支持和理論依據(jù)。微透析實驗中皮膚取樣大多采用線性探針（瑞典的CMA 公司和美國的BAS公司），取樣部位大多為腹部皮膚和腹部皮下組織，也有采用皮膚血液雙位點同步取樣；血液取樣大多采用同心圓型探針，部位大多為頸靜脈；檢測方法大多為HPLC、LCMS，對于一些特殊物質(zhì)檢測亦有采用FLD 檢測器、液相芯片進行分析。隨著科學技術(shù)的不斷發(fā)展，微透析技術(shù)將更廣泛地應用于中藥經(jīng)皮給藥后藥物在體內(nèi)的分析研究中，采樣對象正朝不僅只適合于小分子、水溶性、原型藥物，還適合于大分子、脂溶性藥物及其代謝產(chǎn)物方向發(fā)展，同時可實現(xiàn)多部位、多成分同步取樣，并與微量、快速、靈敏的分析檢測技術(shù)聯(lián)用而進行實時、在線同步測定，非常適合于中藥復雜成分的分析，大大提高了實驗效率，加速了中醫(yī)藥現(xiàn)代化進程，具有廣闊的應用前景。