雞內(nèi)金炮制前后多糖含量及組成比較

王 楠，干仲元，宋雨慶，蔣珅藝，黃邦路，修彥鳳

（上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203）

雞內(nèi)金為雉科動物家雞Callus gallus domesticus Brisson 的干燥沙囊內(nèi)壁，主要含有蛋白質(zhì)［1]、氨基酸［2]、多糖［3]等多種化學(xué)成分。雞內(nèi)金生品質(zhì)地硬脆，具有不良?xì)馕叮Ｐ璩春笫褂?，炒后除使其質(zhì)地酥脆、矯正不良?xì)馕?，功效也產(chǎn)生了一定差異，生品長于攻積、通淋化石，用于治療泌尿系統(tǒng)結(jié)石［4]；炒后能增強(qiáng)健脾消積、固精縮尿止遺的作用［5]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，雞內(nèi)金多糖為雞內(nèi)金的重要藥效成分，能有效降低糖尿病高脂血癥大鼠血糖和血脂水平［6-7]，清除羥自由基、螯合Fe2+和抑制脂質(zhì)過氧化［3]，預(yù)防心肌形態(tài)異常變化、逆轉(zhuǎn)異常血液動力學(xué)和血液流變學(xué)參數(shù)，具有顯著的心臟保護(hù)作用［8]。但目前未見對其進(jìn)行測定分析的研究報道。因此，本實(shí)驗(yàn)以雞內(nèi)金多糖為研究對象，采用苯酚-硫酸法和柱前衍生化法測定雞內(nèi)金炮制前后多糖含量，并對多糖中單糖的組成進(jìn)行分析和測定，以期為解釋雞內(nèi)金炮制前后發(fā)生的化學(xué)變化和藥效作用的差異提供依據(jù)，為完善雞內(nèi)金的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1200 型HPLC 色譜儀（美國Agilent 公司）；HT 酶標(biāo)儀（美國BioTek 公司）；BSA124S 電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；5804R 冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；DHG-9245A 鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；RE5203 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-ⅢS 循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；MX-S 渦旋振蕩器（上海賽伯樂儀器有限公司）；HH-S6 數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 生雞內(nèi)金購于上?？禈蛑兴庯嬈邢薰?，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)修彥鳳副教授鑒定為雉科動物家雞Callus gallus domesticus Brisson 的干燥沙囊內(nèi)壁。 D-無水葡萄糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、D-木糖、D-葡萄糖醛酸、D-核糖，批 號 分 別 為201707、201504、200202、201502、201506、201605、201804、201302，均購于中國食品藥品檢定研究院；鹽酸氨基葡萄糖、D-氨基半乳糖鹽酸鹽、L-巖藻糖，批號分別為S27M7I15344、H05MX4253、X16N8Y48166，均購于上海源葉生物科技有限公司。甲醇、硫酸、苯酚、三氟乙酸、三氯甲烷、95% 乙醇、乙醚、丙酮、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮、二水磷酸二氫鈉、無水磷酸氫二鈉均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 炒雞內(nèi)金制備 將3 kg 河砂置于熱鍋中，翻炒至溫度為250 ℃，加入100 g 生雞內(nèi)金，翻炒80 s后迅速出鍋，篩去砂子，即得，得率為95.04%。

2.2 苯酚-硫酸法測定總多糖含量

2.2.1 供試品溶液制備 將生、炒雞內(nèi)金粉碎，各取2.0 g，精密稱定，加入20 mL 純水，水浴回流提取4 h，離心（5 000 r/min）10 min。取上清液400 μL 置于EP 管中，加入1.6 mL 無水乙醇，過夜（4 ℃），棄去上清液，殘?jiān)尤霟o水乙醇潤洗，離心，將殘?jiān)鼫p壓干燥（40 ℃），加入200 μL純水、200 μL 5%苯酚溶液，渦旋混勻，加入1 mL濃硫酸，充分混勻，置沸水浴中加熱20 min，取出，冷卻30 min，測定其在490 nm 波長處的吸光度。

