當歸、川芎聯(lián)合應用對肺纖維化模型大鼠TGF-β1/Smad 信號通路的影響

王麗娟，董小鵬，杜 弢

（1.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730020）

肺纖維化是多種原因引起的慢性肺部疾病的共同結局，一旦形成很難逆轉，其死亡率甚至高于某些癌癥［1]。目前，肺纖維化常用的治療藥物如糖皮質激素、免疫抑制劑等毒副作用較大。研究表明，中草藥在治療肺纖維化方面有一定應用價值［2-4]，當歸與川芎單獨使用時對于肺纖維化有作用，但兩者合用時能否起到協(xié)同作用尚未有實驗報道。本研究通過檢測當歸、川芎及其不同配比對肺纖維化模型大鼠肺功能、肺組織病理形態(tài)學改變、肺組織TGF-β1/Smad 信號通路的影響，以篩選兩者最佳配比，并探討其潛在機理。

1 材料

1.1 動物 SPF 級SD 大鼠80 只，雄性，體質量（160±20）g，購自甘肅中醫(yī)藥大學SPF 級動物實驗中心，實驗動物生產許可證號SCXK（甘）2015-0002。

1.2 試劑與藥物 博來霉素（北京索萊寶科技有限公司）；醋酸潑尼松片（天津天藥藥業(yè)股份有限公司）。當歸、川芎均購自甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，經甘肅中醫(yī)藥大學杜弢教授鑒定分別為傘形科植物當歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels 的根、傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的根莖。TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κB 雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司）；羥脯氨酸檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；TGF-β1、Smad2、Smad3、α-SMA一抗，二抗、SABC 免疫組化染色試劑盒、DAB 顯色試劑盒（AR1022）（武漢博士德生物工程有限公司）；TRIzol（美國Invitrogen 公司）；反轉錄試劑盒及熒光定量試劑（日本TaKaRa 公司）；PCR引物（上海生工生物工程有限公司合成）。

1.3 儀器 WPB PLT-UNR-RT-2 型動物肺功能檢測系統(tǒng)（法國EMKA 公司）；Vanox 型光學顯微鏡（日本Olympus 公司）；臺式高速低溫離心機（德國Heraeus 公司）；680 型全波長酶標檢測儀（美國Bio-Rad 公 司）；Applied Biosystems Step One PlusTM型實時定量PCR 儀（美國Agilent 公司）。

2 方法

2.1 藥物制備 稱取一定量當歸、川芎、兩者不同配比（2∶1、1∶1、1∶2）的混合藥材，按照常規(guī)法制備相應水煎液，即得。

2.2 分組及建模 將大鼠隨機分為8 組，即正常對照組，肺纖維化模型組，強的松組（陽性對照組），當歸組，川芎組，當歸、川芎（2∶1、1∶1、1∶2）水煎液給藥組，每組10 只，采用博來霉素氣管內滴入法制備肺纖維化模型［5-6]。大鼠用10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉后仰臥固定，無菌操作下作約0.5～1 cm 頸中切口。逐層剝離暴露氣管，用1 mL 注射器刺入氣管，快速推注鹽酸博來霉素生理鹽水溶液0.2～0.3 mL（劑量為5 mg/mL，按5 mg/kg 體質量給藥），而正常對照組氣管內注入等量生理鹽水，縫合皮膚后置籠內常規(guī)飼養(yǎng)。

2.3 給藥 造模后第2 天，當歸、川芎各給藥組大鼠按照正常成人每1 kg 體質量用藥量的15 倍計算，強的松組以5 mg/kg 劑量灌胃，而正常組和肺纖維化模型組大鼠灌胃給予等容積生理鹽水，每天1 次，連續(xù)4 周。

2.4 標本采集 給藥結束并檢測肺功能后，大鼠股動脈取血，分離血清，-20 ℃冰箱凍存。處死大鼠并迅速分離雙肺，每組取5 只用于制備肺泡灌洗液，剩余5 只取左肺上葉，10%甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，用于組織病理學及免疫組化檢測；取左肺下葉制備肺組織勻漿，用于羥脯胺酸水平檢測；取右肺上葉液氮凍存，用于RT-PCR檢測。

