γ射線輻射對(duì)大鼠肝藥物代謝酶CYP1A2，CYP2C9和CYP2D6蛋白表達(dá)及藥物代謝活性的影響

董 航，張海暉，竇桂芳，孟志云，葉 彤，朱曉霞，顧若蘭，吳卓娜，甘 慧

（軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850）

γ射線是一類穿透性極強(qiáng)的射線，機(jī)體在短時(shí)間內(nèi)吸收1 Gy以上劑量的γ輻射會(huì)引發(fā)急性放射?。╝cute radiation disease，ARD），肝受損后會(huì)發(fā)生肝功能異常、纖維化等病變，進(jìn)而嚴(yán)重?fù)p害碳水化合物和脂質(zhì)的代謝，影響機(jī)體健康［1-4］。細(xì)胞色素P450酶（cytochrome P450，CYP450）主要存在于肝中，參與70%～80%藥物代謝，其中CYP1A2主要參與芳香族化合物、雜環(huán)胺、硝基芳香化合物和霉菌毒素等致癌物質(zhì)的代謝，CYP2C9參與13%～17%臨床藥物代謝，CYP2D6介導(dǎo)20%～30%處方藥物的生物轉(zhuǎn)化［5-8］。有研究發(fā)現(xiàn)，輻射可在一定程度上誘導(dǎo)或抑制肝藥物代謝酶表達(dá)和活性，如雙氧鈾硝酸鹽可顯著降低大鼠CYP2C11蛋白表達(dá)水平，對(duì)CYP1A2和CYP2B1/2表達(dá)無(wú)顯著影響；大鼠全身照射X射線，CYP活性顯著降低；UV-B輻射可導(dǎo)致人皮膚組織CYP1A1活性和蛋白表達(dá)水平的升高［9-11］。本研究通過觀察6 Gy γ射線輻射對(duì)大鼠肝代謝酶CYP1A2，CYP2C9和CYP2D6在蛋白表達(dá)和微粒體活性水平的變化，為輻射后機(jī)體藥物代謝研究及相應(yīng)臨床用藥研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

色譜級(jí)乙腈、甲酸和甲醇（Fisher Scientific公司，美國(guó)）；蔗糖、甘油、磷酸氫二鉀、濃鹽酸、氯化鎂和乙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；NADPH再生循環(huán)系統(tǒng)和96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Corning公司，美國(guó)）；普萘洛爾、非那西丁、雙氯芬酸、右美沙芬、對(duì)乙酰氨基酚、4′-羥基雙氯芬酸和右啡烷（Sigma公司，美國(guó)）；兔抗大鼠CYP1A2多克隆抗體、兔抗大鼠CYP2C9多克隆抗體和兔抗大鼠CYP2D6多克隆抗體（Biorbyt公司，英國(guó)）；小鼠抗大鼠GAPDH單克隆抗體、山羊抗小鼠IgG抗體、山羊抗兔IgG抗體和Western印跡相關(guān)試劑（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；BCA蛋白檢測(cè)試劑盒（Thermo公司，美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

EIX800酶標(biāo)儀（Bio-Tek公司，美國(guó)）；Advan?tage A10超純水儀（Mili-Q公司，美國(guó)）；3-18k型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Sigma公司，德國(guó)）；GHP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；5200顯影儀（Tanon）；KQ-300 DE型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ME235S電子天平（長(zhǎng)沙湘平科技發(fā)展有限公司）；ES-2001P電子pH計(jì)（Sartorious，美國(guó)）；HZS-H-S水浴振蕩器（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；MS-H-S磁力攪拌器（SCILOGEX，美國(guó)）；XHF-D高速分散器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；CP-NX超速離心機(jī)（Himac公司，日本）；液相色譜（資生堂公司，日本）；API 4000-質(zhì)譜（AB Sciex公司，美國(guó)）。

1.3 輻照和分組

28只SPF級(jí)雄性Wistar大鼠，體重180～220 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006。飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)研究院，溫度21～25℃，12 h晝夜交替照明，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，自由飲食飲水。大鼠隨機(jī)平均分為正常對(duì)照組和輻射組，每組14只，其中6只用于肝總蛋白提取和組織病理觀察，8只用于肝微粒體藥物代謝分析。輻射組大鼠于飼養(yǎng)第4天給予總劑量6 Gy的單次全身照射，劑量率為68.34 cGy·min-1，輻射距離為4 m。輻射源為軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院鈷源照射中心60Co。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所倫理委員會(huì)批準(zhǔn)且實(shí)驗(yàn)均按照相關(guān)指導(dǎo)原則和規(guī)定進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，頸椎脫臼法處死大鼠，取肝組織分別制備用于病理觀察、蛋白表達(dá)和活性觀察的切片、肝總蛋白和肝微粒體。

