掌葉大黃“柴禾”熏制加工過(guò)程中成分及體外抗氧化活性動(dòng)態(tài)變化

馮銀平，帖曉燕，張?jiān)弃Q，王 丹，張文廣，苗小樓，李秀娟，李 蕓*

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅 蘭州 730050；3.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050）

掌葉大黃Rheum palmatum L.是《中國(guó)藥典》收載的正品大黃之一［1]，主要含有蒽醌類、蒽酮類、二苯乙烯類、苯丁酮類、色原酮類、黃酮類、鞣質(zhì)類、多糖類等成分［2]，其中蒽醌類是其重要的活性物質(zhì)，也是現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》 規(guī)定控制大黃藥材質(zhì)量的指標(biāo)，具有抗炎、抗腫瘤、保護(hù)心血管、保肝、護(hù)肺、改善腦損傷、調(diào)節(jié)腸道菌群、治療腎纖維化等生物活性［3-5]。

甘肅禮縣是掌葉大黃的傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)，種植歷史悠久，但鮮品含水量較高，根莖粗大，質(zhì)地堅(jiān)實(shí)，水分不易散失，又因禮縣氣候潮濕陰冷，采收期處于秋冬季，易導(dǎo)致藥材霉?fàn)€、糠心、變色、變質(zhì)，故采收后及時(shí)的干燥處理方式對(duì)保證藥材質(zhì)量和飲片臨床療效至關(guān)重要。大黃傳統(tǒng)干燥方法主要有熏干法、烘干法、陰干法等［6]，但烘干法對(duì)設(shè)備要求高導(dǎo)致生產(chǎn)成本高，而陰干法歷時(shí)較長(zhǎng)，易蟲蛀霉變，因而當(dāng)?shù)厮庌r(nóng)普遍采用符合農(nóng)家生產(chǎn)加工模式的熏干法。歷代本草對(duì)大黃藥材干燥方法均有記載［7-9]，宋平順等［10]發(fā)現(xiàn)，柴禾熏制可使掌葉大黃蒽醌類成分含量升高，但關(guān)于柴禾熏制加工過(guò)程中化學(xué)成分和藥效的變化情況至今尚無(wú)報(bào)道。因此，本研究從以上2 個(gè)方面出發(fā)，探討柴禾熏制不同階段掌葉大黃成分及體外抗氧化活性的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，初步揭示藥材產(chǎn)地熏制加工機(jī)理。

1 材料

1.1 儀器與試劑 Agilent 1260Ⅱ型高效液相色譜儀、Agilent Extend-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）（美國(guó)Agilent 公司）；BT125D 型電子天平、MA 37 型快速水分測(cè)定儀（德國(guó)賽多利斯公司）；Milli-Q 超純水系統(tǒng)（德國(guó)默克生命科學(xué)公司）；FW-400A 型高建萬(wàn)能粉碎機(jī)（北京科偉永興儀器有限公司）；DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；R-200 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi 公司）；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；DHG-9240A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；KQ-300VDE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Multiskan GO 多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司）；96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板（北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司）。

蘆薈大黃素（批號(hào)CHB160628）、大黃素甲醚（批號(hào)CHB150817）、大黃酸（批號(hào)CHB160628）、大黃素（批號(hào) CHB150527）、大黃酚（批號(hào)CHB160914）對(duì)照品均購(gòu)自成都克洛瑪生物科技有限公司，純度≥98%。色譜純甲醇、磷酸（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（美國(guó)Sigma-Aldrich 公司）；維生素C（中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)公司北京制藥廠）；其他試劑均為分析純；水為甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心分析測(cè)試一實(shí)驗(yàn)室自制超純水。

1.2 樣品 掌葉大黃藥材采自甘肅禮縣春天藥業(yè)有限公司同一種植基地，委托當(dāng)?shù)厮庌r(nóng)產(chǎn)地柴禾熏制加工，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院楊錫倉(cāng)主任中藥師鑒定為蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatum L.的根及根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 熏制品制備 新鮮掌葉大黃采收后去掉支根，從中間切成兩半，置于屋內(nèi)棚上，使其切口向下，在棚下?tīng)t中點(diǎn)燃柴禾，不用明火，而用其煙熏制，直至完全熏干。根據(jù)熏制天數(shù)不同，分2 年共12批樣品，分別記為S1.1～S1.7（熏制0、10、15、30、40、60、120 d）及S2.1～S2.5（熏制0、60、100、140、180 d），其中樣品S2.5 為熏制140 d 后下架自然晾干而來(lái)。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2 水分、浸出物測(cè)定