2.5 指標檢測

2.5.1 肺功能指標 末次給藥后1 h 每組隨機取5只大鼠，麻醉后插入氣管插管，將其仰臥位固定在小動物呼吸機的密閉體積描記箱平板上，檢測頻率、吸氣時間、呼氣時間、每分鐘通氣量。

2.5.2 肺泡灌洗液中炎癥因子水平 采用ELISA試劑盒，檢測肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κB 水平。

2.5.3 肺組織羥脯胺酸水平 采用相應試劑盒，進行肺組織勻漿中羥脯胺酸水平的檢測。

2.5.4 肺組織病理形態(tài)學 石蠟切片行常規(guī)HE及Masson 染色，每張切片選取上、下、左、右、中5 個視野，參考Szapiel［7]等報道，分別用HE、Masson 染色計算肺泡炎、肺纖維化積分。

2.5.5 肺組織TGF-β1/Smad 信號通路關鍵分子蛋白表達 采用免疫組化法，檢測正常對照組、肺纖維化模型組、當歸、川芎1∶2 組大鼠肺組織TGFβ1、Smad2、Smad3、α-SMA 表達。以棕黃色為陽性染色，在400 倍鏡下每張切片隨機選取5 個視野，用Image-Pro Plus6.0 圖像分析系統(tǒng)軟件測定累積光密度值（IOD），取平均值。

2.5.6 肺組織TGF-β1/Smad 信號通路關鍵分子mRNA 表達 用TRIzol 法從大鼠肺組織中提取出總RNA，反轉錄合成cDNA 并以其為模板，采用兩步法進行PCR 反應（75 ℃，120 s；95 ℃，5 min；60 ℃，60 s；72 ℃，30 s），共40 個循環(huán)，以βactin 為內參，用2-ΔΔCt表示mRNA 相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.6 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 23.0 軟件進行處理，正態(tài)分布以（）表示，組間比較用單因素方差分析（One-way ANOVA）。 P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 肺功能指標 與正常對照組比較，肺纖維化模型組大鼠各項肺功能指標出現(xiàn)異常，強的松組和當歸、川芎組可改善上述部分指標，以當歸、川芎1∶2 組作用最明顯，見表2。

表2 當歸、川芎不同配比對麻醉大鼠肺功能指標的影響（，n=5）Tab.2 Effects of different proportions of Angelica sinensis and Chuanxiong on pulmonary function indices in anesthetized rats（，n=5）

表2 當歸、川芎不同配比對麻醉大鼠肺功能指標的影響（，n=5）Tab.2 Effects of different proportions of Angelica sinensis and Chuanxiong on pulmonary function indices in anesthetized rats（，n=5）

注：與正常對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與肺纖維化模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與強的松組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.2 當歸、川芎及其不同配比對肺泡灌洗液中炎癥因子水平的影響 肺纖維化模型大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子TNF-α、IL-6、NF-κB 高于正常對照組；強的松組大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子水平下降，介于正常對照組及模型組之間；當歸組、川芎組大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子TNF-α、IL-6、NFκB 水平接近模型組，高于正常對照組，以當歸、川芎1∶2 組抗炎作用較為明顯，見表3。

表3 當歸、川芎及其不同配比對肺纖維化大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子水平的影響（，n=5）Tab.3 Effects of Angelica sinensis，Chuanxiong and their different compatibility ratios on the levels of inflammatory factors in alveolar lavage fluid of rats with pulmonary fibrosis（，n=5）

表3 當歸、川芎及其不同配比對肺纖維化大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子水平的影響（，n=5）Tab.3 Effects of Angelica sinensis，Chuanxiong and their different compatibility ratios on the levels of inflammatory factors in alveolar lavage fluid of rats with pulmonary fibrosis（，n=5）

注：與正常對照組比較，△P＜0.05；與肺纖維化模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與強的松組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.3 當歸、川芎及其不同配比對肺組織羥脯胺酸水平的影響 肺纖維化模型組大鼠羥脯胺酸水平高于正常對照組，而當歸、川芎1∶2 組水平減少，與肺纖維化模型組比較有統(tǒng)計學差異（P ＜0.05，P＜0.01），其余各給藥組均高于正常對照組，見表4。