1.4 HE染色觀察肝組織病理變化

輻射后24 h，取1.3分組大鼠（每組6只）切取肝組織，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片制成組織薄片，蘇木素染液、伊紅染液染色后顯微鏡下200倍視野進(jìn)行圖像采集，并進(jìn)行病理學(xué)分析。

1.5 Western印跡法檢測(cè)肝組織CYP1A2，CYP2C9和CYP2D6蛋白表達(dá)水平

輻射后24 h，取1.3分組大鼠（每組6只），處死后取肝組織約0.1 g，RIPA法提取肝總蛋白，肝總蛋白按4∶1比例加入5×蛋白上樣緩沖液，100℃變性15 min。配制10%的SDS-PAGE分離膠，每孔上樣量為20 μg，電泳濃縮膠階段為恒壓80 V，分離膠階段為恒壓120 V。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，電轉(zhuǎn)條件為電流200 mA，2 h。PVDF膜首先于5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h后；4℃過夜孵育一抗，抗體稀釋比例分別為CYP1A2抗體（1∶800）、CYP2C9抗體（1∶2000）、CYP2D6抗體（1∶1000）、GAPDH抗體（1∶5000）；室溫孵育二抗1 h，二抗稀釋比例均為（1∶5000）。用軟件Image J對(duì)蛋白條帶積分吸光度值進(jìn)行半定量分析，以目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白條帶積分吸光度比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 液質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)體外孵育藥物濃度

1.6.1 肝微粒體的提取

輻射后24 h，取1.3分組大鼠（每組8只），頸椎脫臼法處死，迅速打開腹腔和胸腔，暴露肝門靜脈、下腔靜脈，通過肝門靜脈迅速推注預(yù)冷的生理鹽水，并剪開下腔靜脈使液體順暢流出，每只大鼠灌流量約為200 mL，灌流程度以血液被沖洗干凈，肝完全變?yōu)橥咙S色為準(zhǔn)。梯度離心法分離微粒體，取適量肝組織按重量體積比1∶3（W/V）加入0.25 mol·L-1冷蔗糖溶液，充分勻漿，勻漿液于12000×g轉(zhuǎn)速4℃離心20 min，將上清液轉(zhuǎn)移至超速離心機(jī)，4℃溫度下100 000×g離心60 min，棄去上清，粉紅色沉淀即為肝微粒體。按照1∶1（W/V）比例加入冰TMS緩沖液重懸微粒體，用預(yù)冷的玻璃勻漿器研磨均勻后，向肝微粒體溶液中加入甘油至甘油終濃度為20%，充分混勻后分裝，于-80℃凍存待用。提取過程中盡量保持低溫并通氮?dú)庖跃S持低氧環(huán)境，防止微粒體氧化失活。

1.6.2 體外藥物代謝孵育

將CYP1A2，CYP2C9和CYP2D6代謝酶的特異性底物混合后，與每只大鼠肝臟微粒體分別進(jìn)行體外孵育，液質(zhì)聯(lián)用儀檢測(cè)相應(yīng)標(biāo)志性代謝產(chǎn)物的生成量以反映各亞型酶在微粒體水平酶的活性高低。每只大鼠肝微粒體孵育體系為1 mL，含微粒體樣本（終濃度為0.6 g·L-1）、非那西?。ńK濃度為10 μmol·L-1）、雙氯芬酸（終濃度為10 μmol·L-1）、右美沙芬（終濃度為 5 μmol·L-1），NADPH再生系統(tǒng)150 μL，以及K2HPO4緩沖液。終止液為含內(nèi)標(biāo)0.02 μmol·L-1普萘洛爾的乙腈。在反應(yīng)進(jìn)行至第5，10，20和40 min時(shí)，從孵育體系中取出80 μL混合反應(yīng)物，等體積加入終止液，充分震蕩以終止反應(yīng)。HPLC-MS/MS定量分析，以標(biāo)志性代謝產(chǎn)物的生成來(lái)反映酶代謝活性水平。

1.6.3 液質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)

