生防菌和免疫誘抗劑防治獼猴桃潰瘍病生測(cè)方法的構(gòu)建與應(yīng)用

姚 令 ，吳石平 ，黃 露 ，安星宇 ，蔣選利 *

（1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院植保系，貴陽 550025；2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，貴陽 550006）

農(nóng)藥生物測(cè)定是研究和評(píng)價(jià)農(nóng)藥的重要方法，其貫穿于新化合物結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、活性發(fā)現(xiàn)、前期研究、開發(fā)登記、生產(chǎn)應(yīng)用到產(chǎn)品生命周期管理等各個(gè)環(huán)節(jié)[1]，許多優(yōu)秀農(nóng)藥的發(fā)現(xiàn)都得益于新的測(cè)定方法[2]。按基本原理殺菌劑生物測(cè)定分為2類：第1類測(cè)定中包括病菌和藥劑；第2類測(cè)定中包括病菌、藥劑和寄主[3]。生防菌類殺菌劑和免疫誘抗劑是2類重要的農(nóng)藥，由于具有環(huán)境友好和持效期較強(qiáng)的特點(diǎn)，對(duì)非靶標(biāo)生物無毒副作用，病原菌不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，部分生防菌類殺菌劑和免疫誘抗劑還能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)，增強(qiáng)植物抗逆性，其對(duì)植物病害防控起著重要作用[4-5]。除部分生防菌類殺菌劑對(duì)病原菌有拮抗作用外，大多數(shù)生防菌沒有直接殺滅、拮抗作用，或拮抗作用不是主要控病途徑，免疫誘抗劑則對(duì)病原菌沒有直接作用。因此，生防菌類殺菌劑和免疫誘抗劑的室內(nèi)生測(cè)方法常采用第2類生物測(cè)定方法。目前，包含寄主的生物測(cè)定方法有稻瘟病、灰霉病等病害[6-7]，防治獼猴桃潰瘍病的生防菌類殺菌劑和免疫誘抗劑室內(nèi)生物測(cè)定的方法未見報(bào)道。為構(gòu)建一種用于大型寄主植物枝干病害生物測(cè)定方法，筆者以獼猴桃潰瘍病菌（Pseudomonas syringae pv. actinidiae，Psa）為對(duì)象，采用離體枝條接種的方法進(jìn)行了生防菌類藥劑及免疫誘抗劑的室內(nèi)生物測(cè)定方法研究，并對(duì)6種生防菌、7種免疫誘抗劑和4種免疫誘抗物進(jìn)行篩選，為大型寄主植物生防菌類藥劑及免疫誘抗劑的室內(nèi)生測(cè)方法及獼猴桃潰瘍病綠色防控選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

獼猴桃潰瘍病病原菌丁香假單胞菌獼猴桃致病變種于2019年6月采自息烽縣石硐鎮(zhèn)的獼猴桃病樣中分離得到，并保存于貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病理實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 枝條

采自貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獼猴桃試驗(yàn)園。該園從2019年8月—12月（采樣期間）均未施用任何農(nóng)藥；品種為“貴長(zhǎng)”；剪下的一年生枝條，截成約30 cm小段，噴施75%酒精表面消毒，立即用蒸餾水清洗，晾干后在兩端涂上凡士林，備用。

1.1.3 試驗(yàn)藥劑

6種生防菌劑、7種免疫誘抗劑和4種免疫誘抗物的來源見表1。

表1 試驗(yàn)藥劑及來源

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 接種

取保存于-80℃冰箱中的Psa菌株在NA（Nutrient Agar）培養(yǎng)基中劃線，于20℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；用無菌水將NA培養(yǎng)基上的菌落洗下，然后稀釋為濃度1×108cfu/mL的菌懸液。在枝條表面橫切一條寬度約為枝條直徑的三分之二、深度至木質(zhì)部的傷口，往傷口處滴加菌液。接種后枝條放置于保濕盒中，保濕。保濕盒放置于人工氣候室，溫度為白天16℃，夜晚13℃。

1.2.2 調(diào)查方法

調(diào)查時(shí)，采用小刀削開表皮，采用游標(biāo)卡尺測(cè)量病斑長(zhǎng)度。

1.2.3 調(diào)查時(shí)間試驗(yàn)

取70支兩端涂好凡士林的獼猴桃枝條，接種后分別于7、10、13、16、19、22和25 d后進(jìn)行發(fā)病程度調(diào)查。

1.2.4 接種量試驗(yàn)

取40支獼猴桃枝條分別接種5、10、15、20 μL已制備的菌液，20 d后調(diào)查發(fā)病情況。

1.2.5 重復(fù)數(shù)試驗(yàn)

取25支獼猴桃枝條，進(jìn)行病原菌接種。保濕放置20 d后調(diào)查發(fā)病情況，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤，以確定最小重復(fù)數(shù)。

1.2.6 藥劑室內(nèi)篩選

將不同生防、免疫誘抗藥劑配制成相應(yīng)的濃度，噴施于獼猴桃枝條表面，采用清水作為對(duì)照。分為2組，1組病原菌接種前2 d噴施藥劑，1組病原菌接種前7 d噴施藥劑，接種20 d后調(diào)查發(fā)病情況。藥劑抑制率按式（1）計(jì)算，比較2組間藥劑的抑制率。