2.2.1 水分 將樣品粉碎，混合均勻，四分法取樣，采用快速水分測(cè)定儀測(cè)定水分，平行3 次，取平均值，結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.2.2 浸出物 取樣品（按干燥品計(jì)）約2 g，精密稱定，按2015 年版《中國(guó)藥典》 四部（通則2201）水溶性浸出物測(cè)定項(xiàng)下熱浸法進(jìn)行浸出物測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.3 總蒽醌、游離蒽醌含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 參考文獻(xiàn)［1]，Agilent Extend-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相甲醇-0.1%磷酸（85∶15）；體積流量1 mL/min；柱溫40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.3.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品適量，加甲醇分別制備成質(zhì)量濃度為84、86、78、84、40 μg/mL 的溶液，各精密吸取2 mL，混勻，即得。

2.3.3 總蒽醌供試品溶液制備 取本品粉末（過(guò)4 號(hào)篩）約0.15 g，精密稱定，參考文獻(xiàn)［1] 報(bào)道的方法處理，即得。

2.3.4 游離蒽醌供試品溶液制備 取本品粉末（過(guò)4 號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，參考文獻(xiàn)［1]報(bào)道的方法處理，即得。

2.3.5 樣品含量測(cè)定 取“2.3.2”下對(duì)照品溶液與“2.3.3”“2.3.4”下供試品溶液，在“2.3.1”項(xiàng)條件下測(cè)定，計(jì)算含量，色譜圖見(jiàn)圖1，結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.4 DPPH 自由基清除率測(cè)定

2.4.1 DPPH 貯備液制備 精密稱取DPPH 試劑2.0 mg，甲醇溶解定容至25 mL，即得（80 μg/mL），避光置于4 ℃冰箱中冷藏備用。

2.4.2 樣品貯備液制備 取各樣品粉末約0.5 g，精密稱定，精密加入60% 乙醇15 mL，超聲（300 W）提取30 min，抽濾，濾液旋干，殘?jiān)蛹状既芙猓?1]，定容至100 mL，取1 mL，甲醇定容至10 mL，即得（500 μg/mL），放入4 ℃冰箱中冷藏，以配制不同質(zhì)量濃度的樣品溶液。

2.4.3 維生素C 對(duì)照液制備 取維生素C 適量，加甲醇溶解，制備成質(zhì)量濃度為100 μg/mL 的溶液，即得。

2.4.4 自由基清除率測(cè)定 取上述溶液，分別稀釋成25、50、100、200、300、400、500 μg/mL 和5、10、20、40、60、80、100 μg/mL，在96 孔板上加入不同質(zhì)量濃度的樣品、DPPH 溶液各100 μL，室溫避光反應(yīng)30 min，于517 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度Ai、100 μL 甲醇與100 μL DPPH 溶液混合后吸光度Ao、100 μL 樣品溶液與100 μL 甲醇混合后吸光度Aj，平行3 次，取平均值，按公式［1-（Ai-Aj）/Ao] 計(jì)算清除率，同法處理維生素C 對(duì)照液，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 各樣品DPPH 自由基清除率與IC50值Fig.3 DPPH free radical scavenging rates and IC50 values of various samples

