庫(kù)車(chē)小白杏混菌乳酸發(fā)酵工藝優(yōu)化及其發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型

王旭光，茹先古麗·買(mǎi)買(mǎi)提依明，徐曉培，白 琳，王 亮，劉 軍，艾合買(mǎi)提江·艾海提

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊 830046)

杏是世界上最受歡迎的水果之一，屬于薔薇科，富含維生素、碳水化合物、有機(jī)酸和人體必需礦物質(zhì)[1-2]。新疆庫(kù)車(chē)地區(qū)小白杏資源豐富，但庫(kù)車(chē)小白杏成熟期短，且新鮮杏的保質(zhì)期僅為3～5 d，易腐爛變質(zhì)，難以?xún)?chǔ)存和運(yùn)輸，以致每年損失約11%。目前通常將杏子加工為罐頭以延長(zhǎng)保存時(shí)間[3]，除此之外，它的開(kāi)發(fā)和利用非常有限。

果汁可以作為良好的益生菌培養(yǎng)基[4]，且乳酸菌發(fā)酵可以保持水果的營(yíng)養(yǎng)和感官，并提高水果的貨架期[5-6]。目前，已有關(guān)于水果和蔬菜的乳酸菌發(fā)酵的研究報(bào)道，如哈密瓜汁[7]、石榴汁[8]、腰果梨汁[9]、菠蘿汁[10]和土豆汁[11]。經(jīng)常食用益生菌有很多好處，如調(diào)節(jié)腸道功能、改善乳糖消化、增強(qiáng)免疫系統(tǒng)、抑制病原體和抗腫瘤[12]。食品的原料成分可以通過(guò)乳酸發(fā)酵得到改善，產(chǎn)生具有更高生物活性的衍生化合物[13-14]，如超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性可通過(guò)乳酸發(fā)酵得到增加[15]。SOD是抵抗ROS降解作用的一系列抗氧化酶的第一道防線(xiàn)，因此它具有極其重要的生理意義[16]。水果中的L-蘋(píng)果酸會(huì)使發(fā)酵液具有尖刻的酸草味[17]。而乳酸菌可以將L-蘋(píng)果酸作為底物將其代謝為CO2和感官較柔和的L-乳酸[18-19]，所以利用乳酸發(fā)酵可將果汁加工成風(fēng)味更理想的飲料[20]。

基于上述考慮，本研究以庫(kù)車(chē)小白杏為原料，以SOD活力和感官評(píng)分為指標(biāo)，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化小白杏混菌(植物乳桿菌和羅伊氏乳桿菌)乳酸發(fā)酵工藝，并建立發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型，為庫(kù)車(chē)小白杏乳酸發(fā)酵提供理論基礎(chǔ)。以期開(kāi)發(fā)健康營(yíng)養(yǎng)的飲料產(chǎn)品，并以此來(lái)減少庫(kù)車(chē)小白杏采摘后損失。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小白杏 新疆自治區(qū)庫(kù)車(chē)縣；兩種乳酸菌(植物乳桿菌bio-52467和羅伊氏乳桿菌bio-53258) 中國(guó)微生物菌種保藏中心；果膠酶(酶活為50 U/mg)、纖維素酶(酶活為50 U/mg)、半纖維素酶(酶活為20 U/mg) 上海源葉生物科技有限公司；保鮮膜(規(guī)格30 cm×20 m) 購(gòu)于當(dāng)?shù)爻小?/p>

RBM-767S型高端破壁料理機(jī) 廣州隆特電子有限公司；UV752N紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 德國(guó)耶拿分析儀器股份公司；DK-600A型電熱恒溫水浴鍋 北京市光明醫(yī)療儀器有限公司；BSA224S電光學(xué)天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；TDL-5M臺(tái)式低速冷凍離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小白杏果漿的制備 小白杏在中國(guó)新疆庫(kù)車(chē)縣果園進(jìn)行人工采摘，使用前在4 ℃冷藏。通過(guò)打漿機(jī)打漿后將果漿加熱至55 ℃以進(jìn)行酶解。酶添加量為3‰，果膠酶、纖維素酶和半纖維素酶的比例為2∶1∶1。然后放入500 mL無(wú)菌錐形瓶中，在100 ℃滅菌20 min。隨后冷卻至36 ℃待用。

