石榴皮半仿生提取工藝的優(yōu)化

王京龍，史 磊，鄭丹丹，張立華，王占一，王 飛，孫秀梅，劉紫璇

（1.棗莊學(xué)院，山東 棗莊 277160；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355）

石榴皮屬于傳統(tǒng)收斂固澀藥，為石榴科石榴Punica granatum L.的干燥果皮，臨床常用于久瀉、久痢等癥［1]。它富含鞣質(zhì)等多種酚類成分［2]，具有抗菌［3]、抗病毒［4]、抗腫瘤［5]、抗氧化［6]、保護(hù)胃腸黏膜［7]等藥理作用。

半仿生提取法是基于“灰思維”方式模擬人體胃腸環(huán)境，采用特定酸堿度水依次連續(xù)提取，從生物藥劑學(xué)角度為口服給藥制劑提供的一種新技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于多種活性成分的提?。?-10]。石榴皮中鞣花單寧、沒食子單寧等大分子物質(zhì)［11]脂溶性差，口服給藥后血液中幾乎檢測(cè)不到原型成分，而是以鞣花酸、沒食子酸及其代謝產(chǎn)物為主［12-13]。采用半仿生法提取時(shí)，酸堿環(huán)境有利于鞣質(zhì)的水解，增加鞣花酸等活性成分的提取率。

因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過層次分析法（AHP）、基于指標(biāo)相關(guān)性的權(quán)重確定方法（CRITIC）的混合加權(quán)來優(yōu)化權(quán)重分配［14-15]，再采用均勻試驗(yàn)篩選最佳工藝參數(shù)，優(yōu)化石榴皮半仿生提取工藝。

1 材料

Agilent 1260 高效液相色譜儀，配置四元泵、VWD 檢測(cè)器、柱溫箱，購自美國安捷倫科技公司；UV-2600 紫外-可見全波長掃描儀，購自日本島津公司；MSA-3.6P-0CE-DM 電子天平（百萬分之一），購自德國賽多利斯公司；Vortex 2 渦旋混合儀，購自德國IKA 公司；N-1200BV-WD 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，購自東京理化器械株式會(huì)社；PHS-3C PH 計(jì)，購自上海雷磁儀器廠；3k-15 離心機(jī)，購自美國Sigma 公司。

石榴采自山東棗莊冠世榴園，經(jīng)棗莊學(xué)院張立華教授鑒定為崗榴石榴Punica granatum L.，剝?nèi)」?，陰干備用。沒食子酸（B20851-20 mg，純度≥98%）、鞣花酸（B21073-20 mg，純度≥98%）對(duì)照品，均購自上海源葉生物科技有限公司。乙腈、甲醇為色譜純，均購自德國Merck 公司；磷酸為色譜純，購自美國阿拉丁工業(yè)公司；其余試劑均為分析純；水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取液制備 將石榴皮粉碎后取10～20 目之間的粉末15 g，調(diào)節(jié)溶劑pH 值，常壓回流提取3次（用水量比例10∶8∶8，提取時(shí)間2∶1∶1），濾過，4 000 r/min 離心15 min，合并，定容至500 mL量瓶中，即得（編號(hào)SBE1～SBE9，質(zhì)量濃度為30 mg/mL）。

2.2 沒食子酸、鞣花酸含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 Hypersil ODS C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相水（含0.4% 磷酸）（A）-（甲醇-乙腈）（1∶1）（B），梯度洗脫（0～11 min，3%B，檢測(cè)波長270 nm，體積流量0.8 mL/min；12～25 min，30%B，檢測(cè)波 長254 nm，體積流量1 mL/min）；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取沒食子酸對(duì)照品2.00 mg，置于10 mL 量瓶中，超純水溶解定容至刻度；精密稱取鞣花酸對(duì)照品2.62 mg，置于10 mL棕色量瓶中，DMSO 溶解，超純水定容至刻度。精密吸取上述2 種溶液各5 mL，渦旋振蕩混合均勻，即得（沒食子酸、鞣花酸質(zhì)量濃度分別為0.10、0.13 mg/mL）。

2.2.3 供試品溶液制備 精密量取“2.1”項(xiàng)下提取液各5 mL，置于25 mL 量瓶中，加水定容，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得（編號(hào)A1～A9，質(zhì)量濃度為6.0 mg/mL），-4 ℃下保存。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶 液 2.0、5.0、10、15、20 μL，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，得沒食子酸、鞣花酸方程分別為Y=3 635.6X-3.214 6（R2=0.999 6）、Y=10 380X+750.5（R2=0.999 7），分別在0.2～2.0、0.26～2.620 μg 范圍呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 日內(nèi)精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，同一天內(nèi)在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，每次20 μL，測(cè)得沒食子酸、鞣花酸峰面積RSD 分別為1.48%、0.67%，表明該方法日內(nèi)精密度良好。

