食物中L-肉堿含量及其測(cè)定方法的研究進(jìn)展

王 新，王秋舉, ，劉洪健，王 寧，徐永平，馬 悅，張東鳴,2,

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118；2.通化師范學(xué)院，吉林通化 134000；3.吉林省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，吉林長(zhǎng)春 130012；4.大連賽姆生物工程技術(shù)有限公司，遼寧大連 116620)

L-肉堿的首次發(fā)現(xiàn)是在上世紀(jì)初(1905年)[1]，從最開始的認(rèn)知維生素Bt到現(xiàn)在所謂的功能全面的免疫增強(qiáng)劑已有百余年的歷史。隨著L-肉堿功能研究的不斷深入，人們對(duì)L-肉堿的認(rèn)識(shí)也逐漸增多。目前L-肉堿已被應(yīng)用到養(yǎng)殖、食品、生物制藥等多種行業(yè)中，不僅成為人們飲食當(dāng)中不可缺少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，更是老年人、孕婦、病人等一些特殊人群的保健佳品?，F(xiàn)已證明L-肉堿能加快細(xì)胞對(duì)脂肪的消耗，為人體提供能量，同時(shí)具有抗氧化、抗衰老和提高免疫力等功能[2]。因此，保證充足的L-肉堿的攝入量對(duì)于人體健康和疾病預(yù)防具有重要意義。人體中L-肉堿來(lái)源于日常膳食和自身合成兩部分，日常膳食為L(zhǎng)-肉堿的主要來(lái)源，約為75%[3]。因此，探明不同食物L(fēng)-肉堿含量，建立合理的飲食結(jié)構(gòu)來(lái)保證L-肉堿的基本需要，對(duì)于人類充分利用L-肉堿，保持健康至關(guān)重要。

L-肉堿幾乎存在于所有動(dòng)植物、細(xì)胞及微生物中，L-肉堿含量在不同物種間變化較大，而且即使在同物種間，可能也會(huì)因?yàn)椴煌臄z食類型和生活方式而產(chǎn)生較大差異。尤其是在動(dòng)物組織中，L-肉堿含量會(huì)受到年齡、性別、營(yíng)養(yǎng)、疾病等多種因素的影響。成年健康動(dòng)物血液中L-肉堿含量與L-肉堿攝入量成正相關(guān)[4]。雖然世界各國(guó)對(duì)L-肉堿的生理、生化、營(yíng)養(yǎng)和臨床等方面進(jìn)行了深入而廣泛的研究，但國(guó)內(nèi)對(duì)L-肉堿的研究相對(duì)較少，尤其是關(guān)于食物中L-肉堿含量及其測(cè)定方法的相關(guān)報(bào)道甚少[5]。因此，精確地測(cè)定L-肉堿含量，合理地利用食物中所含L-肉堿，對(duì)人類保健具有重要的意義。本文基于以往研究的結(jié)果，對(duì)食物中L-肉堿含量和測(cè)定方法進(jìn)行整理和分析，為正確認(rèn)識(shí)L-肉堿、外源攝食肉堿的人群提供基礎(chǔ)理論依據(jù)，為優(yōu)化L-肉堿檢測(cè)方法并應(yīng)用于實(shí)踐提供參考數(shù)據(jù)。

1 食物中L-肉堿的含量

在哺乳類動(dòng)物中，主要合成L-肉堿的部位是肝臟，此外在睪丸和腎臟中也能合成[6]。動(dòng)物體中肌肉和心臟L-肉堿含量較高，人體98%的L-肉堿存在于肌肉和心臟中，其它組織中含量較少，血漿與肌肉L-肉堿濃度之比為1∶50[7]。鮮肉類食品L-肉堿含量最高(500～1200 mg/kg)，其次是魚類、雞肉和奶制品，而蔬菜、水果等植物性食品中L-肉堿含量最少[8]。通常情況下，多樣化的飲食方式較為科學(xué)合理，能滿足機(jī)體L-肉堿的需求，而素食者對(duì)L-肉堿的需求往往會(huì)增加。動(dòng)物性食品、植物性食品、奶制品和雞蛋中總L-肉堿及游離L-肉堿含量的存在情況分別見(jiàn)表1～表3。