1.2.2 微生物培養(yǎng) 將菌種在MRS肉湯培養(yǎng)基中于36 ℃厭氧培養(yǎng)24 h?；罨?，培養(yǎng)至第三代菌。初始菌濃度約為8.0 lg CFU·mL-1。將菌液保持在4 ℃待用。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 在本研究中，選擇羅伊氏乳桿菌和植物乳桿菌進(jìn)行混合培養(yǎng)。研究了四個(gè)主要影響因素：溫度28.0、32.0、36.0和40.0 ℃)，菌種比例(植物乳桿菌∶羅伊氏乳桿菌)(1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1)，接種量(1.0%、3.0%、5.0%、7.0%和9.0%)和發(fā)酵時(shí)間(20、24、28、32和36 h)。發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定SOD活力和感官評(píng)分。除研究因素外，其他條件為36 ℃，菌種比例為3∶1，接種量為5.0%，時(shí)間為28 h。所有發(fā)酵樣品均一式三份置于不同溫度下進(jìn)行靜置發(fā)酵。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，使用中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(central composite experimental design，CCD)研究溫度(X1，℃)、菌株比例(X2，(v/v))、接種量(X3，%)和發(fā)酵時(shí)間(X4，h)的線(xiàn)性、交互作用和平方效應(yīng)。使用Design-Expert 8.0.6(Stat-Ease Inc.，USA)軟件進(jìn)行分析。表1中提供了自變量的水平及其編碼值。使用全因子CCD進(jìn)行30組實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了發(fā)酵條件。因變量(Y)是杏汁的SOD活力(Y1，U/g)和感官評(píng)分(Y2)，將其擬合得到二次模型(式1)：

1.2.5 成分分析 杏汁中的總可溶性固形物(Total soluble solids，TSS)用折光儀測(cè)定，并以°Brix表示；pH通過(guò)臺(tái)式酸度計(jì)測(cè)量；SOD活力使用SOD試劑盒測(cè)定；總糖、總酸含量根據(jù)GB/T 15038-2006測(cè)定；菌濃度測(cè)定使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)；按照GB/T 4789.3-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》規(guī)定方法對(duì)大腸菌群進(jìn)行測(cè)定。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平表Table 1 Factors and levels table of response surface experiment

1.2.6 感官分析 根據(jù)Matej?eková等[21]描述的方法，對(duì)小白杏乳酸發(fā)酵液進(jìn)行詳細(xì)的感官評(píng)估和定量描述分析(QDA)。此方法可以獲得詳細(xì)完整的產(chǎn)品感覺(jué)描述，從而清楚地顯示產(chǎn)品之間的差異。感官分析包括顏色、杏子味、甜度、酸度、澀味和香氣(見(jiàn)表2)。發(fā)酵液樣品的感官指標(biāo)分為10個(gè)等級(jí)(1和10分別表示“極度不喜歡”和“極度喜歡”)。以6項(xiàng)分?jǐn)?shù)之和代表感官評(píng)分(總分60分)。

1.2.7 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型 文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道了關(guān)于微生物發(fā)酵的各種動(dòng)力學(xué)模型[22]。也已被證明能夠描述各種實(shí)驗(yàn)條件和培養(yǎng)基[23]。對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)和代謝物生成動(dòng)力學(xué)，logistic方程是一個(gè)“S”型曲線(xiàn)模型，該模型可以很好地描述發(fā)酵系統(tǒng)中細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝物的生成過(guò)程[24]。Logistic方程如下(式2)：