1.2.7 田間試驗(yàn)

用0.2%補(bǔ)骨脂種子提取物微乳劑、0.1%S-誘抗素水劑、1.2%辛菌胺醋酸鹽水劑、80億芽孢/g甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌LW-6可濕性粉劑和10億芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑，按照NY/T 1464.72—2018《田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則第72部分殺菌劑防治獼猴桃潰瘍病》方法進(jìn)行，連續(xù)施3次，間隔7 d；末次藥后第10 d，調(diào)查5種藥劑對(duì)獼猴桃葉片潰瘍病的田間防效。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，利用DPS軟件采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行方差分析，采用Origin 2018軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 調(diào)查時(shí)間

調(diào)查時(shí)間試驗(yàn)結(jié)果表明，接種后病斑長(zhǎng)度隨時(shí)間增加而變長(zhǎng)。7～10 d病斑擴(kuò)展較慢；10 d時(shí)病斑長(zhǎng)度為0.54±0.23 cm；10～25 d病斑快速擴(kuò)展；25 d病斑長(zhǎng)度為3.87±1.34 cm。從數(shù)據(jù)的離散程度來看，剛發(fā)病時(shí)病斑長(zhǎng)度數(shù)據(jù)離散程度較大，10 d時(shí)為0.420 9。隨著病斑擴(kuò)展，離散系數(shù)逐漸變小，22 d時(shí)最小為0.222 6。25 d時(shí)枝條已經(jīng)開始出現(xiàn)干枯或表面生長(zhǎng)雜菌，調(diào)查較為困難，數(shù)據(jù)誤差和變異系數(shù)變大（圖1）。

2.2 接種量

接種5～20 μL菌液，枝條均有較好發(fā)病，病斑長(zhǎng)度在1.94～2.07 cm，病斑長(zhǎng)度無顯著差異（表2）。

圖1 病斑長(zhǎng)度及變異系數(shù)

表2 不同接種量發(fā)病程度

2.3 最小重復(fù)數(shù)

通過清水對(duì)照枝條病斑長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)誤分析，調(diào)查3個(gè)病斑時(shí)標(biāo)準(zhǔn)誤較大，隨著重復(fù)數(shù)的增加標(biāo)準(zhǔn)誤急劇降低，當(dāng)重復(fù)數(shù)達(dá)到10次以上時(shí)，開始逐漸趨于平穩(wěn)（圖2）。

2.4 施藥時(shí)間

在不同施藥時(shí)間內(nèi)，生防菌和免疫誘抗劑對(duì)潰瘍病的抑制效果不同。0.1%S-誘抗素水劑、1.2%辛菌胺醋酸鹽水劑、10%亞磷酸鉀水溶液、0.007 5%蕓苔素內(nèi)脂水劑、3 000億芽孢/g熒光假單胞菌可濕性粉劑、植物防凍劑、10億cfu/g多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑等7種藥劑，接種前7 d施藥的抑制率顯著高于接種前2 d施藥的抑制率（P＜0.05）；1 000億芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑（河北中保）、1 000億孢子/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑（河北冠農(nóng)）、6%寡糖·鏈蛋白可濕性粉劑、10億芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑、3%氨基寡糖素水劑、0.2%補(bǔ)骨脂種子提取物微乳劑、0.5%香菇多糖水劑、98%復(fù)硝酚鈉和萬壽菊發(fā)酵液等9種藥劑，接種前7 d施藥的抑制率與接種前2 d施藥效果相當(dāng)，無顯著差異。80億芽孢/g甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌LW-6可濕性粉劑，接種前7 d施藥的抑制率略低于接種前2 d施藥效果，差異不顯著（圖3）。

圖3 接種前7 d 施藥與接種前2 d 施藥抑制率對(duì)比

2.5 不同藥劑對(duì)獼猴桃潰瘍病室內(nèi)抑制效果

6種生防菌、7種免疫誘抗劑和4種免疫誘抗物對(duì)獼猴桃潰瘍病均有一定抑制作用（表3）。其中，0.2%補(bǔ)骨脂種子提取物微乳劑、0.1%S-誘抗素水劑抑制率最高，分別為77.03%和75.35%，與3 000億芽孢/g熒光假單胞菌可濕性粉劑和3%氨基寡糖素水劑等12種藥劑有顯著差異；其次，1.2%辛菌胺醋酸鹽水劑、80億芽孢/g甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌LW-6可濕性粉劑和10億芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑，抑制率分別為71.14%、70.38%和68.43%。

表3 接種前7 d 噴藥不同藥劑的抑制率

2.6 田間藥劑試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果表明，0.2%補(bǔ)骨脂種子提取物微乳劑等5種藥劑對(duì)獼猴桃潰瘍病均有一定的防效（表4）。3次施藥后10 d，0.2%補(bǔ)骨脂種子提取物微乳劑、0.1%S-誘抗素水劑、1.2%辛菌胺醋酸鹽水劑、80億芽孢/g甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌LW-6可濕性粉劑和10億芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑的平均防效分別為64.51%、66.10%、59.86%、62.31%和53.75%。其中，0.2%補(bǔ)骨脂種子提取物微乳劑和0.1%S-誘抗素水劑對(duì)獼猴桃潰瘍病防效最好，其與10億芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑的防效有顯著差異。

