復(fù)方臭靈丹合劑提取工藝的優(yōu)化及質(zhì)量評(píng)價(jià)

付 鵬余曉玲袁小淋*陳凌云

（1.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500；2.云南省高校外用給藥系統(tǒng)與制劑技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650500；3.昆明市中醫(yī)醫(yī)院，云南 昆明 650500）

上呼吸道感染是以咳嗽、咽痛、發(fā)熱等為主要癥狀，與細(xì)菌或病毒感染有關(guān)的疾病［1]，目前臨床大上多采用廣譜抗病毒藥物進(jìn)行治療，但效果一般，并存在一定的不良反應(yīng)［2]。復(fù)方臭靈丹合劑由臭靈丹、魚(yú)腥草、西青果、滇柴胡、桔梗5 味中藥組成，具有清熱解毒、祛痰止咳等功效，方中臭靈丹主要含洋艾素等黃酮類(lèi)成分［3]，魚(yú)腥草中金絲桃苷具有抑菌等作用［4]，西青果主要含有的多酚具有抗炎、抗菌作用［5]，滇柴胡、桔梗有效成分也對(duì)細(xì)菌、病毒有抑制作用［6-7]。

控制復(fù)方臭靈丹合劑中主要活性成分的提取率是中藥制劑質(zhì)量的關(guān)鍵步驟［8-11]，其變化與臨床療效密不可分［12]，同時(shí)多指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià)對(duì)最優(yōu)工藝參數(shù)有直接影響［13]。因此，本實(shí)驗(yàn)將通過(guò)Box-Benhnken 響應(yīng)面法結(jié)合信息熵對(duì)復(fù)方臭靈丹合劑中沒(méi)食子酸、金絲桃苷、槲皮素、異鼠李素、洋艾素、綠原酸提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并以沒(méi)食子酸為內(nèi)標(biāo)，建立一種快速簡(jiǎn)便的一測(cè)多評(píng)法來(lái)測(cè)定各成分含量［14-15]，以期為該方質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)化和現(xiàn)代研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

Agilent 1100 高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；15-LC 高效液相色譜儀（日本島津公司）；AB265-S 電子分析天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；SK2200HP 超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（北京永光明醫(yī)療儀器廠）。

沒(méi)食子酸（批號(hào)110756-201512，純度≥98%）、綠原酸（批號(hào)110809-201205，純度≥98%）、金絲桃苷（批號(hào)111521-201204，純度≥93.9%）、槲皮素（批號(hào)112345-20190930，純度≥98%）、異鼠李素（批號(hào)110860-201611，純度≥99.8%）、洋艾素（批號(hào)111879-201102，純度≥97.2%）對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院）。復(fù)方臭靈丹合劑（昆明市中醫(yī)醫(yī)院）。乙腈、甲醇為色譜純；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC 測(cè)定6 種成分含量

2.1.1 對(duì)照品溶液制備 取沒(méi)食子酸、金絲桃苷、槲皮素、異鼠李素、洋艾素、綠原酸對(duì)照品適量，甲醇溶解定容至刻度，即得（各成分質(zhì)量濃度分別為408.5、300.7、152.0、20.1、70.5、604.0 μg/mL）。

