2 種類型滇黃精生藥學(xué)指標(biāo)和化學(xué)成分動態(tài)分析

李 玲楊玉玲黃玉玲王朝梁楊志連田迎秋 *

（1.文山州農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥物生物技術(shù)研究所，云南 文山 663000；2.文山學(xué)院三七醫(yī)藥學(xué)院，云南 文山 663000；3.文山陽禾旭中藥材種植有限公司，云南 文山 663000）

黃精為百合科植物滇黃精 Polygonatum kingianum Coll.et Hernsl.、黃精 Polygonatum sibiricum Red.或多花黃精Polygonatum cyrtonema Hua 的干燥根莖［1]，味甘、平，歸脾、肺、腎經(jīng)，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、潤肺、益腎之功，用于滋補(bǔ)強(qiáng)身和治療腎虛精虧、肺虛燥咳以及脾胃虛弱之癥［2-3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃精多糖是黃精的重要活性成分，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎抗菌、調(diào)節(jié)血糖血脂、調(diào)節(jié)免疫、改善記憶力等功能［4-5]；皂苷是黃精屬植物的主要活性成分之一［6]，具有調(diào)節(jié)血糖、提高免疫、抗腫瘤等作用；黃酮類是一種重要的天然產(chǎn)物，也是黃精主要化學(xué)成分之一［7]，具有降血糖、抗腫瘤等作用；多酚作為植物體內(nèi)重要的代謝物質(zhì)，藥理作用豐富，已經(jīng)成為評價藥材質(zhì)量的重要指標(biāo)之一［8]。

滇黃精是云南省范圍內(nèi)廣泛種植的黃精品種，由于其變異性較大，有很多種表型，主要為2 種，其明顯特征是1 種芽頭更多，約是另1 種數(shù)量的2 倍以上（成熟期時），出芽時間和花期也較早（約2 月份），盛花期和果實成熟期分別為4 月中旬和8 月中旬，適于較高海拔種植（1 300 m 以上），葉片窄而細(xì)長，花型相對較小，抗病性、抗旱性較強(qiáng)，因而易于管理，受種植戶喜好，民間俗稱“中紅花黃精”或“多芽黃精”，本研究簡稱為“M 型滇黃精”；另1 種芽頭較少，但芽頭大，出芽和開花時間、盛花期、果實成熟期均相對晚約1 個半月至2 個月，花型相對較大，民間俗稱“大紅花黃精”或“少芽黃精”，適于較低海拔種植（1 300 m 以下），本研究簡稱為“L 型滇黃精”。除此之外，這2 種滇黃精在果實內(nèi)層顏色、花序或果柄長短與分支數(shù)量、莖桿及塊根質(zhì)地等方面也都有明顯差異。

本研究結(jié)合農(nóng)藝學(xué)性狀、生藥學(xué)指標(biāo)和化學(xué)成分等多個指標(biāo)，以折干率、灰分、浸出物、黃精多糖、皂苷、黃酮、酚類等7 個指標(biāo)考察這2 種類型滇黃精，通過綜合分析評價，旨在比較兩者品質(zhì)差異，以期為種植戶選種及精細(xì)化管理提供參考，亦為以兩者作為親本來選育優(yōu)良新品種及與其他黃精品種雜交選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 T6 新世紀(jì)型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；SX2-4-10A 型箱式電阻爐（紹興市上虞道墟科析儀器廠）；Advanced-I-12 型超純水機(jī)（成都艾柯水處理設(shè)備有限公司）；HHS 型電熱恒溫水浴鍋（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；FA2004 型電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；C10002 型電子天平（杭州萬特衡器有限公司）；SB-5200D 型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 試劑與藥物 人參皂苷Re 對照品（成都格萊特生物科技有限公司，批號DST180226-014）；蘆丁對照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號wkq19010203）；沒食子酸對照品（成都格萊特生物科技有限公司，批號DST190715-008）；葡萄糖對照品（成都格萊特生物科技有限公司，批號DST190624-005）。蒽酮、濃硫酸、無水乙醇、高氯酸、NaNO2、Al（NO3）3、NaOH、福林酚、Na2CO3、香草醛、冰醋酸等試劑均為國產(chǎn)分析純。

滇黃精為文山陽禾旭中藥材種植有限公司黃精基地的滇黃精根莖，來源于云南省文山州文山市簿竹鎮(zhèn)木期黑村，海拔1 679.0 m，北緯23°43′43′，東經(jīng)103°99′42′，經(jīng)專家鑒定為正品。