表1 常見(jiàn)動(dòng)物性食品中L-肉堿含量Table 1 L-Carnitine contents in the routine animal food

從表1可知，肉類中除臟器外總L-肉堿含量最高的是山羊肉(184.0 mg/100 g)，其次是袋鼠肉(166.0 mg/100 g)、駱駝肉(110.9 mg/100 g)、馬肉(117 mg/100 g)、牛肉(95.3 mg/100 g)、鹿肉(74.0 mg/100 g)和豬肉(22.4 mg/100 g)。人類食物中L-肉堿的主要來(lái)源是肉類，與其它組織相比，多數(shù)動(dòng)物的肌肉組織L-肉堿含量較高[9-10]。

蔬菜和水果中L-肉堿含量較少，除去皮后鱷梨(8.1 mg/100 g)和豌豆(5.7 mg/100 g)外，一般少于5 mg/100 g。黑醋栗、蘆筍、黃瓜(去皮)、馬鈴薯(煮過(guò))、樹薯、西紅柿、菠菜、粳米(煮后)、面條(煮后)中均未檢測(cè)到L-肉堿，這就說(shuō)明植物性食品中L-肉堿含量較少，這是由于大多數(shù)植物中缺少L-肉堿的前體——賴氨酸和蛋氨酸的原因[21]，具體含量見(jiàn)表2。

續(xù)表 1

表2 常見(jiàn)植物性食品中L-肉堿含量Table 2 L-Carnitine contents in the routine animal plant food

由表3可知，奶制品中L-肉堿的含量變化較大，酪乳(粉末)和明斯特乳酪L-肉堿含量相對(duì)較高[22]，分別是(22.5 mg/100 g)和(19.8 mg/100 g)，雞蛋蛋白和卵黃中L-肉堿水平分別為(0.3 mg/100 g)、(0.8 mg/100 g)。奶制品L-肉堿含量的測(cè)定在不同的研究中出現(xiàn)了一定的差異，樣品的測(cè)定方法和樣品來(lái)源的動(dòng)物及其年齡、飼養(yǎng)等因素均會(huì)影響奶制品中L-肉堿水平[11,23-24]。

表3 奶制食品和雞蛋的L-肉堿含量Table 3 L-carnitine contents in the dairy products and eggs

人類營(yíng)養(yǎng)學(xué)的研究表明，每個(gè)成年人身體中平均含有25 g/L-肉堿，建議每天應(yīng)從飲食中攝取L-肉堿量為0.3～1.9 mg/kg[25]。平衡的飲食能為人體提供76.5 mg/L-肉堿，其中77.8%來(lái)源于肉類，14.4%來(lái)源于日常食物和蛋類[26]。飲食均衡的人群并不需要額外補(bǔ)充，食物中所含L-肉堿即可滿足生理代謝的需要[27-28]。而素食主義者L-肉堿的攝取量約為16.2 mg，嚴(yán)格素食主義者L-肉堿的攝取量則小于16.2 mg，因此外源攝取L-肉堿含量則不能滿足需要。雖然人體內(nèi)存在L-肉堿的合成途徑，但該途徑極容易受到維生素C和二價(jià)鐵離子的影響，所以對(duì)于素食主義者和嚴(yán)格素食主義者而言，由于所攝食的肉類較少，為滿足機(jī)體需要?jiǎng)荼匾蕾嘗-肉堿的內(nèi)源合成途徑來(lái)保持L-肉堿的穩(wěn)態(tài)，這就要求機(jī)體確保具有足夠多L-肉堿合成的所有底物和輔酶因子，尤其是蛋氨酸、賴氨酸、維生素C、維生素B6和鐵離子等[29]。

L-肉堿是安全無(wú)毒的小分子物質(zhì)，被人體吸收后不會(huì)轉(zhuǎn)化分解為其它物質(zhì)，但是L-肉堿如果不能被腸道吸收，就會(huì)經(jīng)腸道菌群及酶作用下分解產(chǎn)生氧化三甲胺。氧化三甲胺是三甲胺形成的N-氧化物[30]。近年來(lái)，氧化三甲胺在各種病理狀態(tài)中的作用引起了廣泛的關(guān)注。心血管疾病是導(dǎo)致人類死亡最主要的疾病之一，而動(dòng)脈粥樣硬化是造成心血管疾病形成的主要病理基礎(chǔ)。因此，在滿足機(jī)體需要的情況下，應(yīng)避免攝食過(guò)量的肉類物質(zhì)，避免過(guò)多的L-肉堿在腸道滯留，從而減少氧化三甲胺水平，保證身體健康[31-33]。