式中：i分別代表1(菌濃度)、2(SOD活力)；Z1為菌濃度，lg CFU·mL-1；μ1m為最大比生長(zhǎng)速率，h-1；Z1m為最大菌濃度，lg CFU·mL-1；Z10為初始菌濃度，lg CFU·mL-1；Z2為SOD活力，U/g；μ2m為最大比生成速率，h-1；Z2m為最大SOD活力，U/g；Z20為初始SOD活力，U/g；t為發(fā)酵時(shí)間，h。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有樣品分析均重復(fù)三次。單因素實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，使用軟件SPSS/PC13.0版(SPSS Inc.，Chicago，IL，美國(guó))進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；使用Design-Expert V8.0.6進(jìn) 行 響 應(yīng) 面 設(shè) 計(jì)；使 用GraphPad Prism 8進(jìn)行發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模擬并繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 發(fā)酵溫度對(duì)SOD活性和感官評(píng)分的影響 如圖1(a)所示，溫度對(duì)SOD活性和感官評(píng)分有明顯影響。結(jié)果表明，當(dāng)溫度低于36 ℃時(shí)，SOD活性和感官評(píng)分均隨溫度的升高而顯著增加(P<0.05)。在36 ℃時(shí)，SOD活性和感官評(píng)分同時(shí)達(dá)到最高(307.36 U/g和51分)。但在40 ℃時(shí)，SOD活性和感官分?jǐn)?shù)降低。這是因?yàn)?0 ℃的條件使乳酸菌活性降低，導(dǎo)致SOD活性隨之降低。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道報(bào)告，乳酸菌的活性取決于許多因素，尤其是溫度，不同乳酸菌的最佳溫度范圍均低于37 ℃[25-26]。因此，在隨后實(shí)驗(yàn)中，選擇36 ℃作為最佳發(fā)酵溫度。

2.1.2 菌種配比對(duì)SOD活性和感官評(píng)分的影響 圖1(b)顯示菌種配比對(duì)SOD活性和感官評(píng)分有顯著影響(P<0.05)。數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)菌種配比為3∶1時(shí)，SOD活性和感官評(píng)分均達(dá)到最高水平。但是，當(dāng)菌種配比從3∶1到5∶1時(shí)，SOD活性開(kāi)始從305.60 U/g下降到259.47 U/g，感官評(píng)分從50.76分降低到45.35分。結(jié)果表明，兩種乳酸菌之間的協(xié)同作用在3∶1時(shí)效果最高。因此，所需的菌種配比應(yīng)為3∶1。

2.1.3 接種量對(duì)SOD活性和感官評(píng)分的影響 從圖1(c)可以看出，接種量對(duì)SOD活性和感官有重要影響。接種量為1.0%時(shí)，SOD活性最低，為244.38 U/g。當(dāng)接種量在1.0%～5.0%之間時(shí)，SOD活性隨接種量的增加而增加，在接種量5%時(shí)達(dá)到最高值，為306.99 U/g。接種量從1.0%增加到3.0%時(shí)，感官評(píng)分增高，但隨后繼續(xù)增加接種量時(shí)，感官評(píng)分沒(méi)有顯著差異(P>0.05)，均顯示出較高水平。但當(dāng)接種量繼續(xù)增加至9.0%時(shí)，SOD活性從306.99 U/g顯著下降至256.61 U/g(P<0.05)；這意味著接種量過(guò)大時(shí)，會(huì)加劇細(xì)菌的種內(nèi)斗爭(zhēng)，降低細(xì)菌活性。因此，之后實(shí)驗(yàn)的接種量選擇為5.0%。

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)SOD活性和感官評(píng)分的影響 如圖1(d)所示，發(fā)酵時(shí)間在20～36 h范圍內(nèi)明顯影響SOD活性，SOD活性在發(fā)酵28 h達(dá)到最高，為309.60 U/g。但隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD活性在36 h降低到242.67 U/g。而感官評(píng)分則在發(fā)酵的第32 h獲得最高分?jǐn)?shù)53.8分，但此時(shí)SOD活力過(guò)低。較短的發(fā)酵時(shí)間會(huì)導(dǎo)致較低的菌濃度，這導(dǎo)致杏汁中的SOD活力較低，且由于蘋(píng)果酸消耗不足導(dǎo)致口感較差。根據(jù)報(bào)道，由于在發(fā)酵過(guò)程中機(jī)體過(guò)多生長(zhǎng)和有機(jī)酸積累，益生菌會(huì)逐漸失去活性[27]。在培養(yǎng)24 h后，乳酸菌可以達(dá)到最高菌濃度[28]。另一方面，當(dāng)細(xì)菌的濃度過(guò)高時(shí)，種內(nèi)斗爭(zhēng)增加，導(dǎo)致益生菌的代謝減少。因此，小白杏最佳發(fā)酵時(shí)間定為28 h。

表2 小白杏發(fā)酵液感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation criteria for apricot fermentation juice

