基于HPLC 指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識別分析相思子葉質(zhì)量

何翠敏，黃偉斌，邱 雨，袁旭江

（廣東藥科大學(xué)新藥研發(fā)中心/國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級實(shí)驗(yàn)室/廣東省教育廳現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006）

相思子Abrus precatorius L.為豆科蝶形花亞科相思子屬植物的帶根全草，俗稱印度甘草，原產(chǎn)于印尼，現(xiàn)廣泛分布于世界各地的熱帶和亞熱帶地區(qū)，我國廣東、廣西等地均有分布，為習(xí)用中草藥，首載于 《千金要方》，其味甘性涼，歸肺、肝、腎經(jīng)，具有清熱解毒、利尿消炎、潤肺護(hù)肝的功效，民間常用于治療咽喉腫痛、肺熱咳嗽、疥瘡乳癰、肝炎等［1-4]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，相思子富含黃酮［5-6]，如牡荊素［5]、相思子素［5]、芒柄花黃素［5]、濱薊黃素［6]、濱薊黃苷［6]、異柚葡糖苷［5]等；生物堿［6]，如刺桐堿、相思子堿等；三萜［6-8]，如甘草酸［6]，麥角固醇［7]，豆甾醇［7]，abrusoside A、B、C、D［8]等；醌［9-10]，如abruquinone A、B、D、J、K、L、I、H；氨基酸［11]，如賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸等，具有鎮(zhèn)痛抗炎［12]、抗氧化［13]、免疫調(diào)節(jié)［14]、殺蟲抑菌［15-16]、抗腫瘤［17]等活性。但相思子尚未納入《中國藥典》 中，而相思藤載錄于2004年《廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》 第1 版第2 冊，缺乏先進(jìn)的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，也未見相思子葉指紋圖譜研究，因此，建立先進(jìn)全面的藥材質(zhì)量分析和控制方法尤為重要。

指紋圖譜具有系統(tǒng)性、特征性和穩(wěn)定性，能比較全面地反映中藥所含化學(xué)成分的種類和數(shù)量，為評價(jià)中藥質(zhì)量、闡明復(fù)雜的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供科學(xué)的技術(shù)手段［18]?；瘜W(xué)模式識別主要分析數(shù)據(jù)的差異性，近年來廣泛應(yīng)用于中藥鑒別、定性表征、質(zhì)量控制、組效關(guān)系等研究中，它對HPLC、UPLCQ-TOF/MS、IR、NMR 等多種現(xiàn)代儀器分析獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行客觀分析，既可對多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，又可將整個(gè)圖譜信息數(shù)量化，被計(jì)算機(jī)識別與處理，從而可以更加客觀地反映中藥質(zhì)量信息，達(dá)到全面控制評價(jià)的目的［19-20]。前期已經(jīng)開展了相思子葉成分分離、提取工藝、含量測定等相關(guān)研究［6，21-23]，本實(shí)驗(yàn)將在此基礎(chǔ)上采用HPLC 技術(shù)建立藥材指紋圖譜，結(jié)合聚類分析、主成分分析評價(jià)不同來源藥材質(zhì)量情況，進(jìn)一步結(jié)合熱圖分析揭示其質(zhì)量差異與成分的關(guān)系，以期為其質(zhì)量評價(jià)和今后開發(fā)研究提供參考。

1 材料

Agilent 1100 型高效液相色譜儀（含DAD 檢測器，美國Agilent 公司）；JJ500Y 型電子分析天平（0.01 g，廣州市晶博電子有限公司）；BS124S 型電子分析天平（0.000 1 g，德國Sartorius 公司）；KQ3200 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。濱薊黃苷對照品為廣東藥科大學(xué)新藥研發(fā)中心自制，純度＞99%。甲醇、乙腈為色譜純；甲酸等其余試劑均為分析純；水為超純水。14 批相思子葉采自廣東、廣西和越南，經(jīng)廣東藥科大學(xué)新藥研發(fā)中心袁旭江副研究員鑒定為豆科植物相思子Abrus precatorius L.的干燥葉子。具體信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相0.1% 甲酸（A）-（甲醇-乙腈）（8∶2）（B），梯度洗脫，程序見表2；體積流量1.0 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長275 nm；進(jìn)樣量10 μL。