2 方法和結(jié)果

2.1 2 種類型滇黃精性狀

2.1.1 原植物形態(tài)特征 滇黃精Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl 為百合科黃精屬草本植物，根狀莖近圓柱形或近連珠狀，結(jié)節(jié)有時作不規(guī)則菱狀，肥厚；莖頂端作攀援狀；葉輪生，每輪3～10 枚，條形、條狀披針形或披針形，先端拳卷；花序具花，總花梗下垂，花梗苞片膜質(zhì)，微小，通常位于花梗下部；花被粉紅色，裂片長3～5 mm；花絲長3～5 mm，絲狀或兩側(cè)扁，花藥長4～6 mm；子房長4～6 mm；漿果紅色，直徑1～1.5 cm，具7～12顆種子；花期3～6 月，果期6～10 月。

2.1.2 不同生育期形態(tài)特征 在云南省種植的滇黃精主要有2 種表現(xiàn)類型，本實驗暫時分別命名為M 型、L 型，其形態(tài)特征差異見表1。

表1 2 種類型滇黃精形態(tài)差異Tab.1 Morphological differences between two types of P.kingianum

2.2 樣品采集 通過隨機(jī)抽樣法，于2018 年6 月在黃精基地選取無病蟲害、生長年限一致的2 種類型的滇黃精分別進(jìn)行掛牌，于2018 年7 月至2019年6 月每月下旬在基地對掛牌的植株進(jìn)行取樣。取樣前30 min 將溫濕度計放置于預(yù)取樣品附近，取樣時記錄溫濕度。每種類型每次取樣3 株，每株取2～3 年生齡節(jié)的根莖，具體信息見表2。

表2 樣品信息Tab.2 Information of samples

2.3 折干率測定 將滇黃精根莖洗凈晾干，稱鮮重后切片，60 ℃烘干后稱量干重，根據(jù)公式（干重/鮮重）×100%計算折干率，結(jié)果見表2。

由此可知，2 種類型滇黃精樣品折干率變化差異較大，其中M 型樣品的折干率在8.03%～52.22%之間，在不同采收月份的變化較大，但總體相對較高，在5 月、7 月出現(xiàn)了2 個高值，分別為 52.22%、43.63%；L型樣品的折干率 在9.23%～25.11%之間，不同采收月份變化相對較小，在 4、5 月相對較高，分別 為 25.11%、24.41%，見圖1。

圖1 不同采收月份滇黃精折干率變化Fig.1 Changes in content of drying rate of P.kingianum in different months

2.4 總灰分測定 按2020 年版《中國藥典》 四部中通則2302 法進(jìn)行測定，結(jié)果見表3～4、圖2。

圖2 不同采收月份滇黃精總灰分含量變化Fig.2 Changes in content of total ash of P.kingianum in different months

表3 M 型滇黃精不同采收月份成分含量測定結(jié)果（，n=3）Tab.3 Results of content determination of constituents in different growth months of M-type P.kingianum（，n=3）

表3 M 型滇黃精不同采收月份成分含量測定結(jié)果（，n=3）Tab.3 Results of content determination of constituents in different growth months of M-type P.kingianum（，n=3）

注：同列中不同大寫字母表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），同列中不同小寫字母表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 L 型滇黃精不同采收月份的成分含量測定結(jié)果（，n=3）Tab.4 Results of content determination of constituents in different growth months of L-type P.kingianum（，n=3）

表4 L 型滇黃精不同采收月份的成分含量測定結(jié)果（，n=3）Tab.4 Results of content determination of constituents in different growth months of L-type P.kingianum（，n=3）

注：同列中不同大寫字母表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），同列中不同小寫字母表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

由此可知，M 型、L 型不同月份采收樣品總灰分含量均具有統(tǒng)計學(xué)差異，2 種類型滇黃精在不同月份采收的樣品總灰分含量變化趨勢一致，其中M型樣品的總灰分含量在2.56%～7.10%之間，有7個在4%以內(nèi)，達(dá)到2020 年版《中國藥典》 標(biāo)準(zhǔn)（不得超過4%），以11 月份（M11）最低，僅為2.56%；L 型樣品總灰分含量在1.57%～6.72%之間，其中有8 個在4%以內(nèi)，達(dá)到2020 年版《中國藥典》 標(biāo)準(zhǔn)（不得超過4%），以11 月份（L11）最低，僅為1.57%。

2.5 浸出物測定 參照2020 年版《中國藥典》四部通則2201 項下“醇溶性浸出物測定法”中的熱浸法測定，結(jié)果見表3～4、圖3。

圖3 不同采收月份滇黃精浸出物變化Fig.3 Changes in contents of extractives of P.kingianum in different months