2 L-肉堿含量測(cè)定方法的研究

2.1 高效液相色譜法

高效液相色譜法主要分為直接測(cè)定和間接檢測(cè)兩種。衍生化反應(yīng)是一種利用化學(xué)變換把化合物轉(zhuǎn)化成類似化學(xué)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，一般來(lái)說(shuō)，一個(gè)特定功能的化合物參與衍生反應(yīng)，溶解度、沸點(diǎn)、熔點(diǎn)、聚集態(tài)或化學(xué)成分會(huì)產(chǎn)生偏離。由此產(chǎn)生的新的化學(xué)性質(zhì)可用于量化或分離。離子對(duì)試劑法是通過(guò)電力能力較強(qiáng)的離子化合物與目標(biāo)離子化合物形成中性的分子態(tài)物質(zhì)，這樣大大增強(qiáng)了該目標(biāo)離子化合物的保留能力，便于檢測(cè)。高效液相色譜法一般均通過(guò)衍生化反應(yīng)和離子對(duì)試劑法進(jìn)行間接檢測(cè)，因用C18柱和C8柱可以分離γ-丁基甜菜堿和L-肉堿，但不能分離巴豆甜菜堿和L-肉堿，因此一般不采用高效液相色譜法直接檢測(cè)。莫紫梅[34]利用離子對(duì)試劑法測(cè)定保健食品中L-肉堿含量得出該方法快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可作為口服液類輔助降血脂保健食品的質(zhì)量控制方法。李景華等[35]建立了測(cè)定降血脂藥物中L-肉堿含量的簡(jiǎn)便方法，該方法操作簡(jiǎn)便、快速、有良好的準(zhǔn)確度。臨床上，人體血漿的樣本可以用乙腈和甲醇混合液萃取出來(lái)，并用0.5 mL的硅膠柱進(jìn)行分離，通過(guò)高效液相色譜法進(jìn)行L-肉堿、乙酰肉堿的檢測(cè)[36]。游離L-肉堿被衍化為紫外可以吸收的酯化形式，所形成的衍生物的穩(wěn)定性，在不同時(shí)間內(nèi)依然能通過(guò)HCLP進(jìn)行檢測(cè)。峰面積和濃度之間的線性關(guān)系為y=950.0x-104.2，r=0.9999，游離L-肉堿和總L-肉堿的批內(nèi)和批間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.23%和1.18%[37]。其他人的研究結(jié)果顯示用這種方法所得到的精液中游離L-肉堿的回收率在91.6%～96.5%[38]。尿液中L-肉堿和酰基L-肉堿的測(cè)定方法被進(jìn)一步的發(fā)展[39]，L-肉堿和?；鵏-肉堿與熒光衍生試劑進(jìn)行反應(yīng)，通過(guò)液相的梯度洗脫進(jìn)行測(cè)定[40]。棕櫚酰L-肉堿和硬酯酰L-肉堿的分析恢復(fù)率在70%～76%，L-肉堿及其它?；鵏-肉堿的恢復(fù)率在96%以上。Sun等[41]也是通過(guò)衍生化處理，并通過(guò)HCLP進(jìn)行連續(xù)血樣L-肉堿水平的測(cè)定，游離L-肉堿回收率為98.2%，總L-肉堿水平為96.3%。綜合以上研究說(shuō)明高效液相色譜法是一種操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好的測(cè)定L-肉堿的方法且方法應(yīng)用廣泛。