2.2.6 日間精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，每天在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定3 次，每次20 μL，連續(xù)3 d，測(cè)得沒食子酸、鞣花酸峰面積RSD 分別為1.86%、2.35%，表明該方法日間精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.2.3 項(xiàng)下供試品溶液（A1），于0、2、6、12、24 h 在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得沒食子酸、鞣花酸峰面積RSD 分別為1.27%、1.96%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取“2.1”項(xiàng)下提取液，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液（A1）6 份，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得沒食子酸、鞣花酸峰面積RSD 分別為2.31%、2.49%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取“2.1”項(xiàng)下提取液（SBE1）5.0 mL，共6 份，精密加入沒食子酸對(duì)照品0.15 mg 左右，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得沒食子酸平均加樣回收率為99.05%，RSD 為2.32%。精密吸取“2.1”項(xiàng)下提取液（SBE1）5.0 mL，共6 份，精密加入鞣花酸對(duì)照品1.5 mg 左右，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得鞣花酸平均加樣回收率為98.12%，RSD 為2.15%。

2.3 總酚含量測(cè)定

2.3.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取沒食子酸對(duì)照品10.0 mg，置于10 mL 量瓶中，超純水溶解，定容，即得（質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL）。

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.3.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，置于25 mL 量瓶中，加入酒石酸亞鐵溶液6 mL，搖勻后靜置10 min，pH7.5 磷酸鹽緩沖液定容至刻度，搖勻，靜置30 min 顯色，以0 管為空白，在540 nm 波長處用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度［16]。以吸光度為縱坐標(biāo)（A），對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，得到方程為A=14.336X+0.000 9（R2=0.999 4），在0.008～0.048 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 日內(nèi)精密度試驗(yàn) 取“2.3.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.4 mL，按“2.3.2”項(xiàng)下方法測(cè)定6 次吸光度，測(cè)得其RSD 為1.52%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 日間精密度試驗(yàn) 取“2.3.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，每天按“2.3.2”項(xiàng)下方法測(cè)定3 次吸光度，連續(xù)3 d，測(cè)得其RSD 為2.54%，表明儀器精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液（A1）1.0 mL，于0、2、6、12、24 h 按“2.3.2”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，測(cè)得其RSD 為2.50%，表明溶液24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取“2.1”項(xiàng)下提取液，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液（A1）6 份，各取1.0 mL，按“2.3.2”項(xiàng)下測(cè)定吸光度，測(cè)得其RSD 為2.45%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取“2.1”項(xiàng)下供試品溶液（A1）1.0 mL，共6 份，精密加入沒食子酸對(duì)照品0.37 mg 左右，渦旋混合，按“2.3.2”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，測(cè)得總酚平均加樣回收率為96.05%，RSD 為2.20%。

2.4 干浸膏得率測(cè)定 精密量取“2.1”項(xiàng)下提取液SBE1～SBE9各20.0 mL，置于已烘干至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，置于減壓干燥箱中，80 ℃下反復(fù)干燥至恒重，測(cè)定干浸膏得率。

2.5 均勻設(shè)計(jì) 本實(shí)驗(yàn)對(duì)一煎pH（A）、二煎pH（B）、三煎pH（C）、提取總時(shí)間（D）采用U9（91×33）均勻設(shè)計(jì)表進(jìn)行設(shè)計(jì)，結(jié)果見表1。

表1 均勻設(shè)計(jì)結(jié)果Tab.1 Results of uniform design

2.6 指標(biāo)權(quán)重確定

2.6.1 AHP 法 結(jié)合石榴皮藥效物質(zhì)含量、藥理作用強(qiáng)弱等方面，將各成分含量、干浸膏得率的權(quán)重分為4 個(gè)層次進(jìn)行量化。由于石榴皮主要藥效物質(zhì)為鞣質(zhì)等多元酚，其中鞣花酸、沒食子酸活性較突出，故設(shè)定各指標(biāo)主次順序?yàn)榭偡雍浚诀坊ㄋ岷浚緵]食子酸含量＞干浸膏得率，構(gòu)建成對(duì)比較優(yōu)先判斷矩陣，見表2。經(jīng)層次分析后，權(quán)重系數(shù)分別為總酚含量49.180%，鞣花酸含量24.590%，沒食子酸含量16.393%，干浸膏得率9.836%，隨機(jī)一致性RI 值0.89，一致性比列因子CR=0.000＜0.10，表明指標(biāo)優(yōu)先比較判斷矩陣滿足一致性檢驗(yàn)。

表2 各指標(biāo)成對(duì)比較的優(yōu)先判斷矩陣Tab.2 Priority judgment matrices for paired comparison of various indices

2.6.2 CRITIC 法 CRITIC 法是客觀反映指標(biāo)權(quán)重的計(jì)算方法［15，17]，它通過線性插值處理將考察指標(biāo)間的對(duì)比強(qiáng)度和沖突性體現(xiàn)出來，較主觀賦分法更客觀科學(xué)。將表1 數(shù)據(jù)進(jìn)行線性插值處理，通過SPSS 17.0 軟件計(jì)算指標(biāo)之間的變異性（Si）、沖突性（δi）、綜合權(quán)重（ci）、權(quán)重（ω），結(jié)果見表3。

表3 CRITIC 法所得各指標(biāo)的參數(shù)Tab.3 Parameters for various indices obtained by CRITIC method