API 4000液質(zhì)聯(lián)用儀在ESI正離子模式下，檢測(cè)CYP1A2，CYP2C9和CYP2D6酶標(biāo)志性代謝反應(yīng)物（對(duì)乙酰氨基酚、4′-羥基雙氯芬酸和右啡烷）的生成量，以下液相條件優(yōu)化自Wang等［12］的方法，并經(jīng)過實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)，此法穩(wěn)定、可靠。采用CAPCELL PAK C18色譜柱（2.0 mm×50 mm，5 μm）進(jìn)行液相分離，液相條件為：流動(dòng)相A：乙腈（0.1%甲酸），流動(dòng)相B：水（0.1%甲酸）；洗脫梯度依次為0～0.5 min（2%A），0.5～2 min（2%A～40%A），2～3.5 min（40%A～90%A），3.5～4.3 min（90%A），4.3～6.0 min（2%A）；流速為300 μL·min-1；洗脫時(shí)間為6 min；進(jìn)樣量5 μL。質(zhì)譜條件如下：離子噴霧電壓5500 kV、碰撞氣壓12 psi、氣簾氣壓20 psi、離子源氣體一60 psi、離子源氣體二20 psi、溫度 500℃。質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)見表1。

Tab.1 Mass spectrometry parameters for compound analysis

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 γ射線輻射對(duì)大鼠肝組織的損傷

6 Gy γ射線全身照射大鼠，正常對(duì)照組肝組織切片顯示（圖1），肝小葉中央為中央靜脈，周圍是大致呈放射狀排列的肝細(xì)胞和肝血竇，肝細(xì)胞圓潤(rùn)、飽滿；肝板排列規(guī)則、整齊，肝竇無(wú)明顯擴(kuò)張或擠壓；相鄰肝小葉之間的門管區(qū)無(wú)明顯異常；未見明顯炎癥。輻射組大鼠病理切片顯示，肝實(shí)質(zhì)內(nèi)可見大量的肝細(xì)胞變性，胞質(zhì)疏松淡染（黑色箭頭），局部髓竇輕度擴(kuò)張（藍(lán)色箭頭），且有肝板增粗現(xiàn)象。組織染色結(jié)果提示6 Gy γ射線對(duì)大鼠肝臟造成了一定程度的病理生理?yè)p傷。

Fig.1 Pathologic changes in liver tissue of 6 Gy irra?diated irradiation rats(HE，×200).Livers in irradiation group were prepared at 24 h after irradiation.The blue arrow shows the area of hepatocyte degeneration,and the black arrows show the area of the dilation of medullary sinus.

2.2 γ射線輻射對(duì)大鼠肝組織CYP1A2，CYP2C9和CYP2D6蛋白表達(dá)的影響

Western印跡法結(jié)果（圖2）顯示，輻射后CYP1A2蛋白表達(dá)量平均值較正常對(duì)照組顯著升高82.8%（P＜0.05），輻射組大鼠肝CYP1A2蛋白的最高表達(dá)量為正常對(duì)照組最高表達(dá)量的1.48倍。6 Gy γ射線輻射使大鼠肝CYP2C9蛋白相對(duì)表達(dá)量平均值較正常對(duì)照組蛋白相對(duì)表達(dá)量平均值上升87.9%。而相對(duì)于正常對(duì)照組CYP2D6蛋白表達(dá)量，輻射組大鼠肝CYP2D6蛋白相對(duì)表達(dá)無(wú)明顯變化。

Fig.2 Effect of 6 Gy γ-ray on protein expressions of hepatic CYP1A2，CYP2C9 and CYP2D6 after irradiation.Protein samples of the two groups were prepared from livers of rats 24 h after irradiation.Western blotting analyses for CYP450 subtypes protein were carried out with total hepatic proteins per lane（20 μg of each）.The sample of each lane was prepared from an individual rat.B-D：relative level of CYP1A2，CYP2C9 and CYP2D6，the semi-quantitative results of A.±s，n=6，＊P＜0.05，compared with normal control group.