2.2.2 線性關(guān)系考察 取無水葡萄糖10.0 mg，精密稱定，置于100 mL 量瓶中，加入蒸餾水溶解搖勻，質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL，分別吸取0、40、80、100、120、160、200 μL 置于2 mL EP 管中，蒸餾水補(bǔ)至200 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備對照品溶液，測定其在490 nm 波長處的吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（A）進(jìn)行回歸，得方程為A=4.245 4X+0.125 9（r=0.999 9），在0.01～0.10 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.3 精密度試驗(yàn) 取0.06 mg/mL 對照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測定吸光度，重復(fù)6 次，測得其RSD 為0.18%，表明儀器精密度良好。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.2.1”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，測定吸光度，測得其RSD為2.71%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測定0、1、2、4、8、12 h 吸光度，測得其RSD 為1.21%，表明溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6 加樣回收率試驗(yàn) 取多糖含量已知的生雞內(nèi)金1.0 g，精密稱定，加入20 mL 純水，水浴回流提取，離心，取上清液400 μL，醇沉后殘?jiān)稍?，加?00 μL 純水、100 μL 葡萄糖對照品溶液（質(zhì)量濃度為0.029 8 mg/mL），加入苯酚溶液，繼續(xù)制備供試品溶液，測定吸光度。結(jié)果，多糖平均加樣回收率為97.84%，RSD 為3.15%。

2.2.7 樣品含量測定 按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測定490 nm 處的吸光度?？偠嗵呛?c×10/1 000×m×100%（c 為由隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的粗多糖溶液中葡萄糖的濃度，m 為雞內(nèi)金質(zhì)量）。結(jié)果，生品、炒品總多糖含量分別為（0.014 9±0.001 2）%、（0.020 7±0.000 6）%，即炮制后升高38.93%。

2.3 色譜條件 Kromasil KR100-5C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈-0.1 mol/L磷酸鹽緩沖鹽（pH 6.8）（19.2∶80.8）；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長250 nm；進(jìn)樣量20 μL。

2.4 供試品制備條件優(yōu)選及衍生化

2.4.1 總多糖提取、純化 取生、炒雞內(nèi)金粉末各100 g，加入200 mL 石油醚脫脂，浸泡過夜，棄去上清液，將殘?jiān)鼡]干，加入10 倍量純水回流提取3 h，濾過，殘?jiān)偌尤? 倍量純水回流提取2 h，合并2 次濾液，濃縮至一定體積，得到粗多糖溶液，加入1/4 體積的Sevage 試劑（氯仿-正丁醇=5∶1），磁力攪拌20 min，離心（5 000 r/min）10 min，除去變性蛋白，重復(fù)操作直至無變性蛋白質(zhì)出現(xiàn)。取上清液，加入無水乙醇使醇體積分?jǐn)?shù)為80%，醇沉（4 ℃）12 h，濾過，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌2 次，揮干溶劑，即得。

2.4.2 總多糖水解條件優(yōu)選 以水解溫度（A）、三氟乙酸濃度（B）和水解時間（C）為考察因素，見表1，結(jié)果見表2。取“2.4.1”項(xiàng)下100 mg生雞內(nèi)金總多糖，精密稱定，置于5 mL 量瓶中，加純水溶解，定容，精密移取1 mL，置于5 mL 安瓿中，按表2 設(shè)計(jì)加入等體積的三氟乙酸，搖勻，酒精噴燈封口，置于烘箱中，設(shè)置相應(yīng)的溫度和時間進(jìn)行水解，取出水解樣品，冷卻至室溫后真空旋干，加入6 次甲醇除去剩余三氟乙酸，旋干后加入純水復(fù)溶至1 mL。以水解得到的11 種單糖的總峰面積為評價指標(biāo)，優(yōu)選水解條件。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Design and results of tests

由表2 可知，水解溫度（A）對總多糖水解后的單糖總峰面積影響最大，其次為水解酸濃度（B）和水解時間（C）；水解溫度的K—值依次為110 ℃＞120 ℃＞105 ℃，水解酸濃度8 mol/L ＞6 mol/L＞4 mol/L，水解時間4 h＞3 h＞2 h，表明水解溫度110 ℃、三氟乙酸濃度為8 mol/L、水解時間4 h 是較優(yōu)條件。方差分析見表3，可知各因素中F 值均小于19.00，3 個水平之間無明顯差異。綜合分析，單糖最優(yōu)水解條件為多糖在三氟乙酸濃度8 mol/L、水解溫度110 ℃下水解4 h。采用優(yōu)選條件平行制備3 份樣品，測得總峰面積分別為13 150.32、13 286.94、13 042.23，可保證多糖的水解效果。