2.2 質(zhì)譜分析法

質(zhì)譜分析法是一種有效且多功能的分析技術(shù)，它利用電磁學(xué)原理將化合物電離成具有不同質(zhì)量的離子，然后按其質(zhì)荷比的大小依次排列成譜收集和記錄下來(lái)，因此，可以用來(lái)確定未知化合物成分、定量已知材料，并且闡述有機(jī)物和無(wú)機(jī)物的化學(xué)組成和分子結(jié)構(gòu)[37]。質(zhì)譜分析是一種敏感的分析方法，該方法具有較強(qiáng)的敏感性和專一性，可控性強(qiáng)，并且具有準(zhǔn)確、快速、高效、高通量的優(yōu)勢(shì)。但是目前，由于成本較高，這種方法并未被多數(shù)實(shí)驗(yàn)室所采用，該法多用于臨床上分析檢測(cè)先天性L-肉堿代謝性障礙等疾病，而并非是對(duì)L-肉堿水平的定量。質(zhì)譜分析法主要包括質(zhì)譜串聯(lián)法(MS/MS)、同位素稀釋電噴霧與質(zhì)譜串聯(lián)法、液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)合技術(shù)。

MS/MS方法可以測(cè)定低水平肉堿的樣本,隨著對(duì)質(zhì)譜使用程度的增加，MS/MS方法測(cè)定血漿中游離肉堿和總?cè)鈮A逐漸得到發(fā)展和改良，即酸水解MS/MS法和堿水解MS/MS法，這些改良方法均提高了樣本的檢測(cè)速率和準(zhǔn)確度[42]。同位素稀釋電噴霧與質(zhì)譜串聯(lián)法使用快速原子轟擊產(chǎn)生的電離作用而測(cè)定，只要求很少的樣品準(zhǔn)備時(shí)間和步驟，在專一性和準(zhǔn)確性、精確度上與放射法一樣好，并且更為方便有效[43]?，F(xiàn)今已經(jīng)越來(lái)越多的研究將液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行聯(lián)合使用測(cè)定L-肉堿水平，與LCMS相比，LC-MS/MS具有更高的敏感性和專一性，但是成本要高很多，多數(shù)均是在醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室使用[44]。

2.3 電泳法

電泳法(CE)是一類以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力的新型液相分離技術(shù)。CE檢測(cè)系統(tǒng)包括直接和間接的紫外光、熒光、電化學(xué)和其他類型的檢測(cè)器。但是，L-肉堿在紫外-可見(jiàn)光譜區(qū)的吸收是很弱的，并且缺乏熒光。直接分離方法不能測(cè)定L-肉堿水平，因此必須要進(jìn)行衍生化處理[45]。但現(xiàn)在有研究將電泳技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)(CE-MS)聯(lián)合使用測(cè)定L-肉堿，取得了良好的效果。CE-MS的優(yōu)勢(shì)是不需要進(jìn)行L-肉堿的衍生化反應(yīng)，另外，該法雜質(zhì)干擾的影響較小，電泳時(shí)間較短。這種方法是一種適合測(cè)定樣品組分的理想方法[46]。但電泳法在實(shí)驗(yàn)室使用較少，因?yàn)槌绦虮容^復(fù)雜、可重復(fù)性低。

2.4 分光光度分析法

分光光度法是檢測(cè)L-肉堿的傳統(tǒng)方法，它是建立在酶反應(yīng)的基礎(chǔ)上，即以乙酰CoA和L-肉堿為反應(yīng)底物，乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶為催化劑，生成乙酰-L-肉堿后再與相應(yīng)顯色劑反應(yīng)生成可檢測(cè)的黃色產(chǎn)物(DTNB)，顏色深淺與L-肉堿水平在線性范圍內(nèi)呈正比，利用分光光度讀取分光光度值，以此計(jì)算得到樣本中的游離L-肉堿水平。

Matsumoto等[47]發(fā)明了一種熒光的方法，通過(guò)肉堿脫氫酶測(cè)定了不同年齡男性和女性血清中游離L-肉堿和酯酰L-肉堿水平，證實(shí)了L-肉堿隨年齡的變化趨勢(shì)和性別不同導(dǎo)致L-肉堿水平的差異。熒光光譜法測(cè)定L-肉堿的方法的優(yōu)化，無(wú)外乎就是對(duì)各步驟進(jìn)行最優(yōu)化處理。Wan等[48]改良了一種方法，減少了成本，并且能在1 h內(nèi)得到游離L-肉堿和總L-肉堿的結(jié)果。這種方法要求簡(jiǎn)單的兩部樣品準(zhǔn)備的步驟，之后采用隨機(jī)存取化學(xué)分析儀進(jìn)行結(jié)果測(cè)定。該方法價(jià)格便宜，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，不需要衍生化樣本。但其檢出限遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于液相和質(zhì)譜法等方法，而且酶反應(yīng)過(guò)程中，酶易失活，樣品制備復(fù)雜，操作時(shí)間長(zhǎng)，雜散光干擾，可重復(fù)性與可控性差，不適合大量樣品的快速檢測(cè)。