由此可知，2 種類型樣品除9、10 月變化趨勢有差異外，其他月份一致，浸出物含量均高于45%，達(dá)到2020 年版《中國藥典》 標(biāo)準(zhǔn)（不得少于45%），其中M 型樣品在62.81%～82.52%之間，1 月（M1）、4 月（M4）、6 月（M6）、8 月（M8）、9 月（M9）、11 月（M11）較高，在80%以上，并且無顯著性差異，以11 月（M11）最高，達(dá)82.52%；L 型樣品在55.56%～81.77% 之間，而且有顯著性差異，1 月（L1）、4 月（L4）均較高，但無顯著性差異，以4 月（L4）最高，達(dá)81.77%。

2.6 多糖含量測定 參照2020 年版《中國藥典》一部黃精項下“含量測定”方法。以吸光度為縱坐標(biāo)（A），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，得方程為A=4.584 6X+0.025 4（R2=0.996 8）。結(jié)果見表3～4、圖4。

圖4 不同月份滇黃精黃精多糖含量變化Fig.4 Changes in contents of polysaccharides of P.kingianum in different months

由此可知，2 種類型滇黃精的黃精多糖含量在不同采收月份變化趨勢在6、9 月有差異，在其他月份變化趨勢一致，2 種類型在不同月份的黃精多糖含量均達(dá)到了2020 年版《中國藥典》 標(biāo)準(zhǔn)（不得少于7.0%），其中M 型樣品在12.20%～28.90%之間，具有顯著性差異，1 月（M1）、4 月（M4）、9 月（M9）、11 月（M11）較高，分別為28.90%、27.70%、26.90%、25.93%；L 型樣品在7.97%～29.30% 之間，具有顯著性差異，4 月（L4）、11 月（L11）、5 月（L5）較高，分別為29.30%、28.41%、26.77%。

2.7 總皂苷含量測定 參照文獻(xiàn)［9]，采用香草醛-冰醋酸-高氯酸比色法，在586 nm 波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)（A），人參皂苷Re 含量為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，得方程為A=2.5X-0.008 4（R2=0.997 8）。結(jié)果見表3～4、圖5。

圖5 不同月份滇黃精總皂苷含量變化Fig.5 Changes in content of total saponins of P.kingianum in different months

由此可知，2 種類型滇黃精樣品在不同采收月份皂苷含量變化趨勢有差異，其中M 型滇黃精不同采收月份總皂苷含量在0.89%～1.68%之間，有顯著性差異，除12 月（M12）低于1.0%以外，其余月份均高于1.0%，以11 月（M11）最高，達(dá)1.68%；L 型滇黃精在0.98%～1.61% 之間，除7 月（L7）低于1.0%以外，其余月份均高于1.0%，以11 月（L11）最高，達(dá)1.61%。

2.8 總黃酮含量測定 參照文獻(xiàn)［10]，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 比色法，在510 nm 波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)（A），蘆丁對照品含量為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，得方程為A=0.014X-0.020 6（R2=0.994 7）。結(jié)果見表3～4、圖6。

圖6 不同月份滇黃精總黃酮含量變化Fig.6 Changes in content of total flavonids of P.kingianum in different months

由此可知，2 種類型滇黃精在不同采收月份總黃酮含量變化趨勢有一定差異，但都出現(xiàn)了一次高峰值，其中M 型滇黃精在0.10～0.86 mg/g 之間，7 月（M7）出現(xiàn)較大增幅，8 月（M8）達(dá)到峰值，分別為0.68%、0.86%，之后大幅降低，而其他10 批樣品之間的差異較小；L 型滇黃精在0.11～0.61 mg/g 之間，7 月（L7）出現(xiàn)較大增幅，達(dá)到峰值，為0.61%，之后大幅降低，而其他11 個樣品之間的差異較小。

2.9 酚類含量測定 參照文獻(xiàn)［10]，采用福林酚顯色法，在765 nm 波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)（A），沒食子酸對照品含量為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，得方程為A=0.111 5X+0.018 4（R2=0.998 1）。結(jié)果見表3～4、圖7。

圖7 不同月份滇黃精酚類含量變化Fig.7 Changes in content of phenols of P.kingianum in different months

由此可知，2 種類型滇黃精酚類含量變化均在3 月份達(dá)到最高，出現(xiàn)峰值，之后大幅降低，其中M 型滇黃精在0.04～1.58 mg/g 之間，有顯著性差異，以3 月（M3）、12 月（M12）較高，分別為1.58、1.05 mg/g，其他樣品均在1%以內(nèi)；L 型滇黃精在0.09～1.17 mg/g 之間，有顯著性差異，以3 月（L3）較高，為1.17 mg/g，其他樣品均在1%以內(nèi)。

2.10 主成分分析

2.10.1 指標(biāo)間相關(guān)性檢驗、KMO 和Bartlett 球形度檢驗 表5～6 顯示，2 個類型滇黃精7 個指標(biāo)之間存在不同程度的相關(guān)性，KMO 值＞0.5，Bartlett球形度檢驗的相伴概率P＜0.05，表明各成分之間存在相關(guān)性，適合采用主成分分析方法進(jìn)行評價。