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

2.4.3 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生化樣品制備 按“2.4.2”項(xiàng)下優(yōu)選條件制備樣品，移取200 μL，置于2 mL EP 管中，加入0.5 mol/mL 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮甲醇溶液、0.3 mol/mL NaOH 溶液各200 μL，水?。?0 ℃）加熱60 min，冷卻后加入0.3 mol/mL HCl 溶液200 μL 進(jìn)行中和，加入1 mL 氯仿萃取3 次，除去未反應(yīng)的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮，上清液經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，進(jìn)行HPLC 分析［9]。精密稱定11 種單糖對照品，純水溶解定容于10 mL 量瓶中，按上述方法制備，即得。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 取對照品溶液，逐級稀釋后按“2.4.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生化，在“2.3”項(xiàng)條件下分析，結(jié)果見圖1，可知雞內(nèi)金多糖由11種單糖組成，并且在此色譜條件下得到良好的分離。以單糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表4，表明各單糖在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 各單糖HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various monosaaccharides

表4 各單糖線性關(guān)系Tab.4 Linear relationships of various monosaaccharides

2.5.2 精密度試驗(yàn) 取11 種單糖對照品溶液，按“2.4.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生化，同一天在“2.3”項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次（日內(nèi)），測得D-甘露糖、鹽酸氨基葡萄糖、D-核糖、鼠李糖、D-葡萄糖醛酸、D-氨基半乳糖鹽酸鹽、D-無水葡萄糖、半乳糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、L-巖藻糖峰面積RSD 分別 為 0.98%、0.35%、1.08%、1.23%、1.99%、0.94%、0.94%、0.26%、1.65%、1.11%、0.47%；連續(xù)3 d 進(jìn)樣分析（日間），測得RSD 分別為2.08%、1.59%、1.86%、1.53%、2.20%、1.37%、1.80%、1.75%、2.87%、2.42%、1.15%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取6 份生雞內(nèi)金多糖，分別按“2.4.2”“2.4.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行水解、衍生化處理，在“2.3”項(xiàng)條件下進(jìn)樣分析，測得11 種單糖含量RSD 分別為2.57%、2.41%、2.87%、2.97%、2.47%、2.60%、2.73%、2.94%、1.68%、2.42%、2.88%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取生雞內(nèi)金多糖，按“2.4.2”“2.4.3”項(xiàng)下方法分別進(jìn)行水解、衍生化處理，于0、2、6、8、12、24 h 在“2.3”項(xiàng)條件下進(jìn)樣分析，測得11 種單糖峰面積RSD 分別為1.79%、1.87%、1.07%、1.86%、2.98%、1.67%、1.92%、1.46%、2.95%、2.91%、2.25%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 取各單糖含量已知的生雞內(nèi)金多糖9 份，每份約50 mg，精密稱定，置于5 mL 量瓶中，加適量純水溶解后加入一定體積的單糖溶液，分別約為樣品中單糖量的80%、100%、120%，各3 份，定容于5 mL 量瓶中，精密移取1 mL于安瓿中，按“2.4.2”“2.4.3”項(xiàng)下方法分別進(jìn)行水解、衍生化處理，在“2.3”項(xiàng)條件下進(jìn)樣。結(jié)果，11 種單糖的平均加樣回收率（RSD）分別為101.21%（5.16%）、96.29%（4.17%）、93.67%（5.33%）、92.00%（4.05%）、94.80%（3.72%）、99.30%（3.16%）、102.68%（2.5%）、103.21%（3.84%）、95.42%（4.75%）、103.99%（5.37%）、99.36%（4.09%）。