2.6.3 AHP-CRITIC 法 計(jì)算公式為綜合權(quán)重其中ωAHP-ij表示AHP 法處理的權(quán)重值，ωCRITIC-ij表示CIRTIC 法處理的權(quán)重值，i 表示第i 個(gè)因素，j 表示第j 個(gè)樣本。結(jié)果，總酚含量、鞣花酸含量、沒食子酸含量、干浸膏得率的權(quán)重系數(shù)分別為46.68%、28.51%、14.44%、10.37%。

2.6.4 權(quán)重方法比較 將表1 數(shù)據(jù)分別用3 種權(quán)重系數(shù)進(jìn)行計(jì)算，再通過SPSS17.0 軟件進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果，AHP 法與AHP-CRITIC 法的相關(guān)系數(shù)為0.997，CRITIC 法與AHP-CRITIC 法的相關(guān)系數(shù)為0.889，AHP 法與CRITIC 法的相關(guān)系數(shù)為0.908，均有顯著相關(guān)性（P＜0.05）；但比較AHP法、CRITIC 法的權(quán)重系數(shù)時(shí)發(fā)現(xiàn)，兩者相關(guān)系數(shù)為-0.174，相關(guān)性不顯著（P=0.826＞0.05），表明2 種方法賦值反應(yīng)的信息無疊加性。

2.7 提取工藝確定 將“2.2”至“2.4”項(xiàng)下各指標(biāo)按公式進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，其中x′i.j表示標(biāo)準(zhǔn)化后數(shù)值，xi.j表示樣品液i 中成分j的含量，表示樣品液i 中成分j 的平均值，sj表示成分j 的標(biāo)準(zhǔn)偏差，按“2.6”項(xiàng)下公式計(jì)算綜合權(quán)重，再計(jì)算綜合評(píng)分Y，公式為Y=總酚含量×46.68%+鞣花酸含量×28.51% +沒食子酸含量×14.44%+干浸膏得率×10.37%。

通過SPSS17.0 軟件，對(duì)表1 各指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)值和綜合評(píng)分Y 進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸，得方程為Y=-3.428+0.079AD+0.034C2，P=0.006 ＜0.01，可知模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且一煎pH 值（A）、三煎pH 值（C）、提取時(shí)間（D）對(duì)提取效果有顯著影響（P＜0.05）。將回歸方程規(guī)劃求解預(yù)測(cè)，得到最優(yōu)工藝為A=6.0，B=7.36，C=9.0，D=4.0 h，預(yù)測(cè)值為Y=1.222 0。結(jié)合實(shí)際操作，確定一煎pH、二煎pH、三煎pH 分別為6.0、7.4、9.0，提取時(shí)間分別為2.0、1.0、1.0 h。

2.8 驗(yàn)證試驗(yàn) 將石榴皮粉碎（10～20 目）后稱取15 g，根據(jù)優(yōu)化工藝制備提取液，按“2.2”至“2.5”項(xiàng)下方法測(cè)定鞣花酸、沒食子酸、總酚含量及干浸膏提取率，各指標(biāo)按“2.7”項(xiàng)下方法處理，得到綜合評(píng)分Y′，結(jié)果見表4。由此可知，Y′為1.251 8，與預(yù)測(cè)值1.222 0 接近，表明該工藝合理可行。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Tab.4 Results of verification tests（n=3）

3 討論

石榴皮屬于收斂固澀藥，活性成分主要為鞣質(zhì)類，以鞣花酸單寧、沒食子單寧為主，但大量研究表明［12-13]，鞣質(zhì)類大分子物質(zhì)很難以原型吸收入血，在腸道酸堿條件下分解，入血成分大多為鞣花酸、沒食子酸、尿石素類代謝產(chǎn)物［18]等小分子酚類物質(zhì)。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇總多酚及其分解產(chǎn)物鞣花酸、沒食子酸作為主要考察指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)在最優(yōu)半仿生提取工藝下兩者提取率分別達(dá)到相同條件下水提液的5、4 倍左右，表明該工藝提取后石榴皮中部分鞣質(zhì)類成分轉(zhuǎn)化成小分子酚類化合物，更有利于胃腸道快速吸收。

在HPLC 法測(cè)定鞣花酸、沒食子酸含量時(shí)，采用可變波長梯度洗脫法，發(fā)現(xiàn)兩者最大吸收波長分別為254、270 nm，由于后者含量較低，故前11 min選擇270 nm，后13 min 選擇254 nm，此時(shí)2 種成分峰形、分離度均較好。

中藥提取工藝的優(yōu)化要體現(xiàn)中醫(yī)藥整體觀念，故必須選取多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)判。本實(shí)驗(yàn)將層次分析法（AHP）和客觀賦值法（CRITIC）作混合加權(quán)處理，既能體現(xiàn)各指標(biāo)對(duì)中藥貢獻(xiàn)度的差異，又可充分平衡各數(shù)據(jù)沖突性、變異性所帶來的影響，較單一賦權(quán)法更具科學(xué)性。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，所得最優(yōu)工藝參數(shù)合理可行，可為石榴皮的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。