表5 M 型滇黃精相關(guān)系數(shù)矩陣Tab.5 Correlation matrices of M-type of P.kingianum

表6 L 型滇黃精相關(guān)系數(shù)矩陣Tab.6 Correlation matrices of L-type of P.kingianum

2.10.2 滇黃精品質(zhì)指標(biāo) 參考文獻(xiàn)［11-12]，采用SPSS17.0 軟件對不同采收月份滇黃精樣品的測定結(jié)果進(jìn)行主成分分析，計算相關(guān)矩陣特征值和特征向量，見表7～8。

表7 M 型滇黃精初始特征值與貢獻(xiàn)率Tab.7 Initial eigenvalues and contribution rates of M-type of P.kingianum

表8 L 型滇黃精初始特征值與貢獻(xiàn)率Tab.8 Initial eigenvalues and contribution rates of L-type of P.kingianum

由此可知，M 型滇黃精前4 個成分的特征值大于0.8，4 個因子的累積方差貢獻(xiàn)率為94.842% ＞80%，即可解釋原變量的94.842% 的信息，因此，選取前4 個因子進(jìn)行分析；L 型滇黃精前3 個成分的特征值大于0.8，3 個因子的累積方差貢獻(xiàn)率為85.053%＞80%，即可解釋原變量的85.053%的信息，因此，選取前3 個因子進(jìn)行分析。M 型滇黃精每個樣品的綜合評價模型為F=0.513 28F1+0.189 53F2+0.125 86F3+0.119 74F4，L型滇黃精為 F=0.547 07F1+0.175 89F2+0.127 57F3，綜合評分見表9～10。

表9 M 型滇黃精不同采收月份的主成分因子得分Tab.9 Principal component factor scores for M-type of P.kingianum in different harvesting months

2 種類型滇黃精主成分因子得分變化趨勢一致，見圖8，但其變化幅度有差異。其中，M 型滇黃精總體得分范圍-1.96～1.07，以11 月采收最高，為1.07，其次為8 月采收，為1.03，12 月采收最低，為-1.96；L 型滇黃精總體得分范圍-2.40～1.50，以4 月采收最高，為1.50，其次為11 月采收，為1.13，7 月采收最低，為-2.40。

圖8 不同月份采收滇黃精主成分因子得分變化Fig.8 Changes in principal component factor scores of P.kingianum in different months

3 討論

本研究參考前期黃精成分報道［4-8]和其他品種研究［13-14]，選擇了6 個生藥學(xué)指標(biāo)和化學(xué)成分，并與主成分分析法相結(jié)合，對這2 種滇黃精類型進(jìn)行分析評價。在折干率方面，M 型最高值在5 月，達(dá)到52.22%，L 型在4 月，達(dá)到25.11%，差異近2 倍，就加工成本和得率來看，M 型明顯優(yōu)于L型，意味著這2 種滇黃精從折干率確定的最佳采收期（分別為5 月、4 月）和當(dāng)前普遍選擇果實成熟（11 月前后）以后的采收期并不吻合。由此對這2種滇黃精的精細(xì)化種植提出了新要求，即兩者如果不留種，就應(yīng)該分別在5 月下旬、4 月下旬摘花留葉留桿，讓地下部分的塊根繼續(xù)營養(yǎng)生長一段時間至最大值時采挖。

在總灰分和浸出物2 項指標(biāo)中，2 種類型滇黃精變化趨勢與最大值、最小值差異不大，均能達(dá)到《中國藥典》 要求；多糖方面，2 種類型的最高值無明顯差異，但M 型在1、4、9、11 月均有分布，L 型的最高值只在4～5、11 月，其他化學(xué)成分（如總黃酮、酚類）及主成分因子得分等動態(tài)變化趨勢與極值也不盡相同，表型方面的差異結(jié)合生藥學(xué)與化學(xué)成分的差異，表明M 型和L 型是同一生態(tài)環(huán)境下形成的2 個相對生殖隔離的滇黃精類型。

綜上所述，應(yīng)以M 型滇黃精為首選選育新品種，并采用高密度短周期的種植方式實現(xiàn)增產(chǎn)。同時，基于滇黃精種植區(qū)及云南省黃精產(chǎn)業(yè)發(fā)展的長遠(yuǎn)考慮，還應(yīng)引進(jìn)品質(zhì)更為優(yōu)良的多花黃精開展雜交選育工作，以改良滇黃精多糖含量不高、活性偏低的不足［14]，并結(jié)合云南省獨有的氣候、環(huán)境和種植優(yōu)勢來培育品質(zhì)更優(yōu)、適應(yīng)性更強(qiáng)、產(chǎn)量更高的新品種。