圖1 發(fā)酵溫度(a)、菌種配比(b)、接種量(c)和發(fā)酵時(shí)間(d)對(duì)小白杏發(fā)酵液SOD活性和感官評(píng)分的影響Fig.1 Effect of temperature (a), strains proportion(b),inoculum size(c) and time (d) on SOD activity and sensory evaluation of fermentation of apricot juice

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 單因素實(shí)驗(yàn)表明，小白杏乳酸發(fā)酵過(guò)程中溫度、菌株配比、接種量和時(shí)間對(duì)發(fā)酵液中SOD活性和感官評(píng)分有較大影響。表3顯示了全因子CCD的30組實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵過(guò)程按標(biāo)準(zhǔn)順序排列。通過(guò)多元回歸分析對(duì)響應(yīng)函數(shù)(Yi)進(jìn)行擬合，可以得到以下二階多項(xiàng)式方程，這些方程可以完全代表SOD活性(Y1)和感官評(píng)分(Y2)。

表3 小白杏乳酸發(fā)酵中心復(fù)合設(shè)計(jì)(CCD)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Central composite experimental design (CCD) and experiment results for lactic acid fermentation of apricot juice

表3和表4分別顯示了SOD活性和感官評(píng)分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和方差分析。模型F值分別為42.57和61.56，P<0.0001，表明這兩個(gè)模型均顯著。失擬項(xiàng)的P值分別為0.1039和0.2453，P>0.05，表明該模型可以充分模擬小白杏乳酸發(fā)酵過(guò)程。此外，所有反應(yīng)變量的R2值均大于0.95，表明回歸模型很好地模擬了發(fā)酵過(guò)程?？梢钥闯?，兩個(gè)模型均很好地描述了每個(gè)因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，可以用來(lái)確定最佳發(fā)酵過(guò)程。

表4 中心復(fù)合設(shè)計(jì)(CCD)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 4 Analysis of variance for the experimental results of the CCD

2.2.2 SOD活性響應(yīng)面分析 表3方差分析結(jié)果表明，交互項(xiàng)X1X2、X1X3和X2X4影響極顯著(P<0.01)，X2X3影響顯著(P<0.05)，說(shuō)明交互作用對(duì)小白杏乳酸發(fā)酵中SOD活性有顯著性影響。

圖2(a，b，c，d)是小白杏乳酸發(fā)酵各變量的交互作用對(duì)SOD活性(Y1)影響的3D響應(yīng)面圖。若響應(yīng)曲面傾斜度越高，等高線(xiàn)越接近橢圓形，則說(shuō)明交互作用越強(qiáng)[29]。圖2(a)顯示了發(fā)酵溫度和菌株配比的交互作用對(duì)SOD活性的影響。隨著溫度的升高，SOD活性在32～36 ℃范圍內(nèi)增加，在36～38 ℃達(dá)到峰值，此時(shí)菌株配比約為2∶1。圖2(b)顯示了發(fā)酵溫度和接種量的交互作用對(duì)SOD活性的影響。表明SOD活性在36～37 ℃達(dá)到峰值，此時(shí)接種量為4.0%～6.0%。圖2(c)顯示了菌種配比和接種量的交互作用對(duì)SOD活性的影響。當(dāng)接種量在5.0%左右時(shí)，SOD活性最高，此時(shí)菌種配比約為2∶1。圖2(d)顯示了菌種配比和發(fā)酵時(shí)間的交互作用對(duì)SOD活性的影響。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間在30 h，且菌株比例為2∶1時(shí)，SOD活性最高。由響應(yīng)面圖可以看出，交互項(xiàng)X1X2、X1X3、X2X3和X2X4影響顯著，與方差分析結(jié)果一致。

2.2.3 感官評(píng)分響應(yīng)面分析 由表3方差分析結(jié)果可知，交互項(xiàng)X1X2和X1X4的交互作用影響顯著(P<0.05)，其他交互項(xiàng)則不顯著。

圖2(e)顯示了發(fā)酵溫度和菌種配比的交互作用對(duì)感官評(píng)分的影響。在發(fā)酵溫度為37 ℃左右，菌種配比為2.5∶1時(shí)，具有最高感官評(píng)分。發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間的交互作用對(duì)感官影響如圖2(f)所示。當(dāng)發(fā)酵溫度為37 ℃時(shí)，感官評(píng)分最高，此時(shí)發(fā)酵時(shí)間約為30 h。由響應(yīng)面圖可以看出，交互項(xiàng)X1X2和X1X4的交互作用影響顯著，與方差分析結(jié)果一致。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