表4 當歸、川芎及其不同配比對羥脯胺酸水平的影響（，n=5）Tab.4 Effects of Angelica sinensis，Chuanxiong and their different compatibility ratios on the level of hydroxyproline（，n=5）

表4 當歸、川芎及其不同配比對羥脯胺酸水平的影響（，n=5）Tab.4 Effects of Angelica sinensis，Chuanxiong and their different compatibility ratios on the level of hydroxyproline（，n=5）

注：與正常對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與肺纖維化模型組比較，＃P＜0.05。

3.4 肺組織組織病理學觀察 正常對照組大鼠肺組織結構完整，肺泡大小均勻，肺泡間隔無增厚及炎性細胞侵潤，Masson 染色顯示肺血管壁和氣管周圍及肺泡間隔可見少量藍色膠原纖維沉積，無肺泡炎及肺纖維化表現(xiàn)；肺纖維化模型組大鼠肺泡大小不等，結構破壞明顯，部分肺泡腔呈囊狀擴張或萎陷，肺泡間隔增寬，肺泡壁增厚，有較多炎性細胞侵潤，肺間質可見大量的成纖維細胞及細胞外基質堆積，Masson 染色可見肺血管壁、支氣管壁和肺泡間隔有大量藍色膠原纖維沉積，表明大鼠肺纖維化模型構建成功；強的松組大鼠肺組織結構相對完整，部分肺泡萎陷，肺泡間隔縮小，少量炎癥細胞浸潤，纖維組織增生較模型組減輕，Masson 染色可見肺泡間隔膠原纖維表達較模型組顯著減少；當歸、川芎組及兩者不同配比組大鼠肺泡結構破壞較輕，有部分局灶性改變，肺泡間隔輕度增厚、少量成纖維細胞增生，部分可見中性粒細胞等早期炎性細胞數(shù)量，Masson 染色可見藍色膠原沉積及梭形的成纖維細胞，以1∶2 組織病理學改變最輕。見圖1～2。

圖1 各組HE 染色結果（×400）Fig.1 Results of HE staining in various groups（×400）

圖2 各組Masson 染色結果（×400）Fig.2 Results of Masson staining in various groups（×400）

3.5 肺泡炎和肺纖維化分級計分的定量分析結果 模型組大鼠肺泡炎及肺纖維化計分高于正常對照組，提示模型制備成功；強的松組大鼠肺泡炎及肺纖維化計分低于肺纖維化模型組；當歸、川芎配伍后，肺泡炎及肺纖維化計分有下降趨勢，以1∶2組更明顯，見表5。

表5 當歸、川芎及其不同配比對肺纖維化積分的影響（，n=5）Tab.5 Effects of Angelica sinensis，Chuanxiong and their different compatibility ratios on the pulmonary fibrosis grading（，n=5）

表5 當歸、川芎及其不同配比對肺纖維化積分的影響（，n=5）Tab.5 Effects of Angelica sinensis，Chuanxiong and their different compatibility ratios on the pulmonary fibrosis grading（，n=5）

注：與正常對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與肺纖維化模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與強的松組比較，*P＜0.05。

3.6 當歸川芎1∶2 配比對肺組織TGF-β1/Smad信號通路的影響 模型組關鍵分子的mRNA 及蛋白表達均高于正常對照組，而當歸、川芎1∶2 組關鍵分子表達下降，見圖3～6、表6～7。

表6 當歸、川芎聯(lián)用對TGF-β1/Smad 信號通路關鍵分子mRNA 表達的影響（，n=5）Tab.6 Effect of combination use of Angelica sinensis and Chuanxiong on the key molecule mRNA expression of TGF-β1/Smad pathway（，n=5）

表6 當歸、川芎聯(lián)用對TGF-β1/Smad 信號通路關鍵分子mRNA 表達的影響（，n=5）Tab.6 Effect of combination use of Angelica sinensis and Chuanxiong on the key molecule mRNA expression of TGF-β1/Smad pathway（，n=5）