2.6 樣品含量測定 取“2.4.1”項(xiàng)下100 mg 生、炒雞內(nèi)金多糖，溶于純水中，并定容至5 mL 量瓶中，精密移取1 mL 于安瓿中，按“2.4.2”“2.4.3”項(xiàng)下方法分別進(jìn)行水解和衍生化處理，平行3 份，在“2.3”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，計(jì)算含量，見表5、圖1。由此可知，生雞內(nèi)金多糖中11 種單糖組成比例為0.129∶0.122∶0.030∶0.028∶0.030∶0.071∶0.195∶0.297∶0.022∶0.007∶0.044，炒雞內(nèi)金多糖中為0.231∶0.222∶0.042∶0.034∶0.033∶0.222∶0.377∶0.613∶0.068∶0.017∶0.086。

表5 各單糖含量測定結(jié)果（，n=3）Tab.5 Results of content determination of various monosaccharides（，n=3）

表5 各單糖含量測定結(jié)果（，n=3）Tab.5 Results of content determination of various monosaccharides（，n=3）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用苯酚-硫酸法初步測定雞內(nèi)金炮制前后總多糖含量的變化，結(jié)果顯示，炒雞內(nèi)金中總多糖的含量增加。苯酚-硫酸法是以葡萄糖為對照品確定總多糖的含量，無法準(zhǔn)確得出其中單糖的組成及含量。有文獻(xiàn)采用氣相色譜分析發(fā)現(xiàn)，雞內(nèi)金多糖是由鼠李糖、巖藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖構(gòu)成［3]。為了確定炮制對雞內(nèi)金多糖的影響，前期亦用氣相-質(zhì)譜法對雞內(nèi)金多糖進(jìn)行分析，結(jié)果僅鑒別了阿拉伯糖、木糖及葡萄糖和2 種未知成分，并未見鼠李糖等其他4 種單糖。由于單糖在紫外下無吸收，故選用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生化法對雞內(nèi)金多糖中單糖的組成和含量進(jìn)行分析和測定，檢測到雞內(nèi)金多糖由甘露糖、鹽酸氨基葡萄糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖鹽酸鹽、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和巖藻糖11 種單糖組成，建立了穩(wěn)定、操作簡單、準(zhǔn)確度高的含量測定方法。

不同的炮制加工方法會對中藥多糖的糖含量、相對分子質(zhì)量、單糖組成相對含量和活性產(chǎn)生影響，如炒決明子［10]、蜜炙黃芪［11]、九蒸九曬地黃［12]和麩炒白術(shù)［13]等。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，生、炒雞內(nèi)金中半乳糖、葡萄糖、鹽酸氨基葡萄糖、甘露糖、氨基半乳糖鹽酸鹽的含量較高，雞內(nèi)金炮制后11 種單糖的含量均升高，氨基半乳糖鹽酸鹽、木糖升高了210%，雞內(nèi)金多糖的結(jié)構(gòu)及組成發(fā)生了明顯的變化，其產(chǎn)生的原因可能是雞內(nèi)金炒制后質(zhì)地酥脆，組織的疏松度增強(qiáng)，利于有效成分溶出，或某些成分轉(zhuǎn)化為多糖。多糖具有多方面的藥理活性，如抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗疲勞等［14-15]，中藥多糖可通過扶植腸道有益菌生長、抑制有害菌生長調(diào)節(jié)各菌群之間的平衡，從而起到治療疾病的作用［16]。炮制引起雞內(nèi)金多糖的含量和組成發(fā)生變化，勢必會影響到其藥效，如雞內(nèi)金炒品在降低幽門結(jié)扎和乙醇誘導(dǎo)胃潰瘍大鼠的潰瘍面積和改善病理癥狀方面的作用優(yōu)于生品［17]。雞內(nèi)金炮制后療效的差異是否與多糖的差異相關(guān)，不良?xì)馕兜臏p弱是否與多糖的轉(zhuǎn)化有關(guān)，健脾消積、固精縮尿止遺的作用是否與多糖的調(diào)節(jié)腸道菌群、抗氧化和抗炎等作用有關(guān)，需要對雞內(nèi)金炮制前后的多糖開展相應(yīng)的研究，以期為深入闡明雞內(nèi)金炮制的意義奠定基礎(chǔ)。