2.4.5 IC50值計(jì)算運(yùn)用SPSS 19.0 軟件中的Probit 分析功能，以清除率為響應(yīng)頻率，觀測(cè)值匯總100%，質(zhì)量濃度為協(xié)變量，模型為L(zhǎng)ogit。

2.5 相關(guān)性分析

2.5.1 熏制天數(shù)與各指標(biāo) 以熏制天數(shù)為自變量，水分、浸出物、總蒽醌含量及抗氧化活性（IC50）為因變量進(jìn)行Pearson 相關(guān)性檢驗(yàn)。結(jié)果顯示，熏制天數(shù)與水分、總蒽醌、IC50的相關(guān)系數(shù)分別為-0.906（P=0.000）、0.888（P=0.000）、-0.920（P=0.000），雙側(cè)P 均＜0.01，提示熏制天數(shù)與水分呈負(fù)直線相關(guān)，與總蒽醌含量和抗氧化活性呈正直線相關(guān)；與浸出物的相關(guān)系數(shù)為0.631（P=0.028），雙側(cè)P＜0.05，結(jié)合圖2 可認(rèn)為熏制天數(shù)與浸出物整體呈正相關(guān)，隨著熏制天數(shù)的增加浸出物先呈上升趨勢(shì)，在60 d 后逐漸趨于穩(wěn)定。

2.5.2 抗氧化活性（IC50）與各指標(biāo) 以抗氧化活性（IC50）為自變量，水分、浸出物、總蒽醌含量為因變量進(jìn)行Pearson 相關(guān)性檢驗(yàn)。結(jié)果顯示，IC50與水分、浸出物、總蒽醌的相關(guān)系數(shù)分別為0.961（P=0.000）、-0.751（P=0.005）、-0.766（P=0.004），雙側(cè)P 均＜0.01，提示抗氧化活性與水分呈負(fù)相關(guān)，與浸出物、總蒽醌含量呈正相關(guān)。

2.5.3 其他指標(biāo) 水分與浸出物的相關(guān)系數(shù)為-0.753（P=0.005），與總蒽醌的相關(guān)系數(shù)為-0.811（P=0.001），雙側(cè)P 均＜0.01，表明水分與浸出物、總蒽醌含量呈負(fù)相關(guān)。

游離蒽醌含量與各項(xiàng)指標(biāo)之間均無(wú)相關(guān)性，結(jié)合t 檢驗(yàn)可知，隨著熏制天數(shù)增加，兩相鄰采樣點(diǎn)游離蒽醌含量變化顯著（P＜0.05），整體呈近“M”型變化趨勢(shì)，表明熏制過(guò)程中游離蒽醌變化復(fù)雜，但機(jī)制尚不明確。

2.6 化學(xué)模式識(shí)別

2.6.1 主成分分析 以12 批熏制不同天數(shù)樣品的水分、浸出物、總蒽醌、游離蒽醌、IC50值作為特征變量值，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1 軟件進(jìn)行主成分分析，以主成分得分及各變量載荷為依據(jù)，結(jié)果見(jiàn)圖4。由此可知，第1 主成分的方差百分比為65.364%，第2 主成分的方差百分比為19.875%，累積方差百分比為85.239%，可以表征原始數(shù)據(jù)特征；12 批樣品聚為4 大類，從左至右分別為熏制120～140 d、熏制40～100 d、熏制15～30 d、熏制0 d，對(duì)應(yīng)藥材質(zhì)量為“最優(yōu)”“較好”“次之”“較差”，表明熏制不同天數(shù)藥材所含水分、浸出物、總蒽醌、游離蒽醌含量及抗氧化活性存在顯著差異，所建立的模型良好，可以對(duì)不同質(zhì)量藥材進(jìn)行有效區(qū)分。由圖5 可知，水分、浸出物、總蒽醌及IC50在第1 主成分中具有較大載荷，表明熏制天數(shù)影響水分、浸出物、總蒽醌含量及抗氧化活性，四者之間可能存在交互作用；第2 主成分與游離蒽醌密切相關(guān)，表明掌葉大黃藥材經(jīng)熏制后游離蒽醌變化明顯。

圖4 12 批樣品主成分分析圖Fig.4 Principal component analysis plot for twelve batches of samples

圖5 12 批樣品各變量載荷圖Fig.5 Variable load graph of twelve batches of samples

2.6.2 偏最小二乘判別分析（PLS-DA）在主成分分析的基礎(chǔ)上進(jìn)行PLS-DA［12]，獲得樣品分布散點(diǎn)圖，見(jiàn)圖6。由此可知，12 批樣品根據(jù)熏制天數(shù)被分為4 類，表明不同熏制天數(shù)下藥材差異顯著。