2.1.2 供試品溶液制備 精密吸取復(fù)方臭靈丹合劑25 mL，在固定料液比下用固定體積分?jǐn)?shù)甲醇超聲提取固定時(shí)間，水浴蒸干，甲醇定容至5 mL，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 色譜條件 DIKMA Diamonsil-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0～8 min，2%～3%A；8～10 min，3%～10%A；10～20 min，10%～16%A；20～25 min，16%～18%A；25～30 min，18%～20%A；30～40 min，20%～39%A；40～60 min，39%～60%A；60～65 min，60%～65% A；65～72 min，65%～73%A）；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm（金絲桃苷、槲皮素、異鼠李素、洋艾素）、325 nm（綠原酸）、270 nm（沒(méi)食子酸）；進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.4 線性關(guān)系考察 吸取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，逐步稀釋?zhuān)凇?.1.3”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.1.1”對(duì)照品溶液，在“2.1.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得沒(méi)食子酸、金絲桃苷、槲皮素、異鼠李素、洋艾素、綠原酸峰面積RSD 分別為0.33%、0.41%、0.37%、0.66%、0.14%、0.54%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得沒(méi)食子酸、金絲桃苷、槲皮素、異鼠李素、洋艾素、綠原酸峰面積RSD 分別為1.19%、1.45%、1.77%、1.41%、0.79%、1.02%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批合劑，按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得沒(méi)食子酸、金絲桃苷、槲皮素、異鼠李素、洋艾素、綠原酸峰面積RSD 分 別 為 0.52%、0.47%、1.26%、1.25%、1.06%、1.26%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含量已知的同一批合劑，精密加入等量對(duì)照品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，沒(méi)食子酸、金絲桃苷、槲皮素、異鼠李素、洋艾素、綠原酸平均加樣回收率分別為101.42%、10.2.23%、101.12%、99.58%、101.21%、102.33%，RSD 分別為0.23%、1.77%、1.68%、1.51%、1.27%、1.51%。

2.2 單因素試驗(yàn) 參考文獻(xiàn)［16-17] 報(bào)道，固定提取時(shí)間10 min、甲醇體積分?jǐn)?shù)50%，考察料液比（1∶4、1∶6、1∶8、1∶10）對(duì)提取工藝的影響，再依次考察不同提取時(shí)間（10、15、30、45 min）、甲醇體積分?jǐn)?shù)（50%、60%、80%、100%）。結(jié)果，最優(yōu)提取工藝為料液比1∶8，提取時(shí)間30 min，甲醇體積分?jǐn)?shù)80%。

2.3 Box-Behnken 響應(yīng)面法 以料液比（A）、提取時(shí)間（B）、甲醇體積分?jǐn)?shù)（C）為影響因素，沒(méi)食子酸、金絲桃苷、槲皮素、異鼠李素、洋艾素、綠原酸含量的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，因素水平見(jiàn)表2，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 因素水平Tab.2 Factors and levels

表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.3 Design and results of tests

以沒(méi)食子酸、金絲桃苷、槲皮素、異鼠李素、洋艾素、綠原酸含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，用公式Pij=對(duì)表3 數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，建立概率矩陣（Pij）mn，再分別用公式計(jì)算各指標(biāo)信息熵Hij=［0.999 1，0.987 5，0.995 9，0.992 6，0.993 1，0.997 5]、權(quán)重系數(shù)Wi=［2.52%，36.68%，11.84%，21.54%，20.20%，7.22%]，最后計(jì)算綜合評(píng)分M，公式為M=（沒(méi)食子酸含量/最大值）×W1+（金絲桃苷含量/最大值）×W2+（槲皮素含量/最大值）×W3+（異鼠李素含量/最大值）×W4+（洋艾素含量/最大值）×W5+（綠原酸含量/最大值）×W6。

通過(guò)Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)表3 數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合分析，得方程為M=92.19+4.56A+3.74B+4.90C+3.96AB+6.87AC+5.79BC-8.50A2-17.80B2-8.42C2（R2=0.954 0），方差分析見(jiàn)表4，可知模型P＜0.05，失擬項(xiàng)P=0.709 8＞0.05，表明模型有效；因素A、C、AC、BC、A2、B2、C2對(duì)綜合評(píng)分有明顯影響（P＜0.05），響應(yīng)面分析見(jiàn)圖2。最終確定，最優(yōu)提取工藝為料液比1∶9，提取時(shí)間34 min，甲醇體積分?jǐn)?shù)92%，綜合評(píng)分為95.54 分。

表4 方差分析Tab.4 Analysis of variance

圖2 各因素響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plots for various factors

按優(yōu)化工藝進(jìn)行3 批驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5，可知該工藝穩(wěn)定可行。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Tab.5 Results of verification tests（n=3）