2.3 γ射線輻射對(duì)大鼠肝組織CYP1A2，CYP2C9和CYP2D6酶活性的影響

2.3.1 輻射對(duì)CYP1A2藥物代謝活性的影響

對(duì)乙酰氨基酚藥物濃度-時(shí)間曲線（圖3A）結(jié)果顯示，孵育體系中的代謝產(chǎn)物濃度在40 min內(nèi)隨時(shí)間的增加而增加。圖3B顯示，40 min時(shí)輻射組生成的CYP1A2特異性代謝產(chǎn)物較正常對(duì)照組升高33.9%（P=0.055）。

Fig.3 Effect of 6 Gy γ-ray on activity of rat hepatic CYP1A2 after irradiation.Rats in irradiation group were irra?diated by 6 Gy γ-ray.Microsomes were prepared from livers of rats 24 h after irradiation.The activity of CYP1A2 in hepatic mi?crosomes was indicated by the metabolism of substrate phenace?tin.The metabolite paracetamol was quantitated with HPLC-MS/MS method.A：concentration of metabolite paracetamol at dif?ferenttime points ofincubation;B：relative production of paracetamol after CYP1A2 metabolism in 40 min.±s，n=8.

2.3.2 輻射對(duì)CYP2C9藥物代謝活性的影響

CYP2C9特異性底物雙氯芬酸與2組大鼠肝微粒體代謝孵育，如圖4A顯示，CYP2C9代謝標(biāo)志性反應(yīng)物4′-羥基雙氯芬酸濃度在40 min內(nèi)隨時(shí)間的增加而增加。在40 min內(nèi)，與正常對(duì)照組相比，輻射組孵育體系中4′-羥基雙氯芬酸的生成量增加33.1%，顯著升高（P=0.022）（圖4B）。表明相對(duì)于正常對(duì)照組大鼠，6 Gy γ射線輻射對(duì)大鼠肝CYP2C9酶代謝活性有顯著性誘導(dǎo)作用。

Fig.4 Effect of 6 Gy γ-ray on activity of rat hepatic CYP2C9 at 24 h after irradiation.See Fig.3 for the rat treat?ment.The activity of CYP2C9 in hepatic microsomes was indi?cated by the metabolism of substrate diclofenac.The specific metabolite 4′-hydroxydiclofenac was quantitated by HPLC-MS/MS method.A：concentration of metabolite 4′-hydroxydiclofenac at different time points of incubation.B:relative production of 4′-hydroxydiclofenac CYP2C9 metabolism in 40 min.±s，n=8.＊P＜0.05,compared with normal control group.

2.3.3 輻射對(duì)CYP2D6藥物代謝活性的影響

6 Gy γ射線照射大鼠后，如圖5A所示，以右美沙芬為特異性底物，CYP2D6代謝后標(biāo)志性反應(yīng)物-右啡烷在孵育體系中的濃度在40 min內(nèi)隨時(shí)間的增加而增加，提示CYP2D6體外代謝孵育體系建立成功，但是輻射組大鼠微粒體代謝生成右啡烷的速度與正常對(duì)照組無(wú)明顯差異；且在40 min內(nèi)，體系中右啡烷的相對(duì)生成量與正常對(duì)照組相近（圖5B）。以上結(jié)果提示，6 Gy γ射線輻射對(duì)大鼠肝CYP2D6代謝酶活性無(wú)明顯影響。

Fig.5 Effect of 6 Gy γ-ray on activity of rat hepatic CYP2D6 at 24 h after irradiation.See Fig.3 for the was rat treatment.The activity of CYP2D6 in hepatic microsomes was indicated by the metabolism of substrate dextromethorphan.The metabolite dextrorphan was quantitated by HPLC-MS/MS method.A：concentration of metabolite dextrorphan at different time points of incubation;B：relative production of dextrorphan CYP2D6 metabolism in 40 min.±s，n=8.

3 討論

機(jī)體中CYP450酶主要存在于肝，部分肝外細(xì)胞也有分布。肝結(jié)構(gòu)和功能的完整程度一定程度上決定著機(jī)體對(duì)藥物的代謝能力，而肝也是對(duì)輻射敏感的器官之一。本研究采用HE染色進(jìn)行肝組織病理分析，Western印跡法研究輻射對(duì)大鼠CYP1A2，CYP2C9和CYP2D6在肝蛋白表達(dá)水平上的影響，并用HPLC-MS/MS檢測(cè)其在微粒體水平活性變化。研究結(jié)果表明，6 Gy γ射線輻射導(dǎo)致肝臟病變；CYP1A2和CYP2C9在輻射后蛋白表達(dá)顯著上升，而CYP2D6則無(wú)明顯變化；同時(shí)大鼠肝CYP1A2，CYP2C9和CYP2D6代謝活性出現(xiàn)不同程度變化，其中CYP1A2，CYP2C9經(jīng)輻射后活性水平均有上升趨勢(shì)，而CYP2D6活性在輻射前后無(wú)明顯變化。