表2 梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution programs

2.2 供試品溶液制備 取干燥相思子葉粉末1 g，精密稱定，置于錐形瓶中，加50%乙醇50 mL，加熱回流提取2 次，每次1 h，合并2 次濾液并濃縮，50%乙醇定容至50 mL 量瓶中，即得（質(zhì)量濃度為20 mg/mL）。

2.3 對照品溶液制備 取105 ℃烘箱中干燥至恒定質(zhì)量的濱薊黃苷對照品適量，精密稱定，加50%乙醇溶解并定容至50 mL，即得（質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL）。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 以濱薊黃苷色譜峰為參照峰（S），取供試品溶液（S1），在“2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算得到各共有峰相對保留時(shí)間RSD 小于0.35%，相對峰面積RSD 小于2.4%；取同一供試品溶液（S1），在“2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣3 次，重復(fù)3 d，測得各共有峰相對保留時(shí)間RSD 小于0.49%，相對峰面積RSD 小于3.8%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 以濱薊黃苷色譜峰為參照峰（S），取供試品溶液（S1），在“2.1”項(xiàng)色譜條件下于0、1、2、4、6、8、12 h 進(jìn)樣測定，測得各共有峰相對保留時(shí)間RSD 小于0.30%，相對峰面積RSD 小于2.7%，表明溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 以濱薊黃苷色譜峰為參照峰（S），取同一批藥材（S1）6 份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得各共有峰相對保留時(shí)間RSD 小于0.48%，相對峰面積RSD 小于3.4%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜建立

2.5.1 圖譜生成 取14 批樣品的供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2004A 版）”，以S12 號色譜圖為參考，中位數(shù)法建立對照圖譜，時(shí)間窗寬設(shè)為0.1 min，采用多點(diǎn)校正Mark 峰匹配，建立指紋圖譜，見圖1。

圖1 14 批樣品色譜圖Fig.1 Chromatograms of fourteen batches of samples

2.5.2 特征峰標(biāo)定 根據(jù)保留時(shí)間標(biāo)定特征指紋峰，對14 批樣品HPLC 指紋圖譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)14 個(gè)特征峰為其共有峰，由此確定為特征指紋峰，峰面積總和大于90%。通過對14 個(gè)特征峰的紫外光譜圖進(jìn)行分析歸類，可知除了峰1 和峰2 為生物堿外，其余均為黃酮類成分，峰3～7、10 為二氫黃酮，峰8～9、11～14 為黃酮，進(jìn)一步查閱文獻(xiàn)和對照品比對，標(biāo)認(rèn)峰1 為相思子堿，峰2 為刺桐堿，峰12 為濱薊黃苷，峰14 為濱薊黃素。由于濱薊黃苷（圖1 中12 號）色譜峰的峰面積和峰高適中，峰型對稱，分離度高，故以其為參照峰（S），測得共有峰相對保留時(shí)間RSD 為0.14%～0.45%，相對峰面積RSD 為19%～118%，見表3，表明不同來源樣品成分種類穩(wěn)定，但在含量方面具有差異。

表3 14 批樣品14 個(gè)共有峰的相對保留時(shí)間、相對峰面積RSDTab.3 Relative retention time and relative peak area RSDs of fourteen common peaks in fourteen batches of samples

2.6 指紋圖譜評價(jià)

2.6.1 相似度分析 將14 批樣品指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2004A版）”，計(jì)算相似度，結(jié)果見表4，可知S1、S6、S10～S14 相似度最高，均在0.99 以上；S2、S3、S4、S7、S9 樣品次之，介于0.949～0.985 之間；S5、S8 最低，分別為0.879、0.858，表明不同來源樣品的整體質(zhì)量較為穩(wěn)定，但個(gè)別存在一定差異。

表4 14 批樣品相似度Tab.4 Similarities of fourteen batches of samples

2.6.2 聚類分析 采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行聚類分析，將14 批樣品HPLC 色譜圖中的14 個(gè)共有峰峰面積標(biāo)準(zhǔn)化，形成14×14 原始數(shù)據(jù)矩陣，采用Ward 聯(lián)接方法（離差平方和法），以平方歐氏距離為測度，根據(jù)樣品的相似程度進(jìn)行分類，結(jié)果見圖2。由此可知，當(dāng)判別距離為12 時(shí)，14 批樣品分為3 類，S9、S11～14 為第Ⅰ類，除S9 產(chǎn)自越南，其余均產(chǎn)自廣西；S2、S4、S6～S7、S10 為第Ⅱ類，S6～S7 產(chǎn)自廣東，其余均產(chǎn)自廣西；S1、S3、S5、S8 為第Ⅲ類，S3、S8 產(chǎn)自廣東，其余均產(chǎn)自廣西，表明兩廣藥材質(zhì)量沒有明顯地域分類；產(chǎn)自廣西玉林的樣品（S5、S4、S13、S14）在Ⅰ～Ⅲ類中均有分布，批間穩(wěn)定性有差異，可能與栽培、采收、加工方式等不同有關(guān)。