2.4 一測(cè)多評(píng)法測(cè)定6 種成分含量

2.4.1 相對(duì)校正因子計(jì)算 由于沒(méi)食子酸含量較高、色譜峰穩(wěn)定，故選擇其作為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算其他5種成分的相對(duì)校正因子f，計(jì)算公式為f=fk/fs=（CkAs）/（CsAk），其中Ck為其他成分含量，Ak為其他成分峰面積，Cs為內(nèi)標(biāo)含量，As為內(nèi)標(biāo)峰面積，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 各成分相對(duì)校正因子Tab.6 Relative correction factors of various constituents

2.4.2 耐用性考察

2.4.2.1 儀器、色譜柱 本實(shí)驗(yàn)考察了Agilent 1100、島津15LC 色譜儀，以及Agilent XDB-C18、DIKMA Diamonsil-C18、OMNI Zinger-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見(jiàn)表7，可知均無(wú)明顯影響（RSD＜5%）。

表7 不同儀器、色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.7 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.4.2.2 柱溫 固定其他色譜條件不變，本實(shí)驗(yàn)考察了柱溫20、25、30、35、40、45 ℃對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見(jiàn)表8，可知均無(wú)明顯影響（RSD＜5%）。

表8 不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.8 Effects of different column temperatures on relative correction factors

2.4.2.3 體積流量 固定其他色譜條件不變，本實(shí)驗(yàn)考察了體積流量0.5、0.7、0.8、1.0、1.1、1.2 mL/min 對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見(jiàn)表9，可知均無(wú)明顯影響（RSD＜5%）。

表9 不同體積流量對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.9 Effects of different volumetric flow rates on relative correction factors

2.4.3 色譜峰定位 采用相對(duì)保留時(shí)間法，分別考察內(nèi)標(biāo)、其他成分在不同儀器、色譜柱、柱溫、體積流量下的相對(duì)保留時(shí)間，發(fā)現(xiàn)均無(wú)明顯差異（RSD＜5.0%）。

2.4.4 樣品含量測(cè)定 取10 批合劑，分別采用一測(cè)多評(píng)法、外標(biāo)法計(jì)算各成分含量，結(jié)果見(jiàn)表10，可知2 種方法無(wú)明顯差異（RSD＜5.0%）。

表10 各成分含量測(cè)定結(jié)果（%，n=3）Tab.10 Results of content determination of various constituents（%，n=3）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)首次采用Box-Benhnken 響應(yīng)面法結(jié)合信息熵對(duì)復(fù)方臭靈丹合劑中6 種成分提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，有利于兼顧各指標(biāo)之間的協(xié)同效應(yīng)，符合中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)及中醫(yī)用藥的整體觀。然后通過(guò)信息熵來(lái)評(píng)價(jià)各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)，在保持其穩(wěn)定性的同時(shí)可更好地區(qū)分?jǐn)?shù)據(jù)信息，進(jìn)而篩選出最佳工藝，提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的嚴(yán)謹(jǐn)性和科學(xué)性。

沒(méi)食子酸、綠原酸分別在270、325 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，而金絲桃苷、槲皮素、異鼠李素、洋艾素在360 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收。本實(shí)驗(yàn)比較了上述3 個(gè)波長(zhǎng)處的色譜圖，發(fā)現(xiàn)270 nm 下只能檢測(cè)到?jīng)]食子酸，325 nm 下只能檢測(cè)到綠原酸，360 nm下只能檢測(cè)到金絲桃苷、槲皮素、異鼠李素、洋艾素，故最終采用多波長(zhǎng)同時(shí)掃描。

一測(cè)多評(píng)法依據(jù)中藥有效成分之間存在某些內(nèi)在關(guān)系的特性，只需測(cè)定某一內(nèi)標(biāo)即可計(jì)算其他成分含量［18]。由于沒(méi)食子酸化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，含量高，價(jià)格低廉，相對(duì)校正因子穩(wěn)定，故本實(shí)驗(yàn)選擇其作為內(nèi)標(biāo)來(lái)準(zhǔn)確測(cè)定其他成分含量，體現(xiàn)了一測(cè)多評(píng)法的特點(diǎn)。