一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定五苓膠囊中8 種成分

蘇鳳芹，陳 衛(wèi)，陳秀娟，吳慧煒，孫銘軍，陳海燕

（1.濟(jì)南市人民醫(yī)院藥劑科，山東 濟(jì)南 271199；2.萊蕪職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)與護(hù)理系，山東 濟(jì)南 271100；3.廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)系，廣西 南寧 530023）

五苓膠囊由澤瀉、茯苓、豬苓、肉桂、麩炒白術(shù)5 味中藥加工而成，收載于2020 年版《中國(guó)藥典》 一部［1]，具有利尿、增強(qiáng)免疫、保護(hù)肝臟、抗腫瘤、抗輻射等作用，可明顯降低高血壓病患者動(dòng)脈血壓及血尿酸水平［2-3]，聯(lián)合培哚普利可改善臨床癥狀［4]；增強(qiáng)良性前列腺增生癥術(shù)后膀胱逼尿肌收縮力，顯著改善排尿障礙［5]，減輕早期糖尿病腎病患者腎小球及腎小管損傷［6]；降低前列腺癌患者血清中微小核糖核酸-141 表達(dá)［7]；改善抗精神病藥物引起水腫［8]等。但五苓膠囊現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［1，9]僅對(duì)方中肉桂所含桂皮醛進(jìn)行定量控制，而中成藥復(fù)方制劑是多種成分的集合體，按照中醫(yī)配伍君臣佐使理論相互協(xié)調(diào)制約，從而達(dá)到整體臨床療效。因此，本實(shí)驗(yàn)采用一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定五苓膠囊中豬苓酮B、豬苓酮A、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、澤瀉醇F、澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇B 的含量，以期為提高該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、全面評(píng)價(jià)其整體質(zhì)量提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Waters 2695 型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；Agilent 1200 型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；FA2004 型電子天平（德國(guó)Sartorius 公司）；KQ-500E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ（批號(hào)111978-201501，純度 99.9%）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ（批號(hào)111975-201501，純度99.9%）、23-乙酰澤瀉醇B（批號(hào)111846-201705，純度99.7%）對(duì)照品，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；24-乙酰澤瀉醇A（批號(hào)PRF8050342，純度99.7%）、豬苓酮B（批號(hào) PRF8070404，CAS 號(hào) 141360-89-6，純度98.6%）、豬苓 酮A（批號(hào)PRF8081143，純度97.3%）對(duì)照品，均購(gòu)自成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司；澤瀉醇F 對(duì)照品（批號(hào)CFS201701，純度98.0%），購(gòu)自武漢天植生物技術(shù)有限公司；澤瀉醇A 對(duì)照品（批號(hào)15071422，純度97.9%），購(gòu)自上海同田生物技術(shù)股份有限公司。五苓膠囊（每粒裝0.45 g，批號(hào)190203、190413、190604），購(gòu)自江西品信藥業(yè)有限公司。乙腈為色譜純，購(gòu)自天津市彪仕奇科技發(fā)展有限公司；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 精密稱取豬苓酮B、豬苓酮A、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、澤瀉醇F、澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇B 對(duì)照品適量，甲醇制成各成分質(zhì)量濃度分別為0.854、0.378、0.536、0.492、0.158、0.344、0.212、1.196 mg/mL 的貯備液，各精密吸取2.5 mL，甲醇定容至50 mL，即得（各成分質(zhì)量濃度分別為42.7、18.9、26.8、24.6、7.9、17.2、10.6、59.8 μg/mL）。

2.1.2 供試品溶液 取膠囊10 粒，傾出內(nèi)容物，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，精密加入25 mL甲醇，稱定質(zhì)量，超聲提取45 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過(guò)，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液 按2020 年版《中國(guó)藥典》一部五苓膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下的工藝處方，分別制備缺豬苓、缺白術(shù)、缺澤瀉的陰性樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.2 色譜條件及專屬性試驗(yàn) Agilent Polaris C18-A色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～9.0 min，25.0%A；9.0～ 17.0 min，25.0%～ 43.0% A；17.0～29.0 min，43.0%～55.0% A；29.0～44.0 min，55.0%～78.0% A；44.0～50.0 min，78.0%～25.0%A）；體積流量0.9 mL/min；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)248 nm（0～17.0 min，豬苓酮B、豬苓酮A）［10]、220 nm（17.0～29.0 min，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ）［11-13]、208 nm（29.0～50.0 min，澤瀉醇F、澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇B）［14-15]；進(jìn)樣量10 μL。精密吸取“2.1.1”至“2.1.3”項(xiàng)下各溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，各成分色譜峰峰形對(duì)稱，分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按各成分色譜峰計(jì)均不低于4 500，陰性無(wú)干擾。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下貯備液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，甲醇稀釋至20 mL，制成6 個(gè)質(zhì)量濃度，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 8 種成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of eight constituents