圖2 14 批樣品聚類樹狀圖Fig.2 Dendrogram of fourteen batches of samples

2.6.3 主成分分析 將14 批樣品14 個(gè)共有峰的峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，導(dǎo)入SPSS 26.0 軟件進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見圖3、表5。根據(jù)特征值＞1提取出4 個(gè)主成分（Principal Component，PC），累積貢獻(xiàn)率為85.99%，包含了該指紋圖譜的大部分信息。碎石圖顯示，4 種主成分坡度較陡，是評價(jià)藥材質(zhì)量的標(biāo)志性成分。由于PC1、PC2、PC3的累積貢獻(xiàn)率達(dá)74.24%，可代表藥材指紋圖譜的大部分信息，反映了其基本特征，故以三者得分繪制三維散點(diǎn)圖，見圖4，可見樣品大多數(shù)聚在一起，其中S5、S8 和其他樣品的距離相對較遠(yuǎn)，與指紋圖譜相似度、聚類分析結(jié)果一致。

圖3 14 批樣品主成分分析碎石圖Fig.3 Gravel graph of principal component analysis for fourteen batches of samples

表5 主成分初始特征值和方差Tab.5 Initial eigenvalues and variances of principal components

圖4 14 批樣品主成分分析圖Fig.4 Principal component analysis plot for fourteen batches of samples

2.6.4 熱圖分析 由圖5 可知，275 nm 波長下色譜圖最具代表性，各色譜峰分離度均大于1.5，塔板數(shù)大于10 000；共有峰5～7、11～12 的峰面積之和占總共有峰峰面積的92.41%；峰12 峰面積顏色變動最大，其次為峰5、6、11、7，其余各色譜峰峰面積較小，顏色變化不明顯，影響程度依次為峰12＞5＞6＞11＞7，其余9 個(gè)小峰影響程度依次為峰14＞13＞2＞1＞9＞8＞10＞3＞4。

圖5 14 批樣品共有峰峰面積聚類熱圖Fig.5 Cluster heat maps of the peak areas of fourteen batches of samples

綜上所述，峰5～7、11～12 是藥材最主要成分，其次為1～2、13～14，可作為質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)考察了不同型號色譜柱Hypersil BDS C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Hypersil BDS C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX SBC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、JADE-PAK ODSAQ（4.6 mm×250 mm，5 μm），有機(jī)相甲醇、乙腈、甲醇-乙腈（8∶2），流動相純水、0.1%甲酸、0.3% 甲酸、0.5% 甲酸、1.0% 甲酸，體積流量0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min 對色譜峰分離度的影響，并比較了不同檢測波長下色譜峰數(shù)量及峰高，最終確定為“2.1”項(xiàng)下條件。

在14 批樣品HPLC 指紋圖譜中，以濱薊黃苷為參照峰（S）確定了14 個(gè)共有峰，相似度除了2批相對較低外，其余均在0.949 以上，表明相思子葉整體質(zhì)量相對穩(wěn)定。聚類分析、主成分分析結(jié)果顯示，樣品質(zhì)量差異可分成3 類，但與地域無關(guān)，關(guān)鍵在于各成分含量及其比例是否穩(wěn)定，而這種穩(wěn)定可能與采收期有關(guān)。熱圖分析結(jié)果顯示，樣品質(zhì)量差異依次與9 種成分色譜峰有關(guān)，可作為日后相思子葉質(zhì)量控制和評價(jià)的候選指標(biāo)。

綜上所述，本研究首次建立了相思子葉HPLC指紋圖譜評價(jià)和化學(xué)模式識別分析，該方法穩(wěn)定、快速、可靠，能夠有效、準(zhǔn)確地評價(jià)相思子葉質(zhì)量情況及其與成分的關(guān)系。