表4 生防菌和免疫誘抗劑防治獼猴桃潰瘍病試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)果與討論

離體枝條接種的方法在獼猴桃潰瘍病防治藥劑篩選中已有應(yīng)用，但對(duì)于接種量、試驗(yàn)群體數(shù)量和調(diào)查時(shí)間等參數(shù)一直未有較為系統(tǒng)的研究。筆者探索防治獼猴桃潰瘍病的藥劑，包括病原、藥劑和寄主的生物測(cè)定方法。試驗(yàn)結(jié)果表明，在接種量5～20 μL，接種量對(duì)發(fā)病程度無顯著影響。從試驗(yàn)群體數(shù)量來看，當(dāng)重復(fù)數(shù)小于10次時(shí)，隨著重復(fù)數(shù)的增加，標(biāo)準(zhǔn)誤快速減少；當(dāng)重復(fù)數(shù)大于10次以后，趨于穩(wěn)定，并緩慢下降。結(jié)合試驗(yàn)工作量，建議殺菌劑防治獼猴桃潰瘍病室內(nèi)生物測(cè)定的重復(fù)數(shù)為10次。從調(diào)查時(shí)間來看，隨著接種后保濕的時(shí)間越長(zhǎng)，獼猴桃潰瘍病的病斑越大，試驗(yàn)變異系數(shù)越小。筆者證實(shí)了噴施藥劑、傷口接種、保濕培養(yǎng)后調(diào)查試驗(yàn)結(jié)果的方法，可有效地評(píng)價(jià)生防菌和免疫誘抗劑對(duì)獼猴桃潰瘍病的防效。該方法可用于其他枝干類病害生物測(cè)定，但是接種方法、試驗(yàn)群體數(shù)量和調(diào)查時(shí)間等參數(shù)需要根據(jù)病害擴(kuò)展速度和變異程度確定。

獼猴桃潰瘍病是獼猴桃生產(chǎn)中最重要的病害，目前藥劑防治依然是防治獼猴桃潰瘍病的主要手段。許多研究者都曾進(jìn)行藥劑防治試驗(yàn)，陳亮等[8]采用離體試驗(yàn)和室內(nèi)盆栽活體試驗(yàn)的方法測(cè)試了硫酸鏈霉素、中生菌素等幾種殺菌劑對(duì)獼猴桃潰瘍病的防效；張文娟[9]測(cè)試了一株獼猴桃潰瘍病內(nèi)生放線菌WN34及其發(fā)酵液活性粗提物的抑菌效果和田間防效，證實(shí)WN34菌株發(fā)酵液具有開發(fā)成為新型生防藥劑的潛力；Lovato等[10]證實(shí)了綠茶提取物可使獼猴桃潰瘍病致病力降低；Minardi等[11]發(fā)現(xiàn)潰瘍病在無癥狀獼猴桃植株中的存在時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)數(shù)年，并提出僅依賴植株表面殺菌處理來防治獼猴桃潰瘍病是否有效的問題；龍友華等[12]和黃露等[13]采用室內(nèi)平板菌落計(jì)數(shù)測(cè)試藥劑毒力并結(jié)合田間試驗(yàn)進(jìn)行了獼猴桃潰瘍病化學(xué)防治藥劑篩選；秦虎強(qiáng)等[14]篩選了獼猴桃潰瘍病的化學(xué)防治藥劑。筆者篩選了17種防治獼猴桃潰瘍病的生防菌類藥劑及免疫誘抗劑，其中0.2%補(bǔ)骨脂種子提取物微乳劑、0.1%S-誘抗素水劑在室內(nèi)生物測(cè)定中抑制率較好，80億芽孢/g甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌LW-6可濕性粉劑和1.2%辛菌胺醋酸鹽水劑次之，田間防效為59.86%～66.10%，可以結(jié)合其他藥劑，用于獼猴桃潰瘍病的防治。

不同施藥時(shí)間對(duì)潰瘍病防效不同，如秦虎強(qiáng)等[15]研究了72%農(nóng)用鏈霉素可溶粉劑、46%氫氧化銅水分散粒劑、20%葉枯唑可濕性粉劑和1.5%噻霉酮水乳劑的預(yù)防和治療效果，表明侵染前施藥的防效優(yōu)于侵染后。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)接種前7 d施藥的效果整體優(yōu)于接種前2 d的抑制效果，且不同藥劑差異不同，其中0.1%S-誘抗素水劑等7種藥劑，接種前7 d施藥效果顯著優(yōu)于接種前2 d施藥，這可能是因?yàn)樯谰兔庖哒T抗劑需較長(zhǎng)時(shí)間才能在植株上定殖或誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性，筆者將進(jìn)一步研究明確其機(jī)制。