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得豬苓酮B、豬苓酮A、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、澤瀉醇F、澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇B 峰面積RSD 分別為0.67%、0.95%、0.79%、0.83%、1.18%、1.01%、1.07%、0.56%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批膠囊，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得豬苓酮B、豬苓酮A、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、澤瀉醇F、澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇B 含量RSD 分別為1.03%、1.36%、1.20%、1.17%、0.84%、1.69%、0.78%、0.99%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，于0、2、4、6、12、16 h 在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得豬苓酮B、豬苓酮A、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、澤瀉醇F、澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇B 峰面積RSD 分別為0.71%、0.92%、0.80%、0.85%、1.19%、0.98%、1.04%、0.59%，表明溶液在16 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含量已知的同一批膠囊細(xì)粉約0.25 g，精密稱定，共9 份，按2020年版《中國(guó)藥典》 四部要求，精密加入對(duì)照品溶液（豬苓酮B 0.496 mg/mL、豬苓酮A 0.212 mg/mL、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ0.358 mg/mL、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ0.284 mg/mL、澤瀉醇F 0.088 mg/mL、澤瀉醇A 0.192 mg/mL、24-乙酰澤瀉醇A 0.116 mg/mL、23-乙酰澤瀉醇B 0.684 mg/mL）0.5、1.0、1.5 mL各3 份，水平分別約為50%、100%、150%，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，豬苓酮B、豬苓酮A、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、澤瀉醇F、澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇B 平均加樣回收率（RSD）分別為100.06%（0.78%）、98.69%（0.91%）、98.93%（1.16%）、99.27%（0.97%）、96.99%（1.25%）、97.92%（1.47%）、97.73%（1.33%）、100.01%（0.65%）。

2.4 相對(duì)校正因子計(jì)算 采用多點(diǎn)校正法，取“2.3.1”項(xiàng)下不同質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算其他7 種成分的相對(duì)校正因子f，公式為f=fk/fs=（CkAs）/（CsAk），其中Ck為其他成分含量，Ak為其他成分峰面積，Cs為內(nèi)標(biāo)含量，As為內(nèi)標(biāo)峰面積，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各成分相對(duì)校正因子Tab.2 Relative correction factors of various constituents

2.5 耐用性考察

2.5.1 儀器、色譜柱 取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，考察Waters 2695、Agilent 1200 色譜儀，以及Agilent Polaris C18-A、Topsil C18、Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見(jiàn)表3，可知均無(wú)明顯影響（RSD＜5%）。

表3 不同儀器、色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.3 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.5.2 柱溫 取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，考察柱溫20、22、25、28、30 ℃）對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見(jiàn)表4，可知均無(wú)明顯影響（RSD＜5%）。

表4 不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.4 Effects of different column temperatures on relative correction factors

2.5.3 體積流量 取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，考察體積流量0.7、0.8、0.9、1.0、1.1 mL/min 對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見(jiàn)表5，可知均無(wú)明顯影響（RSD＜5%）。

表5 不同體積流量對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.5 Effects of different volumetric flow rates on relative correction factors

2.6 色譜峰定位 取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ為基準(zhǔn)峰，采用相對(duì)保留時(shí)間法，在“2.5.1”項(xiàng)儀器、色譜柱下對(duì)色譜峰進(jìn)行定位，結(jié)果見(jiàn)表6，可知均無(wú)明顯差異（RSD＜5.0%）。

表6 各成分相對(duì)保留時(shí)間Tab.6 Relative retention time of various constituents

2.7 樣品含量測(cè)定 取3 批膠囊，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每批平行3 份，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，分別采用一測(cè)多評(píng)法、外標(biāo)法計(jì)算各成分含量，結(jié)果見(jiàn)表7，可知2 種方法無(wú)明顯差異［相對(duì)平均偏差（RAD）＜5.0%]。

表7 各成分含量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n=3）Tab.7 Results of content determination of various constituents（mg/g，n=3）

3 討論

五苓膠囊中澤瀉功效利水滲濕、泄熱化濁，為君藥；豬苓、茯苓加強(qiáng)利水滲濕之功，合為臣藥；白術(shù)功效健脾益氣、燥濕利水，為佐藥；肉桂功效補(bǔ)火助陽(yáng)、引火歸元，為使藥，諸藥合用，共奏溫陽(yáng)化氣、利濕行水之功。本實(shí)驗(yàn)參考中藥質(zhì)量標(biāo)志物確定原則［16-17]，選取澤瀉主要藥效成分澤瀉醇F、澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇B，豬苓特征成分豬苓酮B、豬苓酮A，白術(shù)代表性成分特征成分白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ作為五苓膠囊指標(biāo)成分進(jìn)行檢測(cè)。

本實(shí)驗(yàn)以豬苓酮B、豬苓酮A、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、澤瀉醇F、澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇B 的綜合提取率為指標(biāo)，對(duì)提取溶劑（95%乙醇［10]、甲醇［11，13]、水［12]、50%甲醇）、提取方式（加熱回流提取、超聲提?。?0-15]）、提取時(shí)間（30、45、60 min）進(jìn)行考察，最終確定甲醇超聲提取45 min 作為供試品溶液制備方法。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)首次采用一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定五苓膠囊中豬苓酮B、豬苓酮A、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、澤瀉醇F、澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇B 的含量，該方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，有助于藥品生產(chǎn)企業(yè)和監(jiān)管部門不斷完善該制劑質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，并為全面評(píng)價(jià)其內(nèi)在質(zhì)量、確保其臨床療效一致性提供依據(jù)。