圖6 各樣品OPLS-DA 得分散點(diǎn)圖Fig.6 OPLS-DA score scatter plot for various samples

12 批樣品PLS-DA 模型中各變量的VIP［13]見(jiàn)圖7，VIP 越大，表明該變量對(duì)于樣品分類的貢獻(xiàn)越大。由此可知，5 個(gè)變量對(duì)于差異性的影響程度依次為游離蒽醌＞IC50＞水分＞總蒽醌＞浸出物，均為重要變量（VIP＞0.5），其中游離蒽醌的VIP＞1.0，表明其變化是導(dǎo)致藥材質(zhì)量差異的重要因素。

圖7 各樣品PLS-DA VIP 圖Fig.7 PLS-DA VIP plot of various samples

3 討論

自由基是單質(zhì)或化合物均裂產(chǎn)生的帶有未成對(duì)電子的原子或基團(tuán)，研究發(fā)現(xiàn)其與心血管疾病（CVD）、惡性腫瘤、2 型糖尿病、感染機(jī)制、纖維形成和神經(jīng)紊亂等多種疾病的發(fā)生有密切的關(guān)系［14-15]。研究發(fā)現(xiàn)，大黃提取物的抗氧化活性與蒽醌類成分有一定的相關(guān)性［16]。課題組前期以大黃加工品的折干率、蒽醌衍生物含量及橫切面質(zhì)地和色澤變化為指標(biāo)，比較了曬干法、陰干法、微波法、不同溫度烘干和傳統(tǒng)柴火熏制等不同干燥方式，結(jié)果顯示不同干燥方式以熏干法的蒽醌類成分含量、橫切面色澤質(zhì)量最好［17]。

熏干法的具體操作參考文獻(xiàn)［18]，本研究結(jié)果表明，掌葉大黃藥材在熏制過(guò)程中化學(xué)成分和體外抗氧化活性發(fā)生顯著變化。隨著熏制天數(shù)增加，水分降至安全范圍，浸出物和抗氧化活性先增加后趨于穩(wěn)定，總蒽醌含量呈“單項(xiàng)遞增”模式，游離蒽醌“先增后減，再增再減”，即近“M”型變化模式。蒽醌類成分所呈現(xiàn)的變化模式在其飲片炮制過(guò)程中也有類似表現(xiàn)，楊麗等［19]在研究大黃炭加熱過(guò)程顏色特征與14 種成分含量變化關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)隨著加熱溫度升高，游離蒽醌呈“先增后減”變化趨勢(shì)，并推測(cè)導(dǎo)致該變化的原因可能是溫度升高導(dǎo)致結(jié)合蒽醌苷鍵斷裂形成游離蒽醌，而加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)后又使得游離蒽醌結(jié)構(gòu)被破壞，游離蒽醌的羰基先降解由苯醌轉(zhuǎn)化成萘醌，再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成醛或酮；另外有關(guān)大黃發(fā)酵使結(jié)合蒽醌轉(zhuǎn)化為游離蒽醌的研究報(bào)道較為常見(jiàn)［20]，而綜合炒炭、發(fā)酵等炮制方法發(fā)現(xiàn)均與發(fā)熱現(xiàn)象或微生物的參與有關(guān)，推測(cè)大黃藥材采收之后，在一定含水量、適宜溫度、相關(guān)微生物酶的參與下，其次生代謝產(chǎn)物蒽醌類成分的轉(zhuǎn)化和積累仍十分活躍，故總蒽醌含量呈“單項(xiàng)遞增”模式，而游離蒽醌的變化較為復(fù)雜。課題組將在后期進(jìn)行相關(guān)微生物酶方面的研究，以期明確其變化機(jī)理，為進(jìn)一步闡明熏制加工機(jī)制和規(guī)范產(chǎn)地加工技術(shù)提供參考。

致謝：衷心感謝甘肅禮縣春天藥業(yè)有限公司、蘭州大學(xué)胡芳弟教授、甘肅省中醫(yī)院閆治攀主管中藥師以及課題組成員馬冬妮、楊秀娟、石琪奇等對(duì)本研究提供的指導(dǎo)和幫助。