本研究結(jié)果表明，6 Gy γ射線輻射對(duì)3種代謝酶亞型在蛋白水平和微粒體酶活性水平上的變化規(guī)律一致，輻射后CYP1A2和CYP2C9蛋白表達(dá)與藥物代謝活性均升高，而CYP2D6幾乎未受影響。由于酶的代謝能力的升高在一定水平上是由酶含量的增加引起的，輻射后CYP1A2和CYP2C9在微粒體活性水平的升高一定程度上反映蛋白表達(dá)的增加。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，輻射后二者的蛋白升高程度與微粒體活性水平升高程度并不完全相同。首先這可能是由于活性檢測(cè)和蛋白檢測(cè)方法的靈敏度不同導(dǎo)致的；其次，酶的活性發(fā)揮一定程度上取決于酶的反應(yīng)環(huán)境和條件，體外反應(yīng)與體內(nèi)反應(yīng)存在較大區(qū)別；最后酶的活性還取決于酶的三維結(jié)構(gòu)所構(gòu)建的活性中心，蛋白轉(zhuǎn)錄翻譯后修飾也是活性的重要因素，而輻射是否會(huì)對(duì)酶的蛋白結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，這有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。同時(shí)發(fā)現(xiàn)組內(nèi)動(dòng)物CYP450亞型蛋白表達(dá)量和酶活性個(gè)體差異較大。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析與比較，輻射后CYP450亞型蛋白水平變化更為顯著，CYP1A2和CYP2C9表達(dá)平均增加80%以上，二者體外代謝活性在輻射后上升約33%，這與不同實(shí)驗(yàn)方法的原理與靈敏度有關(guān)，也與體內(nèi)蛋白在基因、蛋白、活性遞進(jìn)層面上的時(shí)序性相關(guān)。此外，6Gy γ射線輻射后，大鼠肝CYP1A2在微粒體酶活性水平上較正常對(duì)照組有升高現(xiàn)象，但沒有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能源于肝微粒體提取、Western印跡雜交整個(gè)操作流程較復(fù)雜，耗時(shí)較長(zhǎng)，以及動(dòng)物個(gè)體差異的影響。

本研究前期開展了文獻(xiàn)調(diào)研［13-14］及對(duì)輻射劑量、檢測(cè)時(shí)間的實(shí)驗(yàn)摸索，提示1～2 Gy劑量對(duì)CYP450亞型影響較??；9 Gy高劑量快速影響大鼠血象和生存率，且細(xì)胞凋亡壞死導(dǎo)致酶蛋白表達(dá)系統(tǒng)受損；5～7 Gy γ射線輻射對(duì)于CYP450酶亞型影響是拐點(diǎn)。盡管肝組織病理結(jié)果提示輻射后的病理生理進(jìn)程及細(xì)胞凋亡等現(xiàn)象或許仍在繼續(xù)進(jìn)行，但輻射后24 h是代謝酶輻射應(yīng)激的一個(gè)較顯著的時(shí)間點(diǎn)，CYP450代謝酶可能成為輻射生物標(biāo)志物新的選擇。研究利用6 Gy γ射線全身輻射大鼠，在輻射后24 h發(fā)現(xiàn)肝組織產(chǎn)生細(xì)胞變性，CYP1A2和CYP2C9蛋白表達(dá)和藥物代謝活性不同程度的升高，提示針對(duì)由CYP1A2和CYP2C9代謝的藥物，受到γ射線輻射的人群可能更要監(jiān)測(cè)體內(nèi)代謝酶水平的改變。CYP1A2和CYP2C9升高時(shí)，對(duì)應(yīng)的藥物需要考慮增加劑量或服藥頻率以達(dá)到良好的藥效；針對(duì)由CYP2D6代謝的藥物，動(dòng)物水平結(jié)果顯示，γ射線對(duì)CYP2D6無(wú)顯著誘導(dǎo)或抑制作用，提示臨床上對(duì)放療患者CYP2D6代謝酶水平的關(guān)注度或許可以略低。由于CYP1A2能將環(huán)境中的多環(huán)芳香烴激活為有毒物質(zhì)，輻射對(duì)CYP1A2的誘導(dǎo)作用是否會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生除輻射損傷外的二次損傷，也值得在今后實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探討。