2.5 放射分析法

放射-酶分析法是將乙酰CoA用C14標(biāo)記，即[C14]乙酰CoA與L-肉堿反應(yīng)生成[C14]乙酰L-肉堿和輔酶A(CoASH)，將乙酰L-肉堿從乙酰CoA中分離出來(lái)，并測(cè)定L-肉堿的含量[49]。由于一些限制性因素，如：特異性、線性范圍、脫蛋白，原有的方法總是在被進(jìn)行重復(fù)和改良，改良后的方法又具有了一定特性。Seline等[15]對(duì)放射-酶法測(cè)定L-肉堿含量進(jìn)行了一些研究發(fā)現(xiàn)在分析過(guò)程中一些混合物具有放射性現(xiàn)象并對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。除此之外，還測(cè)定了一些動(dòng)植物樣本中L-肉堿水平。在超過(guò)15 μmol/L時(shí)，線性關(guān)系均才是成立的，此方法可被用于測(cè)定肉類和蔬菜類中的總L-肉堿、游離L-肉堿和乙酰L-肉堿的量。

2.6 電化學(xué)法

電化學(xué)法創(chuàng)造了連續(xù)檢測(cè)化合物的可能性，這種方法使用帶有電化學(xué)傳感器作為檢測(cè)器的不同連續(xù)系統(tǒng)，獲得了理想的測(cè)定效果。目前報(bào)道的有流動(dòng)注射分析儀技術(shù)和順序注射分析技術(shù)[50]。Isabel等[51]通過(guò)使用流動(dòng)注射(FI)和固定的肉堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶生物反應(yīng)器，對(duì)嬰兒配方食品樣品進(jìn)行分析，以確定其游離L-肉堿含量。該方法基于分光光度法，通過(guò)與肉堿乙?；D(zhuǎn)移酶、乙酰輔酶A和二硫代苯甲酸酯反應(yīng)來(lái)進(jìn)行。龔尚于等[52]采用流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光法測(cè)定減肥藥物中L-肉堿含量，方法基于在堿性介質(zhì)中，L-肉堿對(duì)Ag(Ⅲ)配合物-魯米諾化學(xué)發(fā)光體系有顯著的增敏作用，且化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度在一定范圍內(nèi)與L-肉堿的濃度呈線性關(guān)系。電化學(xué)技術(shù)具有儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、易于操作，靈敏度和準(zhǔn)確度高，實(shí)用性強(qiáng)，易攜帶，且其費(fèi)用較低等優(yōu)點(diǎn)。

3 結(jié)語(yǔ)

L-肉堿因其特有的生理功能，在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域得到了越來(lái)越廣泛的關(guān)注，因此對(duì)食物中L-肉堿的準(zhǔn)確含量及其檢測(cè)方法進(jìn)行總結(jié)是十分必要的。本文詳細(xì)地介紹了以往研究中食物L(fēng)-肉堿的水平及檢測(cè)方法，同時(shí)也對(duì)微生物代謝L-肉堿后所產(chǎn)生的有毒物質(zhì)氧化三甲胺進(jìn)行了分析，這為人們準(zhǔn)確地掌握各種食物中L-肉堿含量及合理地利用L-肉堿提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和建議。酶促反應(yīng)與分光光度法聯(lián)合使用是實(shí)驗(yàn)室常用的L-肉堿測(cè)定方法，但其精確度不足。隨著儀器設(shè)備和分析方法的不斷發(fā)展，高效液相色譜法、電泳法、質(zhì)譜法、電化學(xué)法等檢測(cè)L-肉堿的研究備受關(guān)注，這些方法選擇性好、靈敏度高，但操作過(guò)程過(guò)于繁瑣，因此，未來(lái)L-肉堿檢測(cè)方法將會(huì)進(jìn)一步的優(yōu)化組合各種前處理方法和檢測(cè)方法，向更加方便快速、更加準(zhǔn)確、精確的方向發(fā)展。