使用Design-Expert 8.0.6軟件優(yōu)化發(fā)酵條件，即發(fā)酵溫度(36.71 ℃)、菌種配比(2.61∶1)、接種量(4.9%)和發(fā)酵時(shí)間(29.86 h)。為了便于實(shí)際操作，將最佳發(fā)酵條件設(shè)置如下：溫度(37.0 ℃)，菌種配比(2.6∶1)，接種量(5.0%)和時(shí)間(30 h)。該模型的預(yù)測(cè)響應(yīng)值：SOD活性為308.46 U/g，感官評(píng)分為53.80分。進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證預(yù)測(cè)模型得出：實(shí)際的SOD活性和感官評(píng)分分別為309.60 U/g和54.18分，相對(duì)誤差分別為0.37%和0.71%，表明預(yù)測(cè)值與實(shí)際值之間沒(méi)有明顯差異。

2.4 品質(zhì)指標(biāo)分析

發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液呈現(xiàn)金黃色，色澤均勻有光澤，口感柔和，酸甜適中，無(wú)明顯澀味，有小白杏香味。測(cè)得杏汁中：TSS為16.3 °Brix，總糖為141.30 g/L，總酸為8.20 g/L，pH為3.91，SOD活性為309.60 U/g。大腸桿菌菌群<3 MPN/100 mL，未檢出致病菌。

2.5 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)擬合

小白杏乳酸發(fā)酵動(dòng)力學(xué)如圖3(a)所示，乳酸菌濃度在最初的12 h內(nèi)迅速?gòu)?.08 lg CFU·mL-1增加到8.30 lg CFU·mL-1。在24 h時(shí)達(dá)到最高濃度，大約為8.69 lg CFU mL-1。繼續(xù)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，細(xì)菌濃度趨于穩(wěn)定。這與已知報(bào)告結(jié)論一致[8]。SOD活性變化趨勢(shì)與菌濃度基本相同，在發(fā)酵的第24 h達(dá)到最大值315.88 U/g，隨后稍微下降，最終SOD活性為308.46 U/g。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中得出菌濃度的初始值和最大值分別為6.08和8.69 lg CFU·mL-1；SOD活性的初始值和最大值分別為85.15和315.88 U/g。表5總結(jié)了動(dòng)力學(xué)參數(shù)和模型方程，模型的R2分別為0.9970和0.9913。菌體生長(zhǎng)和SOD生成動(dòng)力學(xué)擬合曲線(xiàn)和驗(yàn)證值如圖3(b)所示，動(dòng)力學(xué)模型的預(yù)測(cè)值曲線(xiàn)與驗(yàn)證值的吻合程度均較好，因此，在該發(fā)酵條件下，Logistic方程可以很好地描述乳酸菌生長(zhǎng)和SOD生成的動(dòng)力學(xué)。

3 結(jié)論

本研究得到最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為：發(fā)酵溫度37.0 ℃，植物乳桿菌：羅伊氏乳桿菌為2.6∶1，接種量5.0%，發(fā)酵時(shí)間30 h。在此條件下，杏汁中SOD活性為 309.60 U/g，感官評(píng)分為54.18分，與理論預(yù)測(cè)值的308.46 U/g和53.80分，相對(duì)誤差分別為0.37%和0.71%；使用Logistic方程對(duì)小白杏乳酸發(fā)酵動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，動(dòng)力學(xué)模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值的擬合度分別為0.9970、0.9913，說(shuō)明擬合效果良好，能很好地模擬小白杏乳酸發(fā)酵過(guò)程的動(dòng)力學(xué)特性。通過(guò)優(yōu)化庫(kù)車(chē)小白杏的混菌發(fā)酵工藝和發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究，可以進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，有效減少小白杏采摘后損失。

圖2 各因素交互作用的三維響應(yīng)面圖Fig.2 3D response surface of various factors for their mutual interaction

表5 小白杏乳酸發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)Table 5 Sensory evaluation criteria for apricot fermentation juice

圖3 小白杏乳酸發(fā)酵動(dòng)力學(xué)及其擬合曲線(xiàn)Fig.3 The lactic acid fermentation kinetics and its fitting curve of apricot