注：與正常對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與肺纖維化模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

圖3 各組TGF-β1 免疫組化染色結果（×400）Fig.3 Results of immunohistochemical staining for TGF-β1 in various groups（×400）

圖4 各組Smad2 免疫組化染色結果（×400）Fig.4 Results of immunohistochemical staining for Smad2 in various groups（×400）

圖5 各組Smad3 免疫組化染色結果（×400）Fig.5 Results of immunohistochemical staining for Smad3 in various groups（×400）

圖6 各組α-SMA 免疫組化染色結果（×400）Fig.6 Results of immunohistochemical staining for α-SMA in various groups（×400）

3 討論

肺纖維化主要表現(xiàn)為成纖維細胞增殖、大量細胞外基質（ECM）聚集并伴有炎性損傷和嚴重的結構破壞，肺泡呈進行性和不可逆性瘢痕化，使得肺泡上皮細胞面積減少，最終導致呼吸衰竭［8]。中醫(yī)藥具有多環(huán)節(jié)、多靶點的作用特點，從中尋找治療肺纖維化的有效藥物是一種切實可行的思路，益氣活血通絡法是治療本病的共識，活血化瘀法貫徹始終［9-10]。當歸和川芎都具有活血化瘀的功效，兩者組成的藥對是臨床中常見的配伍形式。當歸及其復方具有抗肺纖維化的作用［11-12]，川芎也可作為肺纖維化的臨床輔助治療藥物［13]，但藥對是否也具有相同作用尚未見有報道。

表7 當歸、川芎聯(lián)用對TGF-β1/Smad 信號通路關鍵分子蛋白表達的影響（，n=5）Tab.7 Effect of combination use of Angelica sinensis and Chuanxiong on the key molecule protein expression of TGF-β1/Smad pathway（，n=5）

表7 當歸、川芎聯(lián)用對TGF-β1/Smad 信號通路關鍵分子蛋白表達的影響（，n=5）Tab.7 Effect of combination use of Angelica sinensis and Chuanxiong on the key molecule protein expression of TGF-β1/Smad pathway（，n=5）

注：與正常對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與肺纖維化模型組比較，＃P＜0.05。

大量研究表明，肺纖維化的發(fā)生機制主要與早期的炎癥反應和隨后的纖維化增生有關［14]。NFκB 信號通路是介導炎癥反應的重要因素，很多抗肺纖維化治療的藥物都以該通路及通路中的重要分子如TNF-α、NF-κB 等為靶點［15-16]。而在隨后的纖維化階段，TGF-β1 則是啟動和進程的關鍵因子。Smad2、Smad3 是TGF-β1 信號轉導中最重要的分子，可結合形成復合物轉入核內調節(jié)反向基因的轉錄［17-18]。抑制TGF-β1/Smad 信號通路也成為肺纖維化治療的一個角度［19]。此外，在肺纖維化發(fā)生發(fā)展過程中，NF-κB 信號通路還可以調節(jié)反向TGF-β1/Smad 信號通路［20]，正成為肺纖維化治療的重要靶點。

本研究首先對當歸川芎以臨床常用的幾種比例進行配伍，以肺功能、肺組織羥脯胺酸、肺泡灌洗液中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κB 水平、肺組織病理學評分為觀察指標，發(fā)現(xiàn)當歸川芎配伍使用時具有一定治療肺纖維化的作用，其中當歸川芎以1∶2 配伍時療效優(yōu)于其余兩種配伍方式。隨后，以TGF-β1 信號通路的關鍵分子TGF-β1、Smad2、Smad3、α-SMA 為檢測指標，發(fā)現(xiàn)當歸川芎以1∶2 配伍時對該通路有部分阻斷作用，呈現(xiàn)治療肺纖維化的潛在價值。

綜上所述，TGF-β1/Smad 信號通路的激活是肺纖維化的致病因素之一，當歸川芎以1∶2 配伍使用時能有效改善肺功能及減輕組織病理學改變可能與其抑制TGF-β1/Smad 信號通路有關，但具體機制尚需進一步實驗論證。